Name: 청소년 C57BL/6 수컷 및 암컷 마우스에 대한 사회적 패배 스트레스 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-15T14:25:00.000+00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: 학습하세요 청소년 C57BL/6 수컷 및 암컷 마우스에서 사회적 패배 스트레스 모델을 이용한 신경발달 및 행동 연구 방법을. 이 모델은 사회적 회피를 유도하고 회복탄력성과 취약성을 구분하여 청소년기 스트레스 반응 메커니즘을 이해하는 데 활용됩니다.

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이 연구는 캐나다 보건 연구소(Canadian Institutes for Health Research, CF 보조금 번호: MOP-74709; PJT 190045), 국립 약물 남용 연구소(CF 보조금 번호: R01DA037911), 캐나다 자연 과학 및 공학 연구 위원회(CF 보조금 번호: 2982226). Andrea Pantoja-Urban은 멕시코의 The National Council for Humanities, Science and Technologies/Consejo Nacional de Humanidades, Ciencias y Tecnologías(CONAHCYT) 및 FRQNT - 외국인 학생을 위한 우수 장학금 프로그램(PBEEE)의 지원을 받았습니다. 사무엘 리처(Samuel Richer)는 맥길 대학교(McGill University)의 신경과학 통합 프로그램(Integrated Program of Neuroscience)의 장학금을 받았습니다. 그림 일러스트레이션은 BioRender.com 의 템플릿을 사용하여 제작되었습니다.

