Name: 과립 세포가 없는 제브라피시에서 Stage I 난모세포의 신속한 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 12 s
Description: 배우세요 제브라피시에서 과립 세포가 없는 Stage I 난모세포를 신속하게 분리하는 개량된 방법을. 이 프로토콜은 게놈 및 후성유전학 연구에서 더 정확한 분석을 가능하게 합니다.

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<meta charset="utf8"></head><body>Granulosa cell-free Stage I 제브라피시 난모세포를 얻기 위한 개선된 절차

<ol><li>Qin, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+mechanism+of+long-term+bisphenol+S+exposure+disrupted+ovarian+lipids+metabolism%2C+oocytes+maturation%2C+and+offspring+development+of+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Unraveling the mechanism of long-term bisphenol S exposure disrupted ovarian lipids metabolism, oocytes maturation, and offspring development of zebrafish.</a> Chemosphere. 277, 130304(2021).</li>
<li>Hau, H. T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+Larp6+controls+oocyte+development%2C+chorion+formation+and+elevation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Maternal Larp6 controls oocyte development, chorion formation and elevation.</a> Development. 147 (4), 187385(2020).</li>
<li>Cabrera-Quio, L. E., Schleiffer, A., Mechtler, K., Pauli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+ski7+tunes+RNA+levels+during+the+oocyte-to-embryo+transition%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Zebrafish ski7 tunes RNA levels during the oocyte-to-embryo transition.</a> PLoS Genet. 17 (2), e1009390(2021).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptome+reveals+insights+into+the+development+and+function+of+the+zebrafish+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptome reveals insights into the development and function of the zebrafish ovary.</a> Elife. 11, 76014(2022).</li>
<li>Li, C. W., Ge, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+expression+of+bone+morphogenetic+protein+family+ligands+and+receptors+in+the+zebrafish+ovary%3A+A+potential+paracrine-signaling+mechanism+for+oocyte-follicle+cell+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal expression of bone morphogenetic protein family ligands and receptors in the zebrafish ovary: A potential paracrine-signaling mechanism for oocyte-follicle cell communication.</a> Biol Reprod. 85 (5), 977-986 (2011).</li>
<li>Zampolla, T., Spikings, E., Rawson, D., Zhang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeleton+proteins+F-actin+and+tubulin+distribution+and+interaction+with+mitochondria+in+the+granulosa+cells+surrounding+stage+III+zebrafish+%28Danio+rerio%29+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Cytoskeleton proteins F-actin and tubulin distribution and interaction with mitochondria in the granulosa cells surrounding stage III zebrafish (Danio rerio) oocytes.</a> Theriogenology. 76 (6), 1110-1119 (2011).</li>
<li>Lubzens, E., Young, G., Bobe, J., Cerda, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oogenesis+in+teleosts%3A+How+eggs+are+formed%5BTitle%5D)+AND+%22Gen+Comp+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Oogenesis in teleosts: How eggs are formed.</a> Gen Comp Endocrinol. 165 (3), 367-389 (2010).</li>
<li>Song, Y., Hu, W., Ge, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+transgenic+zebrafish+%28Danio+rerio%29+models+expressing+fluorescence+proteins+in+the+oocytes+and+somatic+supporting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gen+Comp+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Establishment of transgenic zebrafish (Danio rerio) models expressing fluorescence proteins in the oocytes and somatic supporting cells.</a> Gen Comp Endocrinol. 314, 113907(2021).</li>
<li>Sousa, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproductive+hormones+affect+follicular+cells+and+ooplasm+of+stage+I+and+II+oocytes+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Fertil+Dev%22%5BJournal%5D)">Reproductive hormones affect follicular cells and ooplasm of stage I and II oocytes in zebrafish.</a> Reprod Fertil Dev. 28 (12), 1945-1952 (2016).</li>
<li>Yan, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gonadal+soma+controls+ovarian+follicle+proliferation+through+Gsdf+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Gonadal soma controls ovarian follicle proliferation through Gsdf in zebrafish.</a> Dev Dyn. 246 (11), 925-945 (2017).</li>
