Name: 난소암 오가노이드의 바이오뱅킹 전략: 조직학적 아형 및 질병 단계에 걸친 환자 간 이질성 해결 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T14:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: 학습하세요 난소암 오가노이드 바이오뱅킹 프로토콜을 통해 환자별 이질성을 해결하고 장기 배양을 가능하게 하는 방법을. 이 기술은 맞춤형 치료와 예측 바이오마커 발굴에 활용됩니다.

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이 연구는 독일 암 연구 센터(German Cancer Research Center)의 자금 지원을 받고 있으며, 파트너 사이트인 뮌헨(Munich)은 DKFZ와 뮌헨 대학병원(University Hospital LMU Munich)의 파트너십을 맺고 있습니다. 이 연구는 또한 독일 암 원조 보조금(#70113426 및 #70113433)의 지원을 받습니다. 조직 및 오가노이드의 파라핀 임베딩은 뮌헨 LMU 뮌헨 의과대학 해부학 연구소의 핵심 시설에서 수행되었습니다. 공초점 이미징은 Biomedical Center(BMC)의 핵심 시설인 Bioimaging에서 수행되었습니다. 저자는 기술적인 도움을 준 Simone Hofmann, Maria Fischer, Cornelia Herbst, Sabine Fink 및 Martina Rahmeh에게 감사의 뜻을 전합니다.

난소암 오가노이드 바이오뱅킹 표준화

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</ol>

M.K.는 난소암 오가노이드용 배지와 관련된 특허에 발명자로 등재되어 있습니다. F.T.는 아스트라제네카(AstraZeneca), 클로비스(Clovis), 에이사이(Eisai), 이뮤노젠(ImmunoGen), 메닥(Medac), MSD, 파마마(PharmaMar), 로슈(Roche), SAGA 진단(SAGA diagnostics), 테사로/GSK(Tesaro/GSK)로부터 연구비, 자문위원회, 사례금, 여행 경비를 지원받았다. S.M.은 애브비(AbbVie), 아스트라제네카(AstraZeneca), 클로비스(Clovis), 에이사이(Eisai), 글락소스미스클라인(GlaxoSmithKline), 휴브로(Hubro), 메닥(Medac), MSD, 노바티스(Novartis), 니코드(Nykode), 올림푸스(Olympus), 파마마(PharmaMar), 화이자(Pfizer), 로슈(Roche), 센서 키네시스(Sensor Kinesis), 테바(Teva), 테사로(Tesaro)와 같은 연구 자금, 자문 위원회, 명예 또는 여행 경비를 지원받았습니다.

설계된 프로토콜은 오가노이드 형성 및 장기 통과 가능성과 관련하여 난소암 오가노이드 바이오뱅킹의 이전 문제를 해결하고 대부분의 고형 종양 퇴적물에서 완전히 확장 가능한 라인의 생성을 보장합니다. 오가노이드 생성에 사용되는 종양 샘플의 외과적 수집 공정은 수율과 확장 가능성에 상당한 영향을 미칩니다. 종양 조직 샘플은 다중 내장 수술, 진단적 복강경 검사 또는 생검을 포함한 다양한 절차 중에 얻을 수 있습니다. 경험이 풍부한 부인과 종양 외과 의사는 복막 위치에서 깨끗한 종양 샘플을 얻는 것을 우선시해야 합니다. 특히, 큰 종양 퇴적물 내의 거시적으로 괴사된 영역은 오가노이드 배양의 성공적인 생성에 적합하지 않은 것으로 관찰되었습니다. 시료 순도는 다운스트림 응용 분야에서 분자 및 표현형 특성을 반영하는 데 중요하기 때문에 최적의 바이오뱅킹을 위해서는 임상 팀과 실험실 팀 모두의 동기화된 노력이 필요하며, 이를 통해 종양의 가장 관련성이 높은 영역에서 라인이 생성되도록 해야 합니다.