실험 절차는 캐나다 동물 보호 협의회(Canadian Council of Animal Care)의 지침에 따라 수행되었으며 McGill University 및 Douglas Hospital Animal Care Committee(동물 실험 승인 번호: 2005-5084)의 승인을 받았습니다. 모든 마우스는 더글라스 정신 건강 대학 연구소(Douglas Mental Health University Institute)의 신경 표현형 센터(Neurophenotyping Centre)에서 온도 및 습도 조절(21-22 °C; 60%) 콜로니 룸과 12시간 연암주기 (8:00 h에 점등)에 수용되었습니다. 쥐는 실험 내내 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있었습니다. 마우스는 각 실험 조건에 무작위로 할당되었습니다. 실험 동물은 상업적인 출처로부터 얻어졌다( 재료 표 참조). 표 2 는 각 실험 단계에 대한 동물의 특성을 요약한 것이다. 총 489마리의 청소년 C57BL/6J 마우스(남성 259명, 여성 230명)가 20개의 실험 코호트에 걸쳐 사용되었습니다.
표 2: 각 실험 단계에 대한 동물 피험자. †이 동물이 심하게 다치지 않았다면 프라이밍에 재사용할 수 있습니다. ‡이 동물이 심하게 다치지 않은 경우 Douglas Mental Health University Institute의 §Neurophenotyping Centre 인 AcSD 중에 프라이밍에 재사용할 수 있습니다. ¶남성을 대상으로 한 실험의 경우, #여성을 대상으로 한 실험의 경우, 패배가 혼합되어 있다면 여성을 프라이밍으로 사용합니다. ††AcSD에는 사용할 수 없습니다. 약어: AcSD = 가속화된 사회적 패배 스트레스; PND = Postnatal <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66455/Table%202_RE.xlsx" target="_blank">day 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
1. 순응
참고: 이 단계는 최소 1주일 동안 지속되어야 합니다.
<ol><li>생후 4개월 이상이고 청소년 C57BL/6J 마우스의 두 배인 수컷 CD-1 은퇴 사육 마우스( 재료 표 참조)를 구입합니다(즉, 10마리의 마우스가 스트레스에 노출될 경우 20개의 CD-1 마우스를 구입). 참고: 이 정도의 CD-1 마우스를 구입하는 것이 권장되는데, 그 이유는 CD-1 마우스의 극히 일부만이 청소년 마우스에 대해 공격적인 행동을 보이기 때문입니다.</li>
	<li>CD-1 수컷 마우스가 스크리닝 및 프라이밍 전 1주일 동안 음식과 물과 함께 가정용 케이지의 새로운 시설에 적응하도록 합니다.</li>
	<li>스크리닝 및 프라이밍 세션을 위해 PND &gt;65(성인) 및 PND 25 ± 3(청소년)에서 C57BL/6을 사용합니다(표 2). 프라이밍 일당 각 연령의 C57BL/6 마우스 4마리를 획득하여(즉, 프라이밍 3일 동안 12 PND&gt;65 및 12 PND 25 ± 3) 부상 위험을 줄입니다. 이러한 동물은 스크리닝 및 프라이밍 과정에 반복적으로 고용되기 때문입니다.</li>
</ol>2. CD-1 스크리닝 및 프라이밍
참고: 이 단계의 기간은 스크리닝 3일(암컷 마우스의 경우 1일) 및 프라이밍 3-4일입니다(암컷 마우스의 경우 CD-1 마우스의 공격적인 행동에 따라 증가할 수 있음).
<ol><li>공격의 운영 정의를 사용하여 아래 설명된 대로 CD-1의 공격을 등록합니다.<ol><li>한 가지 공격은 CD-1 마우스가 C57BL/6J 마우스를 물고 C57BL/6J 마우스가 물린 것에 대한 반응으로 멀어지는 것으로 정의됩니다. 교합은 CD-1 마우스가 C57BL/6J 마우스의 신체 부위에 이빨을 대는 것으로 정의됩니다. 멀어진다는 것은 C57BL/6J 마우스가 CD-1이 맞물리기 전의 위치에서 두 뒷발을 모두 움직이는 것으로 정의됩니다.</li>
		<li>개별 공격 간에 최소 ~2초의 차이가 있는지 확인합니다. &lt;2초 간격을 두고 두 번 이상 물리면 한 번의 공격으로 간주됩니다.</li>
		<li>CD-1 쥐가 쉬지 않고 한 번 이상 연속으로 물면 (&lt;~2초 간격으로) 플라스틱 자로 동물을 부드럽게 분리하십시오. CD-1 쥐가 물고 놓지 않으면 동물을 부드럽게 분리하십시오. C57BL/6J 마우스가 구석에 끼이거나 CD-1 마우스에 끼여 물렸을 때 움직일 수 없는 경우 자로 동물을 부드럽게 분리하십시오. 이 모든 것을 하나의 공격으로 계산합니다(최대 분리).</li>
	</ol></li>
	<li>심사<ol><li>모든 동물 취급에는 니트릴 검사 장갑을 사용하고 향수나 향료의 사용을 피하십시오.</li>
		<li>CD-1 마우스 홈 케이지에서 성인 C57BL/6 수컷 마우스를 침입자(PND &gt;65)로 간주하여 스크리닝 1일 째만 수행합니다. 새로운 실험을 하기 전에 항상 CD-1 마우스를 스크리닝하십시오.</li>
		<li>성인 남성 C57BL / 6 마우스 PND &gt;65를 CD-1 남성 마우스의 홈 케이지에 3 분 동안 소개합니다. 첫 번째 공격에 대한 대기 시간을 등록하고 얼마나 많은 공격이 수행되는지 확인합니다( 보충 표 1 참조).</li>
		<li>상영 2일부터 마지막 날까지 성인 남성 C57BL/6 PND&gt;65를 1분 동안 소개하고(CD-1이 매우 공격적인 경우 30초로 제한) 청소년 C57BL/6 PND 25 ± 3으로 5분 동안 교체합니다. 참고: 성체 C57BL/6 수컷 마우스를 공격하는 모든 마우스가 청소년 C57BL/6을 공격하는 것은 아니기 때문에 청소년 마우스로 스크리닝을 수행하는 것이 중요합니다. 사실, 사춘기 마우스를 공격하는 CD-1 마우스가 항상 성인 C57BL/6 수컷을 공격하는 것은 아니다.</li>
		<li>실험이 암컷 마우스에 대한 공격성을 위한 것이라면 실험용 마우스에 남녀가 모두 포함되어 있더라도 사춘기 암컷 마우스로 스크리닝 및 프라이밍을 수행합니다.</li>
		<li>첫 번째 공격에 대한 대기 시간, 공격 횟수 및 모든 C57BL/6 마우스가 받은 상처를 등록합니다( 보충 표 2 참조).</li>
		<li>모든 종류의 상호 작용을 등록합니다: 쫓기, 장착 동작, 킁킁거리기, 손질 또는 무기. CD-1이 청소년 C57BL/6 마우스에 접근하지 않는 경우 등록하십시오. 이 동작이 2일 동안 반복되면 프라이밍에 CD-1을 포함하지 마십시오.</li>
		<li>프라이밍 단계에서는 청소년 C57BL/6을 쫓기, 장착 행동, 킁킁거리기, 따라다니기, 그루밍 또는 무는 등의 행동을 보이는 모든 CD-1 마우스를 선택합니다.</li>
		<li>선택하지 않은 CD-1 마우스를 보관하고 사회적 상호 작용 테스트(SIT)에 사용합니다. 참고: 영역 행동은 시간이 지남에 따라 증가합니다. 따라서, 선택되지 않은 CD-1 마우스는 다음 실험에서 사춘기 마우스에 대해 공격적이 될 수 있다.</li>
	</ol></li>
	<li>CD-1의 공격적인 행동 준비<ol><li>프라이밍을 위해 선택한 CD-1 마우스를 프라이밍의 마지막 날까지 홈 케이지에 보관합니다.</li>
		<li>성인 남성 C57BL / 6J 마우스 PND &gt;65를 CD-1 홈 케이지에 30 초 동안 도입 한 다음 청소년 C57BL / 6 PND 25 ± 3 마우스로 5 분 동안 교체합니다.</li>
		<li>첫 번째 공격, 공격 횟수 및 모든 상호 작용에 대한 대기 시간을 등록합니다( 보충 표 3 참조).</li>
		<li>패배가 예정된 동시에 3-4 일 동안 하루에 2 번 프라이밍을 수행하십시오 (9 : 00 오전 및 2 : 00 오후). 참고: 모든 CD-1 마우스가 처음 며칠 동안 사춘기 마우스를 공격하는 것은 아니며, 특히 프라이밍이 암컷 마우스를 대상으로 하는 경우 더욱 그렇습니다. 프라이밍 일수는 CD-1 마우스가 보여주는 공격적인 행동에 따라 증가하거나 감소할 수 있습니다.</li>
		<li>프라이밍 일수를 줄이려면 이전에 수컷 마우스로 사회적 패배 실험을 거친 CD-1 마우스를 재사용하십시오. CD-1 마우스에서 공격성이 증가하지 않으면 기준에 도달할 때까지 프라이밍 기간을 연장합니다.</li>
		<li>CD-1 마우스가 극도로 공격적인 행동을 보이는 경우(C57BL/6 마우스가 과도한 상처를 보이는 경우) 사회적 패배 중 심각한 부상을 방지하기 위해 프라이밍 일수를 줄입니다.</li>
		<li>실험의 다음 단계에서는 2일 연속 10배(수컷) 또는 5배(암컷) 이상 청소년 마우스를 공격하는 CD-1 마우스를 선택합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. AcSD 프로토콜
참고: 이 단계는 3일의 습관화와 4일의 AcSD 노출로 구성됩니다.
<ol><li>습관화<ol><li>사회적 패배를 위해 쥐 우리를 설정하십시오 (그림 1A-F). 적절한 아크릴 유리 칸막이를 사용하여 쥐 우리를 2개의 구획으로 나눕니다(그림 1B, D, 재료 표 참조).</li>
		<li>케이지의 양쪽에 단단한 우드칩 침구를 추가하고 침구 재료로 한 면당 면 사각형을 추가합니다(그림 1D). 와이어 상단이 바인더 클립으로 고정되어 있는지 확인합니다(그림 1E). 쥐 케이지가 보호용 면이 없는 덮개 덮개로 덮여 있는지 확인합니다(그림 1F).</li>