<li>Selman, K., Wallace, R. A., Sarka, A., Qi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+oocyte+development+in+the+zebrafish%2C+Brachydanio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22J+Morphol%22%5BJournal%5D)">Stages of oocyte development in the zebrafish, Brachydanio rerio.</a> J Morphol. 218 (2), 203-224 (1993).</li>
<li>Wallace, R. A., Selman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+aspects+of+oogenesis+and+oocyte+growth+in+fish+and+amphibians%5BTitle%5D)+AND+%22J+Electron+Microsc+Tech%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural aspects of oogenesis and oocyte growth in fish and amphibians.</a> J Electron Microsc Tech. 16 (3), 175-201 (1990).</li>
<li>Elkouby, Y. M., Mullins, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+analysis+of+early+oogenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Methods for the analysis of early oogenesis in zebrafish.</a> Dev Biol. 430 (2), 310-324 (2017).</li>
<li>Ai, N., Liu, L., Lau, E. S., Tse, A. C., Ge, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+oocyte+and+follicle+layer+for+gene+expression+analysis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Separation of oocyte and follicle layer for gene expression analysis in zebrafish.</a> Methods Mol Biol. 2218, 1-9 (2021).</li>
<li>Zhan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Explorations+of+the+optimal+method+for+isolating+oocytes+from+zebrafish+%28Danio+rerio%29+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool+B+Mol+Dev+Evol%22%5BJournal%5D)">Explorations of the optimal method for isolating oocytes from zebrafish (Danio rerio) ovary.</a> J Exp Zool B Mol Dev Evol. 330 (8), 417-426 (2018).</li>
<li>Avma guidelines for the euthanasia of animals: 2020 edition. Avma. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.avma.org/resources-tools/avma-policies/avma-guidelines-euthanasia-animals">https://www.avma.org/resources-tools/avma-policies/avma-guidelines-euthanasia-animals</a> (2020).</li>
<li>Phs policy on humane care and use of laboratory animals. Olaw. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://olaw.nih.gov/policies-laws/phs-policy.htm#Introduction">https://olaw.nih.gov/policies-laws/phs-policy.htm#Introduction</a> (2015).</li>
<li>Matthews, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthesia+and+euthanasia+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Anesthesia and euthanasia in zebrafish.</a> ILAR J. 53 (2), 192-204 (2012).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Kinger의 세포 해리 솔루션</td><td>PlantChemMed</td><td>PC-33689</td><td>Kinger의 세포 해리 솔루션은 -20°C에서 안정적으로 저장할 수 있습니다. C는 포장 후 저온에서 해동한 후 사용할 수 있습니다(4°C; C). 그것은 제브라피쉬 난소를 해리시키는데 직접적으로 사용될 수 있습니다. 최적 온도는 28.5°C입니다. C, 약 2-3시간 동안. 지속 시간은 특정 해리 조건에 따라 단축 또는 연장(https://www.plantchemmed.com/chanpin?productNo=PC-33689)으로 조정할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>셀 스트레이너(100 &mu; m )</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>형광 현미경</td><td>Zeiss</td><td>Axio Zoom.V16</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Dumont</td><td>#5</td><td></td></tr><tr><td>유리 모세관 바늘</td><td>/</td><td>/</td><td>라이터로 연소하여 둔화</td></tr><tr><td>Hoechst</td><td></td><td>Yesen 40732ES03</td><td></td></tr><tr><td>저흡착 피펫 팁 (10 &mu; l )</td> <td>Labsellect</td><td>T-0010-LR-R-S</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz' s L-15 중간 중간 (L-글루타민 포함)</td><td>Hyclone</td><td>SH30525.01</td><td></td></tr><tr><td>얼음 양동이</td><td>/</td><td>/</td><td>얼음-차가운 물은 제브라피쉬 인큐베이터를 안락사시키는 데 사용됩니다</td></tr>. <tr><td></td><td>WIGGENS</td><td>WH-01</td><td></td></tr><tr><td>어린 물고기</td><td>/</td><td>/</td><td>5&ndash; 수정 후 6주, 표준 길이[SL] 10&ndash; 15mm</td></tr><tr><td>플라스틱 접시 (35mm)</td> <td>SORFA</td><td>230101</td><td></td></tr><tr><td>실체 현미경</td><td>Motic</td><td>SMZ-161</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 플레이트 (6 웰)</td> <td>SORFA</td><td>0110006</td><td></td></tr><tr><td>Vannas 스프링 가위</td><td>Fine Science Toosl</td><td>#15000-00</td><td></td></tr></tbody></table>