이 프로토콜은 2년간의 바이오뱅킹 기간 동안 관찰된 성장 인자 의존성의 변화를 다루지만, 여전히 20%의 사례에서 오가노이드 성장이 관찰되지 않았고 제한된 확장 가능성을 입증한 라인의 수가 줄기의 최적이 아닌 유지를 시사했기 때문에 효능을 더욱 높이기 위해 추가적인 개선이 필요하다는 것은 분명합니다. 당사의 오가노이드 바이오뱅크는 현재 장액성 조직학(HGSOC 및 LGSOC)의 난소암 샘플만 포함하고 있지만, 구조화된 바이오뱅킹 프로그램 이전에 다양한 상피 난소암 조직학의 샘플에 대한 우리의 경험은 특별한 차이 없이 유사한 성공률을 보였습니다. 특히, 상피난소암 아형의 대다수는 뮬러관(Mullerian)에서 발달한 조직(나팔관, 자궁, 자궁경부)과 유사한 원주형 유사층화(pseudostratification) 형태를 공유하는 반면, 난소 상피 자체는 생식기 융기(genital ridge)와 중간자(mesonephros)에서 발달적으로 유래하며 직육면체 상피의 단일 층으로 덮여 있습니다. 상피 항상성을 조절하는 발달 경로는 성체 줄기 세포 전위를 조절하는 데 중심적인 역할을 하기 때문에 오가노이드의 바이오 뱅킹을 위한 프로토콜을 개발할 때 배아 기원의 차이를 고려해야 합니다. 따라서 우리는 난소 표면의 전구세포가 장기적으로 안정적인 성장을 유지하기 위해 장기 특이적 배양 조건을 필요로 할 가능성이 높다고 믿습니다.
특히, 우리 연구실에서는 선행 화학요법이 세포 생존력과 조직 표현형에 영향을 미치기는 하지만, 이 프로토콜은 선행 후 난소암 샘플에서도 성공적인 것으로 입증되었습니다. 이 샘플은 오가노이드 형성 가능성에 영향을 미칠 수 있는 1차 용적 축소 수술의 화학 요법 경험이 없는 조직에서 파생된 샘플에 비해 더 많은 파편과 세포외 조직 응집체를 나타냅니다. 이러한 경우, 선행 후 샘플이 더 민감할 수 있기 때문에 적절한 양의 수술 조직과 권장 운송 조건을 엄격하게 준수하는 것이 성공적인 오가노이드 생성에 매우 중요하다는 것을 경험했습니다.
갓 분리한 전구세포의 2D에서 플라스틱에 대한 짧은 팽창이 후속 오가노이드 성장에 미치는 유익한 효과에 대한 매우 흥미로운 현상은 우리가 반복적으로 관찰하여 표준화된 실험 절차에 포함시켰으며, 이는 주로 직접 파종 전략에 의존하는 암 오가노이드 연구 분야의 방법론에 중요한 추가 사항입니다. 효소 분해 후 전구 세포의 민감도와 성장 인자를 적절하게 프라이밍하는 능력이 이러한 차이의 근본적인 메커니즘이 될 수 있다고 추측하고 싶은데, 이는 경우에 따라 계통이 확립될 수 있는 경우 결정적인 요인이 될 수 있습니다. 그러나 명확한 종속성을 설정하려면 더 많은 연구가 필요합니다.
소화하기 어려운 3D 난소암 오가노이드의 높은 세포 접착력과 기능적 접합으로 인한 문제를 해결하기 위해 트립신 화 후 큰 덩어리가 남아 있을 때 바늘과 주사기를 사용한 기계적 및 효소적 해리의 조합이 도움이 될 수 있습니다. 다양한 효소 조건으로 실험하면 더 많은 개선이 이루어질 수 있습니다.
장기 보관 후 오가노이드 라인은 실험 설계에 따라 해동되어 배양에 들어가 후속 응용 분야에 사용할 수 있습니다. 이를 통해 특정 연구 목적을 위해 이미 생성된 오가노이드 라인에 언제든지 액세스할 수 있으며, 환자의 질병 진행에 비추어 특정 라인의 장기적인 거동을 조사하는 데 특히 유용합니다. 그러나 난소암 오가노이드의 동결 보존은 여전히 어려운 과제로 남아 있습니다. 동결 및 해동 주기 동안의 온도 변화는 오가노이드 생존율, 기능 및 팽창 가능성에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 장기 보관은 매우 낮은 온도에서 성능 저하 위험을 최소화하여 오가노이드의 무결성을 유지할 수 있는 액체 질소에서 더 안정적입니다. 그러나 이러한 프로세스를 더욱 개선하기 위해 냉동, 보관 및 해동에 대한 일관된 절차를 수립하기 위해 지속적인 최적화가 보장됩니다.