		<li>케이지당 CD-1 마우스를 케이지의 한쪽에 놓습니다. 각 마우스를 쉽게 식별할 수 있도록 케이지 외부에 태그를 배치합니다.</li>
		<li>AcSD 프로토콜이 시작되기 2-3일 전에 선택된 CD-1 마우스를 사회적 패배 장치(그림 1F)에 넣는다(CD-1 영토 행동을 강화하기 위해).</li>
		<li>실험 1일 전에 프라이밍 세션을 수행합니다. 이것은 공격성을 일관되게 유지하는 데 중요합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>패배 세션<ol><li>하루 2회(1회: 오전 9시, 2회: 오후 2시) 4일간 총 8회를 진행한다. 공격자가 각 세션마다 다를 수 있도록 일정을 세웁니다( 보충 표 4 및 보충 표 5 참조).</li>
		<li>C57BL/6 청소년 마우스를 케이지의 CD-1 면에 도입하기 전에 무게를 잰다. 성인 남성 C57BL/6 마우스&gt;65를 패배 케이지의 CD-1 쪽에 30초 동안 삽입한 다음 청소년 C57BL/6 PND 24-28 마우스로 교체하여 10분 길이의 패배 에피소드 또는 세션당 최대 10번의 공격을 제공합니다.</li>
		<li>각 공격 후에는 플라스틱 자로 동물을 분리하십시오. 패배를 맛볼 때마다 부상 여부를 확인하고 통증 완화 크림으로 치료한다. 부상 횟수를 등록합니다.</li>
		<li>다음 세션까지 청소년 C57BL/6J 마우스를 낯선 공격자 옆의 빈 칸에 놓습니다. 각 세션마다 다른 공격자와 함께 절차를 반복합니다.</li>
		<li>이전 세션에서 쌍을 이루지 않은 실험 마우스와 공격자 마우스로 세션을 시작합니다. 프라이밍에 사용된 성체 C57BL/6J 수컷 마우스의 부상을 모니터링합니다( 보충 표 6 참조).</li>
	</ol></li>
	<li>동물 복지 및 인도적 종점에 대한 아래 권장 사항을 따르십시오.<ol><li>사회적 패배에 대한 해당 기관 검토 위원회의 표준 운영 절차를 따르고 지속적인 수의학적 평가를 보장합니다.</li>
		<li>동물의 고통과 죽음을 피하기 위해 연구 전반에 걸쳐 쥐의 건강을 모니터링하십시오.</li>
		<li>마우스가 다른 구획으로 건너가지 않도록 구멍이 뚫린 칸막이가 올바르게 설정되어 있는지 확인하십시오.</li>
		<li>동물에게 상처가 있을 때 적절한 모니터링을 위해 수의사 직원에게 알리고 상처가 완전히 치유될 때까지 매일 통증 완화 크림을 바르십시오.</li>
		<li>부상이 악화되면(상처 크기가 커지면) 회복을 위해 다음 세션에서 공격을 5회로 제한하십시오. 심각한 부상이 있는지 확인하십시오. 중상은 총 &gt; 1cm의 상처로 정의됩니다.</li>
		<li>초기 체중에서 15%-20% 감소한 동물을 즉시 제거하고 안락사시킵니다. 운동 활동 감소/감소 및 그루밍 장애; 1cm&gt; 상처가있는 마우스; 음경이 절단되거나 앞다리가 부풀어 오른 물린 자국이 있습니다. 참고: 1차 안락사는 이소플루란/CO2 가스실을 통해 진행되며, 이후 자궁경부 탈구에 의한 2차 안락사가 진행됩니다.</li>
	</ol></li>
	<li>대조군 마우스<ol><li>하루 2회(1회: 오전 9시, 2회: 오후 2시) 4일간 총 8회를 진행한다. 대조군 마우스가 매 세션마다 다른 C57BL/6J 동종과 케이지를 공유하도록 일정을 세웁니다( 보충 표 7 및 보충 표 8 참조). 알림: 대조군 마우스는 공격자에게 노출되지 않습니다. 패배 세션마다 새로운 CD-1 마우스에 대한 소개를 모방하기 위해 대조군 마우스는 매 세션마다 새로운 동성 및 동연령 동종(비리터메이트)과 짝을 이룹니다.</li>
		<li>사회적 패배 장치(그림 1)에 있는 대조군 마우스를 AcSD 마우스와 별도의 방에 보관합니다.</li>
		<li>케이지당 두 개의 대조군 마우스를 케이지의 양쪽에 하나씩 배치합니다. 쥐를 케이지의 다른 쪽이나 완전히 다른 케이지에 넣어 냄새를 인식하지 못하도록 합니다. 각 세션마다 컨트롤 마우스를 회전시킵니다.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66455/66455fig01.jpg"> 그림 1: 청소년 쥐의 가속된 사회적 패배 스트레스(AcSD) 장치. (A) 왼쪽에서 오른쪽으로, 막대 사이가 0.6cm 떨어져 있는 한 쌍의 강철 와이어 상판, 천공 직경 0.6cm의 투명 천공 폴리카보네이트 칸막이, 철사 상단을 고정하기 위한 바인더 클립, 덮개 뚜껑이 있는 투명 쥐 케이지(면 보호층 없음). (B) 위: 성인의 만성적인 사회적 패배에 대한 폴리카보네이트 칸막이(왼쪽)와 청소년의 AcSD(오른쪽) 비교; 아래로: 청소년 마우스를 위한 폴리카보네이트 칸막이에 닫습니다. (C) 위: 성인의 만성적 사회적 패배에 대한 철사 상의(왼쪽)와 청소년의 AcSD(오른쪽) 비교; 아래: 강철 와이어 상단의 클로즈업. (D-F) 사회적 패배 장치의 조립. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66455/66455fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
4. 사회적 상호작용 테스트
<ol><li>앞에서 설명한 대로 AcSD 57,58,59에 따라 SIT를 수행합니다.<ol><li>AcSD의 마지막 세션 후 24시간 동안 SIT를 수행합니다. 오전 9시에서 오후 4시 사이의 빨간색 표시등 조건(노란색 표시등 조건이 아님)에서 SIT를 수행합니다.</li>
		<li>메인 광장과 오버헤드 비디오 카메라를 설정합니다( 자료 표 참조). 메인 경기장은 3 개의 영역으로 나뉩니다 : 사회적 상호 작용 구역 (SIZ), 코너 및 중앙; 이 지역은 경기장에서 검은색 선으로 표시해야 합니다(검은색 영구 마커 사용). 각 영역에 대해 다음 차원과 기준을 사용합니다.<ol><li>SIZ가 인클로저를 둘러싸고 있는 14cm x 9cm의 제곱 영역인지 확인합니다. 모서리는 인클로저 반대쪽 벽 모서리에 있는 작은 정사각형 영역(9cm x 9cm)이며 SIZ에서 가장 먼 지점을 나타냅니다. 중심은 SIZ와 모서리 사이의 영역입니다.</li>
		</ol></li>
		<li>세척 수소 과산화효소 용액으로 경기장과 인클로저를 청소하십시오.</li>
		<li>분석을 위해 각 동물에 대한 식별 태그를 바닥에 놓습니다. 오프라인 분석을 위해 모든 동물의 행동을 기록합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>기준선 탐색을 결정하기 위한 첫 번째 세션<ol><li>경기장의 벽 중 하나에 빈 철망 인클로저를 놓습니다. 실험용(패배 또는 대조군) 청소년기 C57BL/6 마우스를 경기장 중앙에 놓습니다. 2.5분 동안 투기장을 자유롭게 탐험할 수 있게 하세요. 마우스를 검색합니다.</li>
		<li>세척 수소 과산화효소 용액으로 경기장과 인클로저를 청소하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>사회적 상호작용을 위한 두 번째 세션<ol><li>익숙하지 않은 CD-1 마우스를 철망 인클로저 내부에 넣습니다. 이전 세션과 동일한 위치에 격납장치를 배치합니다.</li>
		<li>같은 청소년용 C57BL/6 마우스를 경기장에 다시 도입합니다. 2.5분 동안 투기장을 자유롭게 탐험할 수 있게 하세요. 마우스를 회수합니다.</li>
		<li>세척 수소 과산화효소 용액으로 경기장과 인클로저를 청소하십시오.</li>
		<li>모든 청소년 C57BL/6 마우스(스트레스 및 대조 마우스)에 대해 균형 잡힌 순서로 이 과정을 반복합니다.</li>
		<li>핸들링 스트레스와 바이어스를 줄이기 위해 SIT에 두 개 이상의 CD-1 마우스를 사용합니다(예: 30개의 C57BL/6개의 마우스로 구성된 코호트의 경우 4개의 CD-1 마우스 사용). 사춘기 쥐들 사이에서 균형을 잡으십시오. 참고: 이 테스트는 Krishnan5 및 Golden7에 의해 처음 설명된 바와 같이 사회적 목표에 대한 실험용 마우스의 접근 및/또는 회피 행동을 측정합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>분석<ol><li>테스트의 두 세션 동안 상호 작용 영역과 모서리에서 보낸 시간을 기록합니다.</li>
		<li>CD-1 공격자가 있는 상호 작용 영역에서 보낸 시간을 CD-1 공격자가 없는 상호 작용 영역에서 보낸 시간으로 나눈 값으로 사회적 상호 작용 비율을 계산합니다.</li>
		<li>스트레스를 받은 마우스를 1.00 &lt; 감수성으로, 1.00 ≥ 비율로 탄력적인 마우스로 분류합니다.</li>
		<li>첫 번째 세션 동안 경기장을 탐험하지 않는 동물(즉, 지정된 지역에서 0초를 보낸 동물)을 모든 분석에서 제외하여 운동 활동의 차이를 제어합니다.</li>
		<li>≥4 사회적 패배 세션에서 0번의 공격을 받은 모든 동물을 모든 분석에서 제외하여 대표성이 없는 회복력 있는 동물을 방지합니다.</li>
		<li>높은 사회적 상호 작용 비율이 사회적 대상에 대한 실제 관심을 반영하도록 상호 작용 영역 내에서 최소 61초를 보내지 않는 마우스(취약하지 않음)를 제외합니다.</li>
		<li>이상치 상호 작용 비율 점수가 있는 마우스를 제외합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