과립 세포가 없는 제브라피시에서 stage i 난모세포의 신속한 분리

Rapid Isolation of Stage I Oocytes in Zebrafish Devoid of Granulosa Cells

그림 1 은 성체 제브라피시와 어린 제브라피시에서 관찰된 난소 형태를 보여주며, 다양한 발달 단계의 난모세포를 보여주며 참고 자료로 사용할 수 있습니다. 그림 1A 는 1차 성장 단계(I단계)에서 시작하여 배란란자(V단계)까지 각 발달 단계에서 난모세포의 형태와 크기를 그래픽으로 표현한 것입니다. 그림 1Ai-v 는 난모세포의 I기에서 V기에 해당하는 직경을 보여줍니다. 그림 1B (왼쪽 패널)는 어린 물고기(SL = 1.5cm인 6 wpf)의 난소 이미지를 보여줍니다. 특히, 청소년 난소는 뚜렷한 소엽 모양을 보이며, 주로 투명한 I기 난모세포가 풍부하고 더 적은 수의 II기 난모세포가 동반되는 것이 특징입니다. 이러한 I기 난모세포의 유병률은 난모세포의 관찰과 회수를 크게 용이하게 합니다. 오른쪽 패널은 성체 물고기 난소(6개월)의 형태를 묘사하고 있으며, 다양한 발달 단계의 난모세포를 관찰할 수 있습니다. 그러나 불투명한 말기 난모세포(II-III기)는 난소에서 우세합니다.
그림 2 는 해부부터 깨끗한 I기 난모세포를 얻기까지의 대표적인 과정을 보여줍니다. 그림 3 은 참조 방법과 수정된 방법을 모두 사용하여 얻은 I기 난모세포를 보여줍니다. Hoechst 염색 후 난모세포와 과립구 세포핵은 자외선 아래에서 청색 형광을 나타냈습니다. 참조 방법(그림 3A)을 사용하여 얻은 이미지에서 난모세포의 표면은 수많은 염색된 과립 세포핵으로 조밀하게 둘러싸여 있었습니다. 대조적으로, 수정된 방법(그림 3B)으로 분리된 I기 난모세포는 과립 세포핵 염색이 존재하지 않고 완전한 노출과 청결도를 나타냅니다.
우리의 발견은 I기 난모세포를 분리하기 위해 제안된 방법의 효과를 입증했습니다. teleost 물고기에서 난모세포의 발달 과정은 몇 가지 공통적인 특성을 나타낸다7. 종간 적용 가능성을 평가하기 위해 다른 어종에 대한 추가 분석이 수행되었습니다. 암컷 연못 미꾸라지는 현지 시장에서 구입했으며 초기 단계의 난모세포(직경 &lt;100μm)는 동일한 절차에 따라 분리했습니다. 연못 미꾸라지의 난소 구성은 또한 여러 발달 단계에서 난모세포의 혼합물을 나타냈으며, 난모세포 형태와 크기가 같은 단계의 제브라피시와 현저하게 유사하다는 특징이 있습니다. 그림 4A에서 볼 수 있듯이, 다 자란 암컷 연못 미꾸라지의 난소는 투명한 초기 난모세포와 산재된 불투명한 후기 난모세포에 의해 지배되었습니다. 난모세포의 표면에서 과립세포(granulosa cell)의 투명한 단층(monolayer)이 관찰되었습니다. 제브라피시에서 관찰한 결과, 직경이 100μm 미만인 미꾸라지 난모세포는 디플로텐 단계 이전의 단계에 해당했습니다. 그림 4B 는 수정된 방법으로 얻은 깨끗한 연못 미꾸라지(Misgurnus anguillicaudatus) 난모세포를 보여줍니다. 제브라피시 난소와 비교했을 때, 연못 미꾸라지의 난소는 해리하기가 더 어렵습니다. 6-7시간의 소화 후에는 더 많은 초기 단계의 난모세포가 해리됩니다. 