앞서 언급한 미해결 문제에도 불구하고 이 프로토콜은 난소암 환자의 고형 종양 샘플에서 안정적인 오가노이드 라인을 일관되게 생성할 수 있는 능력을 보여줍니다. 우리 실험실에서는 현재까지 120개의 원발성 난소암 조직 샘플을 처리하여 1차 부피 감소, 재발성 질환 및 신보조 수술 검체를 사용하여 광범위한 조직학적 하위 유형 및 질병 단계를 포함하여 약 50%의 사례에서 성공을 거두었습니다. 이 프로토콜은 다양한 환자 샘플에서 파생된 오가노이드 생성, 다양한 배지에서의 병렬 파종 및 다양한 파종 전략의 구현을 위한 구조화된 프레임워크를 제공함으로써 줄기 형성 가능성의 개인차를 평가할 수 있는 기회를 제공하여 종양 생물학에 대한 추가 정보를 제공합니다. 우리가 아는 한, 대부분의 연구는 일반적으로 소수의 샘플에서 배지 성분을 테스트하고 단순화를 위해 대부분 하나의 최적 배지를 선택하는 반대 접근 방식을 따릅니다. HER1ß의 효과, RSPO1 및 FGF10 보충제의 효과, 2D/3D 파종에 대한 체계적인 테스트는 난소암 조직이 줄기 특성에서 환자 간 변동성이 어느 정도 있으며 최적의 배지는 실제로 환자에 따라 다르다는 것을 결정적으로 보여줍니다. 따라서, 서로 다른 외인성 측분비 신호전달 환경을 제공하는 다양한 배지 조성에 대한 체계적인 병렬 테스트가 필수적입니다.
다양한 난소암 환자로부터 유래한 광범위한 오가노이드 패널과 전향적으로 수집된 임상 정보를 갖춘 살아있는 바이오뱅크를 구축하는 것은 광범위한 연구 응용 분야에 귀중한 리소스 역할을 하며 더 많은 환자 집단에 잠재적으로 적용할 수 있는 이질적인 임상 환경을 반영합니다17. 장기 배양 및 동결 보존은 실험의 일관성과 시간이 지남에 따라 동일한 오가노이드 라인의 반복적인 접근성을 가능하게 하여 변경되지 않은 종양 라인 세포 특성을 가진 종적 실험 설계의 기초 역할을 합니다.
상피 구조와 분극을 유지함으로써 오가노이드 라인은 세포간 통신과 파라크린 신호 전달 경로에 의해 매개되는 상황 의존적 세포 운명 의사 결정을 연구하는 데 적합한 모델입니다. 조직학적 겔에 오가노이드를 삽입하는 것은 고정 후 재료 손실을 방지하기 위한 실용적이고 효율적인 중간 단계이며 다운스트림 처리(파라핀 포함 및 절편)를 조직 샘플과 병행하여 수행할 수 있도록 합니다. 고정 절차 중 오가노이드의 손실은 오가노이드의 수가 매우 제한적일 때 중요한 문제입니다. 그러나 이러한 손실은 차가운 기초 배양 배지에서 세척하여 세포외 기질에서 오가노이드를 완전히 제거하고 고정 전에 24웰 형식 플레이트의 완전히 자란 웰을 최소 2개 이상 모아서 상쇄할 수 있습니다. 면역형광 염색 프로토콜을 사용하면 고해상도 컨포칼 이미징을 통해 난소암 오가노이드의 분자 및 표현형 특성을 모체 종양 조직과 일치시킬 수 있을 뿐만 아니라 화합물에 대한 세포 반응 또는 유전자 변형 라인의 특성 분석을 연구하는 데 유용한 도구이기도 합니다. 이 방법은 특별한 변형 없이 조직학 염색에도 적합합니다. 연구 목적에 따라 마이크로톰(2-3μm)으로 절단한 더 얇은 부분을 고려해야 합니다.
중요한 것은, 안정적인 장기 배양은 약물 반응 및 새로운 표준 치료법에 대한 내성에 대한 유전자 편집 실험 및 기능 분석의 전제 조건이라는 것입니다17,21. 특히, 질병 진행 및 재발 중에 수행되는 재생검에서 생성된 오가노이드는 치료 경험이 없는 원래 종양과 재발 중에 관찰된 새로 획득한 특성 간의 직접적인 비교 분석 가능성을 제공합니다. 환자별 치료 반응 확인 및 체외 치료 내성 형성은 난소암 연구에서 정밀 의학 분야를 발전시킵니다21.