행동 연구를 위한 C57BL/6 마우스의 청소년 사회적 스트레스 패러다임

저자는 밝힐 것이 없습니다.

CD-1 마우스에서 일관되고 공격적인 행동 스크리닝 단계에서는 CD-1이 나타내는 모든 행동(쫓기, 장착 동작, 킁킁거리기, 손질하기 또는 무는 행동)을 기록하고 AcSD용 CD-1 마우스를 선택할 때 이러한 기록을 면밀히 따르는 것이 매우 중요합니다. CD-1 마우스가 청소년 마우스를 공격하지 않고 상호 작용하면 프라이밍 중에 청소년 마우스에 대한 공격성이 발생할 가능성이 있습니다. 대조적으로, 성체 쥐를 공격하지만 청소년 쥐에게 접근하지 않는 CD-1 쥐는 아마도 청소년 쥐에 대한 공격성을 발달시키지 않을 것입니다.
CD-1 프라이밍 단계는 청소년 마우스에 대한 공격적인 행동을 발달시킬 수 있습니다. 따라서 동작의 정확한 등록을 갖는 것이 마우스 선택에 중요합니다. 더욱이, CD-1 마우스가 이전에 패배를 겪은 경우에도 새로운 실험을 하기 전에 항상 CD-1 마우스를 스크리닝하는 것이 중요합니다. 일부 CD-1 마우스는 일정 기간 동안 집 케이지에 방해받지 않고 방치되면 청소년 마우스에 대한 공격을 멈출 수 있고, 다른 마우스는 격리되어 있기 때문에 영역 행동이 증가할 수 있습니다.
CD-1 마우스의 프라이밍을 위해 프로토콜은 3일을 권장합니다. 순진한 CD-1 마우스를 사용하는 경우, CD-1 마우스가 청소년 마우스를 적극적으로 공격하지 않으면 프라이밍이 연장될 수 있습니다. 사춘기 마우스와 사회적 패배를 겪은 CD-1 마우스의 경우, 이 프라이밍 단계의 지속 시간을 줄일 수 있습니다.
스크리닝 및 프라이밍 단계는 성공적인 AcSD 세션을 위해 매우 중요합니다. 예를 들어, 적절하게 프라이밍된 CD-1 마우스는 덜 공격적인 CD-1 마우스보다 더 빠르게 공격하고 10 공격 제한에 도달하므로 짧은 패배 에피소드가 가능합니다.
AcSD 중에는 공격이 매우 격렬할 때 동물을 분리하는 것이 중요합니다(즉, CD-1 마우스가 C57BL/6J 마우스를 놓지 않음). 그렇지 않으면 사춘기 쥐가 다치고 공격을 제한해야 합니다. 감염을 피하기 위해 부상을 치료하는 것도 매우 중요합니다. 동물이 연고를 핥아 버리고 그 과정에서 머리카락이 빠지고 부상이 노출되기 때문에 부상을 치료하기 위해 기름진 연고를 사용하지 않는 것이 좋습니다.
청소년 C57BL/6 수컷 및 암컷 마우스에 사용할 AcSD 문제 해결 만성 사회적 패배 스트레스 모델은 남성과 여성 C57BL/6 마우스 모두에서 초기 청소년기에 사용하는 데 중요한 한계를 제시했습니다. 이 섹션에서는 청소년기의 AcSD 모델 개발을 위해 만들어진 수정 사항에 대해 설명합니다.
장비: 전체 장비 목록은 재료 목차에 나열되어 있습니다. 초기 청소년기(PND 21-30)의 C57BL/6 청소년 마우스는 실험실(60)에서 이전에 사용된 설명된 장비에 비해 너무 작았다. 아크릴 유리 칸막이의 천공 직경은 C57BL/6 마우스가 한 구획에서 공격자가 있는 다른 구획으로 교차할 수 있을 만큼 충분히 큽니다. 이를 방지하기 위해 작은 직경의 구멍이 있는 아크릴 유리 칸막이가 만들어졌습니다. 또한 쥐가 케이지에서 탈출하는 것을 방지하기 위해 강철 와이어 상단을 클립으로 고정해야 했습니다. 사용되는 덮개 덮개는 일반적으로 환기 케이지에 사용됩니다. 이 경우, 이러한 커버 뚜껑은 적절한 환기를 허용하고 쥐가 케이지에서 탈출하는 것을 방지하기 위해 보호용 솜 없이 사용되었습니다. 사용되는 우드칩 침구의 양은 청소년 쥐가 덮개 뚜껑에 놓인 음식과 정수기에 닿을 수 있어야 한다는 점을 고려하는 것이 중요합니다. 그러나 많은 양의 우드칩이 젖을 수 있습니다.
CD-1 마우스의 선택: 만성 모델에서, CD-1 마우스는 실험이 시작되기 전에 공격적인 행동에 대해 스크리닝됩니다. CD-1 마우스는 스크리닝 3일 후에 선택되고 공격적인 행동을 평가합니다. 스크리닝 후, 30초 미만의 공격 대기 시간이 있고 일관된 공격을 보이는 동물이 다음 단계로 선택됩니다. 그러나 만성적인 사회적 패배 실험에서 CD-1 마우스는 10일 동안 일관된 공격 횟수를 유지하지 못했습니다(그림 2B). 따라서 침입자 마우스에 대한 공격성이 부족하여 여러 CD-1 마우스를 실험에서 제거해야 했습니다. 실제로, CD-1 마우스의 극히 일부만이 침입자 마우스를 공격한 반면, 이들 마우스들 중 일부는 극도로 공격적이었고 때때로 수컷 C57BL/6 PND 21 마우스에게 심각한 부상을 입혔다. 따라서, CD-1 마우스의 스크리닝은 사춘기 마우스에 대해 공격적인 마우스를 선택하는 것으로 변경되어, 신체적 공격성을 고조시켰다.
신체적 공격의 일관성 : 지속적인 신체적 공격은 침입자를 빠르고 강력하게 패배시키는 결과를 낳는다6. 실험자와 실험자 간의 절차를 표준화하기 위해, 공격에 대한 운영적 정의(operational definition of attack)57가 사용되어, 공격성을 정확하게 정량적으로 측정할 수 있었다.
프라이밍 공격성: 만성적인 사회적 패배 실험 동안, 공격 횟수는 크게 변했으며, 실험의 마지막 날에는 감소했다(그림 2B). 사춘기 C57BL/6 수컷 마우스에 대한 CD-1 마우스의 공격적인 행동을 증가시키기 위해, CD-1 마우스는 그들의 홈 케이지에 도입된 마우스에 관계없이 적극적으로 공격적이 되도록 준비되었습니다. 이 행동은 청소년 마우스보다 1분 전에 성인 C57BL/6 수컷 마우스를 도입하여 성인 마우스를 회수한 후 CD-1 마우스가 청소년 마우스를 공격하도록 장려함으로써 달성되었습니다.
모델 기간: PND 21에서 청소년 C57BL/6 마우스는 매우 작으며 CD-1 마우스는 단 한 번의 공격으로 심각한 부상을 입힐 수 있습니다. 따라서 초기 청소년기를 대상으로 하고 여전히 사회적 패배를 반복하기 위해 고전적인 10일 만성 사회적 패배 스트레스에 대한 대안 모델을 선택했습니다. 가속된 사회적 패배 스트레스(AcSD)42 는 하루에 두 번의 신체적 공격성, 즉 오전에 한 번, 오후에 한 번, 총 4일(8회)에 걸쳐 이루어진다. AcSD 모델은 사춘기 마우스의 연령을 PND 21에서 PND 25로 증가시킬 수 있었으며, 여전히 초기 청소년기만 대상으로 합니다.
청소년기 AcSD의 한계 AcSD 모델에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 성인의 만성 사회적 패배 모델과 비교했을 때, AcSD는 청소년 C57BL/6 마우스의 CD-1 마우스의 두 배에 달하는 스크리닝을 필요로 한다. 프라이밍 단계의 지속 시간은 CD-1 마우스의 공격적인 행동에 따라 달라질 수 있습니다. 따라서 AcSD 일정은 예상을 가지고 계획해야 하며 이러한 모든 변수를 고려해야 합니다. 대부분의 청소년 마우스는 AcSD 노출 후 사회적 회피에 대한 회복력을 보이기 때문에 감수성이 예민한 마우스의 대표 수를 얻기 위해 실험 코호트는 수컷의 경우 최소 20마리, 암컷의 경우 30마리로 구성되어야 합니다.
청소년 마우스의 AcSD는 실험 코호트에서 일관된 결과를 산출합니다. 만성적인 사회적 패배와 AcSD 프로토콜로 사회적 스트레스에 노출된 후, 대부분의 청소년 수컷 마우스는 사회적 회피에 대한 회복력을 보였다. 그러나 만성적인 사회적 패배 모형의 경우, CD-1에 의한 공격 횟수의 변동성을 교란 변수로 무시할 수 없었다. 반면, AcSD 실험의 경우, CD-1 마우스는 세션 전반에 걸쳐 일관된 수의 공격을 얻기 위해 모든 패배 세션 전에 프라이밍됩니다(그림 2D,E). 전반적으로, AcSD에 노출된 모든 실험적 마우스 코호트는 세션 전반에 걸쳐 유사한 수의 공격을 보여줍니다(그림 2D). 그러나 이것은 만성적인 사회적 패배 모델에 노출된 쥐 코호트의 경우는 그렇지 않다(그림 2B).
성인 C57BL/6 암컷 마우스에서 만성 사회적 패배 스트레스를 사용하는 것은 다른 종과 균주 9,13,45,61에서 이 모델을 사용하는 다른 마우스에 비해 도전적이었습니다. 청소년 C57BL/6 암컷 마우스를 대상으로 한 AcSD 실험의 경우, 프라이밍 단계를 연장하여 CD-1 마우스의 공격적인 행동을 보장했습니다(그림 4A). 그러나 여성 실험 코호트에서 공격 횟수에서 변동성을 관찰할 수 있습니다(그림 4B). 그럼에도 불구하고, 이 실험에서 모든 CD-1 마우스는 암컷에 대해 공격적인 행동을 보였다. 공격 횟수를 늘리기 위해 수컷 마우스로 프라이밍을 1분으로 연장할 수 있습니다. 수컷에서와 마찬가지로, 사회적 회피에 대해 회복력이 있는 청소년 C57BL/6 암컷 마우스의 비율은 감수성을 보이는 마우스보다 높았다(그림 4C,D). 또한, 공격 횟수는 탄력적인 마우스와 감수성이 있는 마우스 간에 차이가 없었으며(그림 4E), 이는 표현형이 공격과 독립적임을 나타냅니다. AcSD는 청소년 C57BL/6 암컷 마우스에 사용할 수 있으며 동일한 CD-1 마우스를 사용하여 남녀 모두에서 동시에 실험을 수행할 수 있습니다.