그럼에도 불구하고, 이 조정된 접근법은 원하는 깨끗하고 벌거벗은 난모세포를 산출했습니다. 제브라피쉬는 Cyprinidae 가족에 속하는 반면 연못 미꾸라지는 Cobitidae 가족으로 분류됩니다. 이 두 과(family)는 먼 분류학적 관계를 보이지만 난소 발달 단계와 형태는 매우 유사하여 이 방법이 일반적으로 다양한 어종의 난모세포를 분석하는 데 활용될 수 있음을 나타냅니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66458/66458fig01v2.jpg"> 그림 1: 다양한 단계에서 제브라피시 난소와 난모세포의 대표 이미지. (A) 각 발달 단계(St)에서 난모세포의 형태 및 크기. i-v는 I기에서 V기까지의 난모세포의 이미지와 직경을 나타냅니다. 스케일 바 = 200 μm. (B) 성인 및 청소년 제브라피시의 난소 형태. 스케일 바 = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66458/66458fig01largev2.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66458/66458fig02v2.jpg"> 그림 2: 해부부터 깨끗한 I기 난모세포 획득에 이르는 분리 절차의 대표 이미지. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66458/66458fig02largev2.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66458/66458fig03.jpg"> 그림 3: 두 가지 방법을 통해 얻은 I기 난모세포. (A) 참조된 방법에 의해 분리된 병기(St) I 난모세포. (B) 변형된 방법을 통해 분리된 I기 난모세포. 난모세포(oocyte)와 과립세포핵(granulosa cell nuclei)을 Hoechst로 염색하고 자외선으로 여기시켰습니다. 스케일 바 = 100 μm. BF = 명시야. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66458/66458fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66458/66458fig04.jpg"> 그림 4: 수정된 방법으로 얻은 연못 미꾸라지의 초기 단계 난모세포. (A) 연못 미꾸라지의 난소와 난모세포의 대표 이미지. I, II는 다양한 배율에서 연못 미꾸라지의 난소를 나타내고 III-IV는 연못 미꾸라지의 초기 단계 난모세포를 나타냅니다. 스케일 바: i (500 μm); II (200 μm); III, IV (100 μm). (B) 연못 미꾸라지에서 분리된 초기 단계의 난모세포. 난모세포와 과립세포 핵을 Hoechst로 염색하고 UV 광선으로 여기시켰습니다. 스케일 바 = 100 μm. BF = 명시야. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66458/66458fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