상피난소암 환자의 임상적 관리는 진행된 단계에서 이질적인 임상 양상과 높은 재발률로 인해 여전히 어려운 과제로 남아 있다1. 난소암의 발병과 생물학적 행동에 대한 이해를 높이려면 난소암의 진행 과정, 치료 반응, 조직병리학적 및 분자적 특징을 다루는 연구적 접근이 필요하다2.
난소암 환자로부터 유래한 종양 샘플과 임상 정보를 체계적으로 수집하고 장기간 보존하는 것이 특징인 바이오뱅킹은 1차 용적 축소 수술, 선행 화학요법 후 및 재발성 질환의 종양 샘플을 포함하여 다양한 질병 단계에서 대규모 환자 코호트를 보존할 수 있습니다. 유망한 예후 바이오마커 및 치료 표적의 자원 역할을 하는 암 연구를 발전시킬 수 있는 귀중한 잠재력을 가지고 있습니다3. 그러나 포르말린 고정 및 동결과 같은 기존의 바이오뱅킹 방법은 생존력의 상실과 본래의 3차원 조직 구조의 파괴로 인해 원래의 종양 샘플에 대한 기능적 연구를 수행할 수 없습니다 4,5.
종양학 및 그 이상의 분자 메커니즘에 대한 연구는 질병의 생물학을 충실히 반영하고 생체 내에서 관찰된 조직의 체외 특성을 유지하는 적절한 실험 모델의 사용에 결정적으로 의존합니다. 재생 잠재력의 보존을 기반으로 하는 환자 유래 오가노이드는 실험실에서 상피의 원래 구조와 기능을 재현하고 환자별 맥락에서 테스트할 수 있습니다. 따라서 암 연구 및 개인 맞춤형 의학을 위한 매우 유망한 도구로 부상하여 임상 다양성과 실험실 연구 사이의 격차를 해소하고있습니다 6,7,8,9. 오가노이드 라인의 개별 약물 반응과 분자 프로파일의 기능적 관련성 테스트를 기반으로 하는 맞춤형 치료 전략은 잠재적으로 환자 치료에 직접 적용될 수 있습니다10,11. 환자별 특성을 포함한 장기 배양 가능성과 시간 경과에 따른 관련 전향적 임상 데이터 수집은 질병 진행 및 내성 메커니즘과 관련된 새로운 예후 및 예측 요인을 식별할 수 있는 큰 가능성을 가지고 있습니다 3,9.
그럼에도 불구하고 다양한 종양 샘플의 오가노이드를 포함하는 바이오뱅크를 구축하려면 복잡한 방법론을 엄격하게 준수하고 손쉬운 유지 관리를 위한 프로토콜을 설정해야 합니다12. 프로세스 표준화는 높은 이직률에도 훈련된 직원이 바이오뱅크를 효율적으로 설립하고 유지할 수 있도록 하는 동시에 최고 품질 표준13을 준수할 수 있도록 합니다. 여러 연구에서 다양한 효율로 원래 종양의 돌연변이 및 표현형 프로파일에 해당하는 안정적인 난소암 오가노이드 라인의 성공적인 생성을 보고했습니다. 그럼에도 불구하고 일상적인 바이오 뱅킹은 특히 대규모 확장 또는 성공적인 게놈 편집의 전제 조건인 장기적이고 안정적인 계통 성장을 위해 실제로 여전히 어려운 과제로 남아 있습니다.
특히, 확장성 문제는 성장 잠재력이 느리고 제한적인 오가노이드가 확립된 라인으로 간주되는 경우가 있기 때문에 현장에서 모호하게 정의되고 있습니다. Hoffmann et al.에 의해 처음 입증된 바와 같이, 난소암 조직의 최적 처리는 이질성을 수용하기 위한 독특한 전략이 필요하다14. 이 방법으로 수득한 오가노이드의 표현형 특성 분석 및 모체 종양 조직과의 밀접한 유사성은 성숙한 배양물(배양 4-10개월)의 패널 DNA 시퀀싱 및 전사체학 분석을 통해 확인되었으며, 이는 모델 8,9,12,14의 안정성을 입증했습니다.