만성 사회적 패배 스트레스 패러다임은 성인 출생 후 일(PND) >65 남성 설치류의 사회적 스트레스를 모델링하는 데 널리 사용됩니다. 이 패러다임은 침입자가 자신의 영역을 침범했을 때 성인 남성 설치류의 자연스러운 공격적인 행동을 기반으로합니다. 이 모델은 쥐, 햄스터 및 생쥐 1,2,3,4,5,6,7,8,9를 포함한 다양한 설치류 종에 사용되며, 약 10 일 동안 지속되는 신체적 공격성과 심리적 스트레스의 조합으로 구성되며, 그 동안 침입자 설치류는 거주 설치류로부터 몇 분의 신체적 공격성을 실험합니다. 두 마리의 설치류는 거주자의 집 우리에 남아 있으며, 감각은 가능하지만 신체 접촉은 허용하지 않는 칸막이로 분리되어 있습니다7. 생쥐 실험에서, 가장 일반적으로 사용되는 거주/침략자 생쥐는 은퇴한 사육자 스위스 CD-1 생쥐로, 침입자 생쥐 6,7에 대한 강력한 영토 행동을 보여준다. 침입자 마우스의 경우 가장 특징적인 균주는 근친 교배 C57BL/6 균주 2,4,5입니다. 패배한 쥐는 침략자에 대한 습관화를 방지하기 위해 매일 새로운 공격자에게 노출됩니다. 대조군 마우스는 매일 다른 동종과 함께 수용됩니다. 마지막 패배 세션 후 24시간이 지나면 실험용 마우스는 새로운 CD-1 마우스(대상)가 없거나 존재할 때 열린 필드를 탐색할 수 있는 사회적 상호 작용 테스트(SIT)에서 테스트됩니다. 대조군 마우스는 과제의 비표적 부분에 비해 표적과의 상호작용 영역에서 더 많은 시간을 보냅니다. 패배한 쥐는 사회적 상호작용 비율(공격자가 있는 상호작용 영역에서 보낸 시간/공격자가 없는 상호작용 영역에서 보낸 시간)에 따라 감수성(비율<1) 또는 회복력(비율>1)으로 분류됩니다. 이 절차는 스트레스에 대한 반응의 개인차를 연구하는 데 유용한 도구를 제공합니다.
최근 몇 년 전까지, 만성 사회적 패배 스트레스 모델은 주로 성인 수컷 마우스에서 사용되었는데, 이는 강조된 남성 지배 계층이 수컷과의 싸움을 포함하지만 암컷과는 싸우지 않기 때문이다 6,7. 또한, 수컷 설치류는 일반적으로 암컷을 공격하지 않습니다. 대신, 그들은 짝짓기 행동에 참여한다10. 이러한 장애물에도 불구하고, 성인 암컷 쥐에 대한 만성 사회적 패배 스트레스 패러다임을 적응시키기 위해 다양한 전략이 개발되었습니다. 예를 들어, 사회적 패배에 대한 캘리포니아 쥐 모델은 자신의 영토를 방어 할 때이 일부일처제 종의 남녀 모두의 자연스러운 공격성을 기반으로합니다 9,11. 다른 접근법은 CD-1 마우스의 복내측 시상하부를 자극하여 일관된 공격적 행동을 갖도록 유도하거나10,12 또는 실험용 성인 암컷 마우스에 수컷 소변을 적용하여 CD-1 공격자로부터 공격을 받도록 하는 데 초점을 맞춘다13. CD-1 마우스의 이러한 고조되고 일관된 공격성은 실험적 침입자 마우스가 상호작용 기간 동안 공격자에 의한 반복적인 공격에 대한 종속의 명확한 행동 징후를 보이는 데 중요하다6.
만성 사회적 패배 모델을 청소년 C57BL/6 마우스에 적용하기 위해 청소년기는 상당한 심리 사회적 성숙으로 특징지어지는 기간으로, 뇌의 미시적 및 거시적 구조, 특히 전전두엽 피질의 변화와 병행하여 전개됩니다. 인간과 설치류 모두에서, 사춘기의 구체적인 시작과 끝에 대한 합의는 거의 없다14,15. 더욱이, 청소년기에는 지속적인 뇌 및 인지 발달의 경험에 의한 혼란에 대한 중요한 취약성의 창이 있다 16,17,18,19. 사춘기와 청소년기는 동시에 발생하지만 이러한 용어는 동의어가 아닙니다. 사춘기는 성적 성숙의 시작을 의미하는 반면, 청소년기는 청소년 상태에서 독립을 달성하는 단계로의 점진적인 변화를 특징으로 하는 더 넓은 단계를 나타냅니다20. 다른 그룹은 쥐의 청소년기가 이유기(PND 21)부터 성체(PND 60)까지라고 제안했습니다(PND 60)21. 특히, 초기 청소년기는 이유식 후 첫 번째 및 두 번째 주(PND 21-34)라고 할 수 있으며 청소년기 중반은 PND 35-48 기간이라고 할 수 있습니다. 이 범위는 예를 들어 도파민 시스템의 발달 (22,23,24), 신경 네트워크(17,25,26,27)에 대한 약물 효과에 대한 취약성 및 뚜렷한 행동 특성 (16,20,28,29,30)과 관련된 불연속적인 발달 기간을 포함합니다 을 클릭합니다.
거주 쥐의 싸움 행동은 사회적 패배 프로토콜에 필요합니다. 그러나 암컷 마우스와 마찬가지로 수컷은 일반적으로 초기 사춘기 마우스와 공격적인 상호 작용에 참여하지 않는데, 이는 아마도 위협으로 인식하지 않기 때문일 수 있습니다. 청소년 C57BL/6 마우스에서 만성적인 사회적 패배의 영향을 조사하는 대부분의 연구는 청소년 중반기에 수행되었다 31,32,33,34,35; 다른 사람들은 청소년기에 노출된 출생 후일을 명시하지 않거나36,37 패배의 날을 초기 성인기38로 연장하거나 감각 접촉을 허용하지 않는다39. 청소년 쥐에 대한 다른 연구는 다른 균주를 사용합니다40,41. 청소년 수컷 마우스에서 만성적인 사회적 패배 스트레스를 이용한 이러한 연구의 특징은 표 1에 요약되어 있다.
우리 연구 그룹은 C57BL/6 마우스에서 초기 청소년기를 포함한 특정 청소년 노출 창을 표적으로 삼는 데 관심이 있습니다. 다양한 청소년 시기의 기간이 짧기 때문에, 만성적인 사회적 패배 스트레스 패러다임의 가속화된 버전의 수정된 버전이 고안되었다42. 이 모델은 청소년 마우스에 대한 가속 사회적 패배 스트레스(AcSD)라고 불렸습니다. 이전 연구는 쥐 8,26,43,44,45에서 청소년기의 사회적 스트레스에 대한 민감도에 상당한 성별 차이가 있음을 보여주며, 인간의 정신 건강 궤적에 대한 사회적 스트레스의 해로운 영향에도 유의한 성별 차이가 있음을 보여줍니다 46,47,48,49,50,51,52, 53,54,55,56입니다. AcSD 모델은 사춘기 암컷 쥐에게도 효과적으로 작용하여 잠재적인 성별 특이적 결과를 조사하고 신경생물학적 기초를 탐구할 수 있습니다.
표 1: 청소년 수컷 마우스에서 사회적 패배 스트레스 패러다임을 사용한 연구. 균주 및 종 : 캘리포니아 쥐 : Peromyscus californicus. C57BL / 6 : Mus musculus black 6 근친 마우스 변형. C57BL/6J: Jackson's laboratories에서 제공한 M. musculus black 6 근친 마우스 모델. CD-1 : 스위스 근친 알비노 마우스 계통의 M. musculus . ICR: M. musculus Institute of Cancer Research 근친교배 알비노 마우스 균주. OF1 : M. musculus Oncins France 1 근친 알비노 마우스 변형. 약어: wk = week; PND = 산후일; res = 탄력적; SUS = 민감성; unsus = 민감하지 않음. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66455/Table%201_RE.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>C57BL/6 청소년 마우스&nbsp;</td><td>사내 사육</td><td></td><td>마우스는 Douglas Mental Health University Institute의 신경 표현형 분석 센터에서 사육되었습니다.</td></tr><tr><td>C57BL/성인 마우스 6마리&nbsp;</td><td>Charles River Laboratories</td><td>스트레인 코드: 027</td><td>마우스는 PND>65에 도달하도록 주문되며 표준 마우스 케이지에 그룹 수용(케이지당 4개의 마우스)됩니다.</td></tr><tr><td>C57BL/6J 청소년 마우스&nbsp;</td><td>Jackson Labs</td><td>스트레인 코드: 000664; RRID:IMSR_JAX:000664</td><td>마우스는 PND 24에 도착하도록 주문되며 표준 마우스 케이지에 그룹 수용(케이지당 4개의 마우스)됩니다.</td></tr><tr><td>CD-1 마우스&nbsp;</td><td>Charles River Laboratories</td><td>스트레인 코드 : 022</td><td>생쥐는 3 개월 이상 된 사육자를 은퇴하고 전체적으로 독신으로 사육했습니다.</td></tr><tr><td>세척액&nbsp;</td><td>Virox Animal Health</td><td>DIN 02537222</td><td>우선: 가속 과산화수소. 소독제 클리너 및 탈취제.</td></tr><tr><td>투명 퍼포레이티드 아크릴 유리 분배자&nbsp;</td><td>더글러스 병원에서 제조, 맞춤 주문</td><td></td><td>0.6 cm (w) &times; 45.7 cm (d) &times; 22.23 cm (h); 0.6 cm 직경의 천공. 칸막이에는 구멍이 뚫려 있어 한 쌍의 생쥐 사이에 감각적이지만 물리적 접촉은 없습니다.</td></tr><tr><td>투명한 직사각형 쥐 케이지&nbsp;</td><td>앨런 타운</td><td></td><td>24cm (w) &times; 48.3 cm (d) &times; 22.23 (h).</td></tr><tr><td>침구 용 코튼 스퀘어</td><td>Inotiv Envigo</td><td>T.6060 iso-BLOX</td><td>2.5 cm x 2.5 cm. 사회적 패배 장치에 추가되었습니다.</td></tr><tr><td>단단한 나무 조각 침구</td><td>Inotiv Envigo</td><td>Teklad 7090, 7115</td><td>Sani 칩 침구.</td></tr><tr><td>강철 와이어 상판을 고정하기 위한 대형 바인더 클립</td><td>STAPLES</td><td>품목 #: 132429, 모델 #: 24178-CA</td><td>51mm</td></tr><tr><td>강철 와이어 상판을 고정하기 위한 중간 바인더 클립</td><td>품목 #: 132367, 모델 #: 24172-CA</td><td>32mm, 쥐 케이지의 덮개 뚜껑이 큰 클립으로 닫히지 않는 경우</td>통증 완화 크림 Polysporin Plus 통증 완화 크림(빨간색 형식,<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 연고가 아님), 2 항생제와 리도카인 염산염</td></tr><tr><td>쌍을 이룬 스틸-와이어 상판&nbsp;</td><td></td><td></td><td>24 cm (w) &times; 그릴 사이에 0.6 cm (w) 간격이 있는 48 cm (d)</td></tr><tr><td>탈착식 와이어 메쉬 인클로저&nbsp;</td><td>존스턴 산업용 플라스틱</td><td></td><td>11 cm (w) &times; 6.8 cm (d) &times; 42 cm (h) 맞춤 주문; 사전 절단된 투명 폴리카보네이트에 고정된 사회적 상호작용 테스트 경기장당 두 개</td></tr><tr><td>사회적 상호작용 오픈 필드 경기장</td><td>PEXIGLAS</td><td></td><td>45 cm (w) &times; 45 cm (d) &times; 49 cm (h), 불투명한 아크릴 유리 (Plexiglas)로 맞춤 제작&nbsp;</td></tr><tr><td>스톱워치&nbsp;</td><td></td><td></td><td>타이밍 패배 세션용</td></tr><tr><td>적외선이 있는 비디오 카메라&nbsp;</td><td>스완</td><td>SRDVR-44580V&nbsp;</td><td>Swann 카메라 - 4채널 1080p 디지털 비디오 레코더 및 2 x PRO-T853</td></tr><tr><td>비디오 추적 소프트웨어&nbsp;</td><td>Topscan</td><td></td><td>2.0 영리한 체계 Inc.</td></tr></tbody></table>