과립 세포가 없는 제브라피시에서 Stage I 난모세포의 신속한 분리

The study of oocyte development holds significant implications in developmental biology. The zebrafish (Danio rerio) has been extensively used as a model ...

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

중후반 초파리 여포의 단계 별 분리는 다양한 목적에 유용합니다. 이러한 모낭이 체외 개발 분석 및 라이브 영상과 결합하는 유전자 및 / 또는 약물 조작이 가능 문화, 발전. 또한, 모낭은 mRNA와 단백질을 단리 같은 분자 연구에 사용될 수있다.

의 유틸리티 스테이지 별 중후반<em&gt; 초파리</em&gt; 난포 격리

여기에서 우리는 핵소체 조직을 기반으로 마우스의 전 정부 난자의 특성에 대한 프로토콜을 제시한다.

핵소체 염색질 조직을 바탕으로 마우스 전 정부 난 모세포의 분리 및 특성

이 프로토콜은 제브라피시 배아에서 단일 세포를 분리하고, 관심 세포를 농축하고, 미세유체 기반 단세포 다중 시스템에서 제브라피시 세포를 포획하고, 단일 세포에서 유전자 발현을 평가하는 방법을 설명합니다.

분리 및 Zebrafish의 배아에서 단일 세포의 특성

모체 유전자 산물의 조작에 사용 제브라 난자의 체외 성숙에 최적화 프로토콜은 여기에 제시된다.

사용 모성 유전자 제품의 기능 조작<em&gt; 체외</em제브라 피쉬&gt; 난자의 성숙

이 연구의 주요 목적은 바늘에 맞게 vitrification (NIV) 절차 전체 zebrafish testes cryopreserve에 몰입 했다. 또한, 5 개의 다른 zebrafish 긴장에서 방법의 반복성 시험 되었다.

Zebrafish Spermatogonia 전체 Testes 바늘의 cryopreservation 몰입 울트라-빠른 냉각

여기서는 제브라피시 난소 여포에 여포 세포와 난소 세포를 분리하는 간단한 방법을 제시하여 제브라피시의 난소 발달에 대한 조사를 용이하게 합니다.

얼룩말 피시의 난소 여포에서 여포 세포와 난소 세포의 분리

전후 난포 생성에 대한 연구를 발전시키기 위해서는 단일 난소에서 난포를 분리하는 효율적인 방법이 필요합니다. 여기에 제시된 것은 조직 초퍼와 균질화를 사용하여 소 난소에서 난포를 분리하기위한 간소화 된 기계적 프로토콜입니다. 이 방법은 단일 난소에서 많은 수의 생존 가능한 전방 난포를 수집 할 수있게합니다.

단편화, 균질화 및 연속 여과의 조합을 사용하여 소 난소에서 작은 전방 난포의 분리

여기에서는 난자 채취 후 적운-난모세포 복합체의 일부를 신속하게 제거하여 IVF 관찰 과정을 촉진하고, 과립층 세포 제거에 필요한 시간을 단축하고, 외부 요소에 대한 난모세포 노출을 최소화하고, 배아 발달을 방해하지 않으며, 궁극적으로 IVF 실험실 절차의 효율성을 향상시키는 최적화된 방법을 제시합니다.

The Immediate Partial Removal of Cumulus-Oocyte Complexes: A Refined Approach for Rapid Observation of In Vitro Fertilization(적운-난모 세포 복합체의 즉각적인 부분 제거: 체외 수정의 신속한 관찰을 위한 정제된 접근 방식)

여기에서는 조류 배란 전 여포에서 난황, 과립층 세포 및 테카 세포를 분리하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 이러한 정밀한 취급을 통해 생식 기능에서 이러한 층의 역할에 대한 중요한 조사를 수행할 수 있으며, 농업 수확량 및 생물 의학적 통찰력을 향상시키기 위해 여포 발달, 호르몬 조절 및 질병 연구에 대한 이해를 돕습니다.

다운스트림 응용을 위한 조류 배란 전 여포 granulosa 및 Theca 세포층 분리

여기에서 우리는 전체 뇌 또는 telencephalic, tectal 또는 성인 zebrafish의 뇌의 소뇌 영역 중 하나에서 파생 neurosphere 분석을 사용하여 성인 신경을 검사 할 수있는 재생 가능한 방법을 제공한다. 또한, 우리는 제브라 피쉬 neurosphere를 유전자 발현을 조작하는 절차를 설명한다.

성인 Zebrafish의 뇌 유래 neurosphere를의 분리 및 문화

배우세요 제브라피시에서 과립 세포가 없는 Stage I 난모세포를 신속하게 분리하는 개량된 방법을. 이 프로토콜은 게놈 및 후성유전학 연구에서 더 정확한 분석을 가능하게 합니다.

과립 세포가 없는 제브라피시에서 Stage I 난모세포의 신속한 분리

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