청소년 c57bl/6 수컷 및 암컷 마우스에 대한 사회적 패배 스트레스 모델

Social Defeat Stress Model for Adolescent C57BL&#47;6 Male and Female Mice

청소년기의 사회적 역경은 널리 퍼져 있으며 정신 건강 궤적에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 청소년 남성과 여성 설치류의 사회적 스트레스를 모델링하는 것은 지속적인 뇌 발달 및 행동 결과에 미치는 영향을 이해하는 데 필요합니다. 만성 사회적 패배 스트레스 패러다임(CSDS)은 자신의 영역을 침범하는 침입자에 대해 성인 남성 설치류가 보여주는 공격적인 행동을 활용하여 성인 C57BL/6 수컷 마우스의 사회적 스트레스를 모델링하는 데 널리 사용되었습니다. 이 패러다임의 장점은 패배한 쥐를 마지막 패배 세션 후 24시간 후 사회적 행동의 개인차에 따라 탄력적이고 감수성이 있는 그룹으로 분류할 수 있다는 것입니다. 청소년 C57BL/6 마우스에서 이 모델을 구현하는 것은 성인 또는 청소년 마우스가 일반적으로 초기 청소년 남성 또는 여성 마우스를 공격하지 않고 청소년기는 짧은 수명이며 신중한 시간적 취약성 창을 포함하기 때문에 어려웠습니다. 이러한 한계는 CSDS의 가속 버전을 사춘기 수컷 및 암컷 마우스에 사용하도록 조정함으로써 극복되었습니다. 하루에 2번의 신체적 공격 세션으로 구성된 이 4일 스트레스 패러다임은 C57BL/6 남성 성인을 사용하여 CD-1 마우스의 공격성을 프라이밍하여 남성 또는 여성 청소년 마우스를 쉽게 공격합니다. 이 모델은 청소년 마우스에 대한 가속 사회적 패배 스트레스(AcSD)라고 불렸습니다. AcSD에 대한 청소년 노출은 남성과 여성 모두에서 24시간 후에 사회적 회피를 유발하지만, 패배한 쥐의 하위 집합에서만 유발됩니다. 이 취약성은 복구 가능한 그룹과 취약한 그룹 간의 세션 간에 일관된 공격 수에도 불구하고 발생합니다. AcSD 모델은 청소년기 내의 불연속적인 기간 동안 노출을 허용할 만큼 충분히 짧고, 사회적 회피 행동의 유무에 따라 마우스를 분리할 수 있으며, 청소년 C57BL/6 암컷 마우스의 사회적 패배 스트레스를 연구할 수 있는 최초의 모델입니다.

청소년 C57BL/6 수컷 마우스(PND 21)에서 만성 사회적 패배 스트레스 모델을 사용하여 총 4가지 다른 실험을 수행했습니다. 그러나, 이 모델은 초기 사춘기 C57BL/6 마우스에서의 사용에 대한 중요한 제한사항을 제시하였다.
청소년 C57BL/6 마우스에 대한 장비 수정이 필요한 경우 첫 번째 한계는 사회적 패배 장치에 사용 된 장비가 성인 쥐 용으로 설계되었다는 것입니다. 그들의 크기 때문에, PND 21에서 청소년 C57BL/6 마우스는 칸막이의 천공을 통해 공격자 측으로 통과할 수 있었다. 이것은 감각 접촉의 기간을 중단시켰다. 또한, 사춘기 쥐는 철사 상판의 창살을 통해 탈출할 수 있었습니다. 따라서 쥐의 탈출을 방지하기 위해 장비를 수정했습니다(그림 1). 천공의 직경은 1.1cm에서 0.6cm로 변경되었으며(그림 1B), 철강선 상단은 막대 간 간격이 1.1cm였던 것에서 0.6cm 간격으로 교체되었습니다(그림 1C). 또한 상단은 클립으로 고정했으며 쥐 우리도 보호면이 없는 플라스틱 덮개로 덮여 있었습니다. 우드칩 침구는 또한 사춘기 마우스에게 적합한 수준으로 설정되었습니다(그림 1D-F).
AcSD 모델은 일관되고 공격적인 시합을 보장하기 위해 성인 남성 CD-1 마우스의 프라이밍이 필요합니다. 두 번째이자 더 중요한 한계는 CD-1 마우스의 청소년 마우스에 대한 신체적 공격성의 일관성이 부족하다는 것이었다. 만성적인 사회적 패배 세션 동안, 공격성은 10분 세션 동안 공격적인 공격이 전혀 없는 것부터 사춘기 쥐의 작은 크기로 인해 치명적이었던 한두 번의 물기까지 다양했습니다. 그러나 CD-1 마우스를 두 개 이상의 실험에 사용하면 공격 횟수의 일관성이 증가합니다.
그림 2B 는 각 만성 사회적 패배 실험 코호트(P0, A0, A1 및 A2)에 대한 일별 공격 횟수를 보여줍니다. 일과 코호트 간의 교호작용이 확인되었습니다(그림 2B, 양방향 반복 측정 ANOVA: F(27, 234) = 3.83, p &lt; 0.0001), 일의 주효과(F(6.288, 163.5) = 6.2, p &lt; 0.0001), 코호트의 주효과(F(3, 26) = 3.8, p = 0.02). 사후 검사에서 1일, 2일, 3일, 7일차에 코호트 간의 차이가 나타났습니다(Holm-Sidak 사후 검사: 1일차, P0 대 A2, p = 0.02; A1 대 A2, p = 0.02; 2일차, A1 대 A2, p = 0.04; 일, 3 A0 대 A1, p = 0.007; A1 대 A2, p = 0.04; 7일째, A0 대 A1, p = 0.04). 실험 P0 및 A0에서 모든 CD-1 마우스는 지난 3일 동안 공격을 멈췄습니다. 실험에 사용된 CD-1 마우스는 P0 및 A0가 A1에 사용되었는데, 이 경우 공격에 일관성이 있었으며(그림 2B), 이는 CD-1이 이전에 신체적 상호 작용을 받았을 경우 공격성에 더 취약하다는 것을 나타냅니다.
이러한 이유로, 단계 2.1 및 2.2에서 기술된 바와 같이, CD-1 마우스는 청소년 마우스에 대한 그들의 공격성에 대해 특이적으로 스크리닝하고, 청소년 C57BL/6 마우스에 대한 공격성을 위해 성인 C57BL/6 수컷으로 프라이밍하였다. 또한, AcSD는 PND 21세에서 PND 25세로 연령을 늘리고 여전히 초기 청소년기를 대상으로 하는 데 사용되었습니다.
AcSD 세션 동안, CD-1 마우스는 그림 2D와 같이 보다 일관된 패턴으로 청소년 마우스에 대한 공격 횟수를 증가시켰다. 만성적인 사회적 패배 패러다임과 대조적으로, 세션과 실험 코호트 사이에는 유의한 상호작용이 발견되지 않았으며(그림 2D, 양방향 반복 측정 ANOVA: F(35, 483) = 1.33, p =0.1), 세션의 주효과(F(5.644, 389.5) = 14.15, p &lt; 0.0001) 및 코호트의 주효과(F(5, 69) =7.91, p &lt; 0.0001)이 있었다. Holm-Sidak 사후 검사에서는 코호트 간에 유의한 차이가 나타나지 않았습니다. 코호트 간의 공격 평균을 비교한 결과, 이 효과는 주로 공격 횟수가 훨씬 더 많은 코호트 A7에 의해 주도되는 것으로 나타났습니다(데이터 미표시, 일원 분산 분석 F(5, 69) = 7.911, p &lt; 0.0001; Holm-Sidak 사후 검정: A3 대 A6, p = 0.04; A7 대 A5, p = 0.002; A7 대 A6, p &lt; 0.0001; A7 대 A8, p = 0.0001).
사춘기 마우스는 만성 사회적 패배 프로토콜(그림 2E, 웰치의 보정을 이용한 쌍을 이루지 않은 t-테스트, t = 15.40, df = 17.87, p &lt; 0.0001)에 노출된 청소년 마우스보다 AcSD 동안 프라이밍된 CD-1 마우스로 더 많은 공격을 받았습니다. 공격은 만성적인 사회적 패배 프로토콜 동안 일관되지 않았으며, 실제로 몇몇 실험용 쥐는 전혀 공격을 받지 않았습니다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66455/66455fig02.jpg"> 그림 2: 만성적인 사회적 패배 스트레스와 AcSD 사이의 일일 공격 횟수 비교. (A) 만성 사회적 패배 스트레스 모델의 타임라인. (B) 청소년 C57BL/6 수컷 마우스의 만성 사회적 패배 스트레스 동안 각 실험 코호트(P0, P1, A1 및 A2)에 대한 일일 공격 횟수(양방향 반복 측정 ANOVA). (C) 가속된 사회적 패배 스트레스(AcSD) 모델의 타임라인. (D) 청소년 C57BL/6 수컷 마우스의 AcSD 동안 각 실험 코호트(A3-A8)에 대한 일일 공격 횟수(양방향 반복 측정 ANOVA). (E) 평균 공격 횟수는 AcSD에서 유의하게 높았다(Welch의 보정을 사용한 unpaired t 테스트, ****p &lt; 0.0001). 모든 데이터는 SEM± 평균으로 표시됩니다. 약어: CSDS = 만성 사회적 패배 스트레스; SIT = 사회적 상호 작용 테스트; PND = 산후일; P0, A0-A8 = 각 실험 코호트에 대한 레이블. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66455/66455fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
AcSD 세션 중 공격 패턴은 24시간 후 사회적 표현형에 영향을 미치지 않습니다. 사회적 패배 스트레스에 노출된 후, 대부분의 청소년 수컷 마우스는 SIT에서 테스트했을 때 사회적 회피를 보이지 않았다(그림 3B, 만성 사회적 패배: 일원 분산 분석 F(2, 43) = 14.57, p &lt; 0.0001. 에프, AcSD: Kruskal-Wallis 검정, H(2) = 72.35, p &lt; 0.0001). 두 모델 모두에서, 사회적 회피형과 비사회적 회피형 패배 쥐 사이의 공격 횟수에는 유의한 차이가 없었다(그림 3D, 만성 사회적 패배: 양방향 반복 측정 ANOVA, F(9, 252) = 4.07, p = 0.21. H. AcSD: 양원 반복 측도 ANOVA, F(7, 511) = 1.32, p = 0.24). 그러나 회복력이 있는 마우스의 비율은 AcSD 노출 후보다 만성적인 사회적 패배 후에 더 높았습니다(그림 3C,G, 70 % 대 55.26%, 이항 테스트(단측), p = 0.0047).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66455/66455fig03.jpg"> 그림 3: 만성 사회적 패배 스트레스와 AcSD 패러다임에 따른 사회적 상호작용 테스트(SIT) 점수 비교. (A) 만성 사회적 패배 스트레스 모델의 타임라인. (B) 청소년기의 만성적인 사회적 패배 스트레스 후 SIT 점수의 분포(일원 분산 분석). (C) 청소년기의 만성적인 사회적 패배 스트레스 후 회복력/감수성의 비율. (D) 만성적인 사회적 패배 스트레스 동안 받은 표현형별 발작 횟수, 회복력과 감수성 간에 유의한 차이는 발견되지 않았다(양방향 반복 측정 ANOVA). (E) 가속된 사회적 패배 스트레스(AcSD) 모델의 타임라인. (F) 청소년기 AcSD 후 SIT 점수 분포(Kruskal-Wallis). 이 수치는57에서 수정되었습니다. (G) 청소년기에 AcSD 후 회복력/감수성의 비율. 이 수치는57에서 수정되었습니다. (H) AcSD 동안 받은 표현형별 공격 수; 탄력성과 민감성 사이에는 차이가 없습니다(양방향 반복 측정 ANOVA). 이 수치는59에서 수정되었습니다. **p &lt; 0.001, ****p &lt; 0.0001. 모든 데이터는 SEM± 평균으로 표시됩니다. 약어: PND = 산후일; 단점 = 컨트롤; 해상도 = 탄력적; Sus = 민감함. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66455/66455fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
AcSD는 청소년 C57BL/6 암컷 마우스에 사용할 수 있습니다. PND 25 C57BL/6 수컷 및 암컷 마우스가 생식 성숙에 도달하지 않았기 때문에, 프라이밍된 CD-1 마우스는 사춘기 수컷 마우스에 대해 했던 것처럼 사춘기 암컷 마우스에 대해 공격적인 공격을 가할 수 있다. 그러나 일정한 수의 공격에 도달하기 위해 준비 단계를 확장해야 했습니다(그림 4A). 그림 4B에서 볼 수 있듯이 실험에서 일일과 코호트 간의 상호작용은 발견되지 않았으며(그림 4B, 양방향 반복 측정 ANOVA: F(35,707) = 1.38, p =0.07), 세션의 주효과(F(6.286, 634.9) = 16.1, p &lt; 0.0001)과 코호트의 주효과(F(5, 101) = 11.34, p &lt; 0.0001; Holm-Sidak 사후 테스트: 세션 2 C4 대 C8, p = 0.03; 세션 6 C7 대 C4, p = 0.02; C7 대 C5, p = 0.02; 세션 7 C8 대 C3, p = 0.02; C8 대 C4, p = 0.045). AcSD에 노출된 청소년 C57BL/6 암컷 마우스의 대다수는 사회적 회피에 탄력적이었으며(그림 4C, Brown-Forsythe's ANOVA: F(2,113.4) = 27.2, p &lt; 0.0001), 이는 청소년 수컷 마우스와 유사했습니다. 탄력적인 마우스와 감수성 마우스 간의 공격 횟수에서는 유의한 차이가 발견되지 않았습니다(그림 4E, 양방향 반복 측정 ANOVA, 세션 x 표현형 상호작용: F(7, 714) = 0.73, p =0.64, 세션 F(6.375, 650.3) = 7.02, p &lt; 0.0001, 표현형 F(1, 102) = 0.4, p =0.53의 주효과 없음).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66455/66455fig04.jpg"> 그림 4: 사춘기 암컷 쥐의 AcSD. (A) 실험의 타임라인. (B) AcSD 중 실험에 의한 일일 공격 횟수(양방향 반복 측정 ANOVA). (C) 암컷 마우스에서 청소년기 동안 AcSD 후 SIT 점수의 분포(Brown-Forsythe's ANOVA). (D) 청소년기에 AcSD 후 회복력/감수성의 비율(오른쪽). (E) AcSD 동안 받은 표현형별 공격 횟수; 탄력 있는 마우스와 감수성이 있는 마우스 간에 유의한 차이는 발견되지 않았습니다(양방향 반복 측정 ANOVA). 모든 데이터는 평균± SEM으로 표시됩니다. (C-E) 이 수치는59에서 수정되었습니다. 약어: SIT = 사회적 상호 작용 테스트; PND = 산후일; C3-C8 = 각 실험 코호트에 대한 레이블; 단점 = 컨트롤; 해상도 = 탄력적; Sus = 민감함. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66455/66455fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 표 1: 성인을 대상으로 한 스크리닝 1일차에 대한 채점표 템플릿. 약어: CD-1 = 스크리닝된 CD-1 마우스의 ID, Exp = 실험 ID, 3분 = C57BL/6 성체 마우스에 대한 스크리닝 세션 기간, BL6 ID = 스크리닝에 사용된 C57BL/6 성체 마우스의 ID, Lat 1 성인 = CD-1에서 C57BL/6 성체 마우스를 향한 첫 번째 공격의 대기 시간, # 공격 = CD-1에 의해 수행된 공격 수. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66455/Supplementary%20Table%201_RE.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 표 2: 성인과 청소년을 위한 심사를 위한 채점표 템플릿. 약어: Exp = 실험 ID, 1분 = C57BL/6 성체 마우스에 대한 스크리닝 세션 기간, BL6 ID = 스크리닝에 사용된 C57BL/6 성체 마우스의 ID, Lat 1 ADULTS = CD-1에서 C57BL/6 성체 마우스에 대한 첫 번째 공격의 대기 시간, # aggressions = CD-1에 의한 공격 횟수, 5 min = C57BL/6 청소년 마우스에 대한 스크리닝 세션 시간, BL6 Ad = 스크리닝에 사용된 C57BL/6 청소년 마우스의 ID, Lat 1 청소년 = CD-1에서 C57BL/6 청소년 마우스에 대한 첫 번째 공격의 대기 시간, CD-1 = 스크리닝된 CD-1 마우스의 ID. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66455/Supplementary%20Table%202_RE.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 표 3: 프라이밍 단계를 위한 점수 시트 템플릿입니다. 약어: CD-1 = 프라이밍에 사용된 CD-1 마우스의 ID, Exp = 실험 ID, 30초 = C57BL/6 성체 마우스의 프라이밍 세션 기간, BL6 ID = 프라이밍에 사용된 C57BL/6 성체 마우스의 ID, Lat 1 성인 = CD-1에서 C57BL/6 성체 마우스를 향한 첫 번째 공격의 대기 시간, # aggressions = CD-1이 수행한 공격 횟수 최소: 3 = C57BL/6 청소년 마우스의 프라이밍 세션 기간, BL6 Ad = 프라이밍에 사용된 C57BL/6 청소년 마우스의 ID, Lat 1 청소년 = CD-1에서 C57BL/6 청소년 마우스에 대한 첫 번째 공격의 대기 시간, # 마운팅 = C57BL/6 사춘기 마우스가 받은 마운팅 수. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66455/Supplementary%20Table%203_RE.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 표 4: 사회적 패배 스케줄링을 위한 점수 시트 템플릿(청소년 마우스 20마리). 약어: CD1 = CD-1 마우스의 ID, E = 실험, H = 습도, 1 st = 세션 1, 2nd = 세션 2, BL6 성인 = 프라이밍에 사용된 C57BL/6 성인 마우스의 ID, 무게 = C57BL/6 청소년 마우스의 무게, # 공격 = CD-1이 수행한 공격 수, # 상처 = C57BL/6 청소년 마우스가 받은 상처 수. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66455/Supplementary%20Table%204_RE.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 표 5: 사회적 패배 스케줄링의 예. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66455/Supplementary%20Table%205_RE.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 표 6: 성인 C57BL/6 수컷 마우스의 부상 모니터링을 위한 템플릿입니다. 약어: 1st - # 상처 = 세션 1에서 C57BL/6 성체 마우스가 받은 상처 수, 2차 - # 상처 = 세션 2에서 C57BL/6 성체 마우스가 받은 상처 수, BL6 = 프라이밍에 사용된 C57BL/6 성체 마우스의 ID. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66455/Supplementary%20Table%206_RE.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 표 7: 대조군 스케줄링 템플릿(청소년 마우스 10마리). 스크램블링 규칙: 동일한 동족을 반복하지 마십시오. 마우스는 같은 날에 상자의 같은 면을 반복할 수 없습니다. 생쥐는 집 케이지에서 다른 케이지의 마우스와 함께 스크램블해야 합니다. 가정용 케이지에는 번호가 매겨져 있습니다. 마우스 번호는 가정용 케이지 번호에 따라 제공됩니다. 패배한 그룹과 대조군은 홈 케이지에서 무작위로 가져갑니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66455/Supplementary%20Table%207_RE.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 표 8: 제어 그룹 스케줄링의 예. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66455/Supplementary%20Table%208_RE.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

우리는 청소년 C57BL/6 마우스를 위한 가속 사회적 패배 스트레스 모델을 개발했는데, 이는 남성과 여성 모두에게 작용하고 불연속적인 청소년 기간 동안 노출을 허용합니다. 이 모델에 대한 노출은 사회적 회피를 유발하지만, 패배한 수컷과 암컷 쥐의 하위 집합에서만 가능합니다.

청소년 C57BL/6 수컷 및 암컷 마우스에 대한 사회적 패배 스트레스 모델

Social adversity in adolescence is prevalent and can negatively impact mental health trajectories. Modeling social stress in adolescent male and female ...

우리는 청소년기의 사회적 역경이 신경 발달 및 행동 결과에 미치는 영향을 조사하며, 특히 수컷 및 암컷 C57BL/6 마우스에 초점을 맞춥니다. 우리는 만성적인 사회적 패배 스트레스 패러다임의 적응된 버전을 사용하여 사회적 고통을 모델링합니다. 가속된 사회적 패배 스트레스(accelerated social defeated stress)라고 불리는 우리의 모델은 청소년 C57BL/6 마우스에서 사용하도록 맞춤화되었습니다.사회적 패배 스트레스 프로토콜은 거주 쥐의 공격적인 행동을 요구합니다. 기존 연구는 청소년 중기에 수행되거나 출생 후 노출일에 대한 특이성이 부족한 경우가 많습니다. 일부 연구는 초기 성인기까지 확장되거나 일반적으로 사용되지 않는 쥐 균주를 사용합니다.사춘기 C57BL/6 마우스에서 사회적 패배 모델을 구현하는 것은 성인 또는 청소년 마우스가 일반적으로 초기 사춘기 남성 또는 여성 마우스를 공격하지 않고 사춘기는 취약한 신중한 시간적 창을 포함하는 짧은 수명이기 때문에 어려웠습니다. ACSD 모델은 남성과 여성 모두에서 24시간 후에 사회적 회피를 성공적으로 유도합니다. 청소년기의 신중한 기간 동안 노출을 허용할 수 있을 만큼 충분히 짧습니다.이를 통해 탄력 있는 쥐와 감수성이 있는 쥐를 분리할 수 있으며 청소년 C57BL/6 암컷 쥐의 사회적 패배 스트레스를 연구할 수 있는 첫 번째 모델입니다. 우리의 모델은 청소년 남성과 여성 C57BL/6 마우스에 사용하도록 생성되었습니다. 하루에 두 번의 물리적 공격 세션으로 구성된 이 4일 스트레스 패러다임은 성인 C57BL/6 수컷 마우스를 사용하여 C1 마우스의 공격성을 프라이밍하여 C1 마우스가 실험용 수컷 또는 암컷 마우스를 쉽게 공격하도록 합니다.

social-defeat-stress-model-for-adolescent-c57bl6-male-and-female-mice

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

Y-미로 장벽 작업은 보상을 위한 노력을 소비하는 동기를 검사하는 행동 테스트입니다. 여기에서는 만성 코르티코스테론과 사회적 패배 스트레스를 비롯한 여러 가지 잘 검증된 만성 스트레스와 여성에게 효과적인 새로운 만성 비차별적 사회적 패배 스트레스(CNSDS)를 테스트하는 데 대해 논의합니다.

만성 스트레스는 마우스의 Y-미로 장벽 작업에서 노력과 관련된 선택 행동을 변화시합니다.

사회적 위협-안전 테스트는 혐오적 조건 학습 및 사회적 위협-안전 차별 능력의 측정으로서 사회적 회피 발달을 동시에 평가할 수 있으며, 둘 다 만성적으로 사회적으로 패배한 수컷 쥐의 단일 그룹 내에서 스트레스에 취약하고 스트레스 탄력적인 개인을 식별하는 데 사용됩니다.

사회적 위협-안전성 테스트로 심리사회적 스트레스 관련 표현형 밝혀

이 프로토콜은 초기 사춘기 수컷 마우스에서 10일 동안 만성적인 사회적 패배 스트레스를 수행하여 마우스의 60% 이상에서 성인이 되어서도 오래 지속되는 사회적 회피를 생성하는 방법을 자세히 설명합니다.

초기 청소년기 수컷 마우스의 만성 사회적 패배 스트레스

본 연구는 매일 4가지 사회적 스트레스 요인을 통합함으로써 암컷 C57BL/6J 마우스의 정신 장애에 대한 다중 통합 사회적 스트레스(MISS) 모델을 설명합니다. 10일 동안 MISS 노출을 반복한 후, 생쥐는 우울증과 불안과 같은 표현형을 개발하여 여성 피험자의 정신 장애를 연구하기 위한 자연스러운 병인학 기반 동물 모델을 제공했습니다.

암컷 C57BL/6J 마우스의 정신 장애에 대한 다중 통합 사회적 스트레스 모델

레쉴리 III의 미로가 자극 aversive 또는 Visual 단서에 의존하지 않는 경로 학습 작업입니다. 그것은 따라서 특히 노화 생쥐의하거나 어디에 스트레스가 고려, 학습 및 메모리를 평가하기위한 매우 매력적인 옵션입니다.

마우스에 레쉴리 III 메이즈를 사용하여 낮은 스트레스 루트 학습

이 프로토콜에서 설명하는 절차는 테스토 스 테론 관리 및 테스토 스 테론에 대한 민속 신앙 직접 반대 사회적 행동에 연결되어있을 수 있습니다 보여준다.

행동 내분비학 및 실험 경제학을 결합 : 테스토 스 테론과 사회 의사 결정

여기 크롤리의 사교성과 사회 노벨티 테스트를위한 환경 설정을 사용하여 생쥐에서 사교성의 시험에 대한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 결과의 올바른 해석에 중요한 중요한 세부 사항을 포함하여이 절차에 대한 장점과 가능한 응용 프로그램을 설명합니다.

사회적 상호 작용 동작 평가

개선된 체외 신경독성 분석은 새로운 신경보호 화합물을 식별하는 데 도움이 될 것입니다. 신경 세포주에서 세포 독성 및 세포 보호를 결정하고 두 번째 메신저 경로의 관여를 설명하여 신경 보호 메커니즘에 대한 통찰력을 얻기 위한 실시간 임피던스 기반 세포 분석기의 유용성을 제시합니다.

신경 세포주에 신경 독성과 신경에 관여하는 분자 진학의 윤곽을하는 도구로 실시간 임피던스 기반의 세포 분석기

여기에서는 스트레스를 받는 개인의 회피를 정량화하는 프로토콜을 제시합니다. 이 패러다임은 강력하면서도 사용자 친화적이며 Drosophila melanogaster의 한 종류의 사회적 상호 작용에 대한 유전자와 환경의 영향을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

사회 회피의 정량화에 대한 간단한 분석 초파리

이 문서 melanogaste 동기 부여를 공부 r에 초파리에서 남성 짝짓기 드라이브를 사용하는 행동 분석에 대해 설명합니다. 이 방법을 사용하여, 연구자는이 동기를 기초가 유전 적 분자 및 세포 메커니즘을 밝히기 위해 고급 플라이 neurogenetic 기술을 이용할 수있다.

측정과 남성의 변경 결합 드라이브<em&gt; 노랑 초파리</em

학습하세요 청소년 C57BL/6 수컷 및 암컷 마우스에서 사회적 패배 스트레스 모델을 이용한 신경발달 및 행동 연구 방법을. 이 모델은 사회적 회피를 유도하고 회복탄력성과 취약성을 구분하여 청소년기 스트레스 반응 메커니즘을 이해하는 데 활용됩니다.

청소년 C57BL/6 수컷 및 암컷 마우스에 대한 사회적 패배 스트레스 모델

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