건강한 나팔관의 항상성을 조절하는 측분비 환경과는 대조적으로, 고급 장액성 난소암(HGSOC), 암 재생 가능성 및 오가노이드 형성 능력을 생성할 가능성이 있는 상피층은 외인성 Wnt 보충에 덜 의존합니다. 또한, 오가노이드 배지에 Noggin이 없는 것을 특징으로 하는 활성 Bone Morphogenetic Protein(BMP) 신호전달은 난소암 고형 조직 침전물에서 장기 배양 확립에 도움이 되는 것으로 입증되었습니다14,15. 난소암의 고형 침전물에 대한 체계적인 바이오뱅킹 과정에서 우리는 이러한 발견을 확인하고 파이프라인을 설정했으며, 대부분의 사례에서 지속적인 장기 확장을 보장하는 이 프로토콜에 설명된 세부 사항을 제공합니다. 1차 분리체로 작업할 때 다양한 배지 조성 및 파종 양식에 대한 병렬 테스트는 장기적으로 안정적인 오가노이드 라인의 확립을 개선하고 수율을 높여 다운스트림 실험에 필요한 다중 웰 형식으로의 강력한 전파 및 확장을 가능하게 하는 데 필수적이라는 것을 발견했습니다16.
또한 수술 중 수집된 샘플의 순도와 품질은 기초 연구 및 분자 진단에서 난소암 오가노이드의 중개 잠재력에 매우 중요합니다. HGSOC의 임상 표현이 복잡하기 때문에 관련 물질을 정확하게 식별하고, 운송 조건을 일정하게 유지하고, 각 환자 질병의 가장 중요한 특성을 나타내는 오가노이드 라인을 고효율로 생성하기 위해 실험실의 외과의, 종양학자 및 과학자 간의 긴밀한 협력이 필요합니다. 이 프로토콜은 난소암을 특징짓는 이질성을 고려하여 난소암 오가노이드의 잠재력을 최대한 포착할 수 있는 표준화되었지만 적응 가능한 프레임워크를 제공합니다16,17. 특히, 이 프로토콜은 다양한 조직학적 유형(고등급 및 저등급 난소암, LGSOC), 줄기 조절에 차이를 보이는 동일한 환자의 다양한 침전물, 선행 후 수술 조직, 생검 재료 및 질병 진행의 재발 단계에서 수술 샘플을 포함하여 난소암 임상 증상의 광범위한 스펙트럼에 대한 신뢰할 수 있는 바이오뱅킹을 가능하게 합니다.

<table><tbody><tr><td>100 Sterican 26 G</td><td>Braun, Melsungen, 독일</td><td>4657683</td><td></td></tr><tr><td>100 Sterican 27 G</td><td>Braun, Melsungen, 독일</td><td>4657705</td><td></td></tr><tr><td>293T HA Rspo1-FC</td><td>R& D systems, Minneapolis, USA</td><td>3710-001-01</td><td>대안: R-Spondin1 expressing Cell line, Sigma-Aldrich, SC111</td></tr><tr><td>A-83-01 (TGF-b RI Kinase inhibitor IV)</td><td>Merck, Darmstadt, Germany</td><td>616454</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F-12 Medium&nbsp;</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>12634028</td><td></td></tr><tr><td>Anti-p53 항체 (DO1)</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA</td><td>sc-126</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PAX8 항체</td><td>Proteintech, Manchester, UK&nbsp;</td><td>10336-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement (50x)</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>보틀탑 진공 필터 0.2 &마이크로; m</td><td>코닝, 베를린, 독일&nbsp;</td><td></td><td></td>430049</tr><tr><td>CELLSTAR 세포 배양 플라스크, 175 cm2</td><td>Greiner Bio-one, Kremsm&uuml; nster, 오스트리아</td><td>661175</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR 세포 배양 플라스크, 25 cm2</td><td>Greiner Bio-one, Kremsm&uuml; nster, 오스트리아</td><td>690160</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR 세포 배양 플라스크, 75 cm2</td><td>Greiner Bio-one, Kremsm&uuml; nster, 오스트리아</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase I</td><td>Thermo Scientific, Waltham, 미국</td><td>17018029</td><td></td></tr><tr><td>Costar 48-well Clear TC-treated&nbsp;</td><td>코닝, 베를린, 독일&nbsp;</td><td>3548</td><td></td></tr><tr><td>Cryo SFM</td><td>PromoCell &ndash; 인간 중심 과학, 하이델베르크, 독일</td><td>C-29912</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex 감소 성장 인자 기저막 추출물, 유형 2, Pathclear</td><td>R& D systems, Minneapolis, USA</td><td>3533-005-02</td><td>대안: Matrigel, Growth Factor Reduced Basement membrane matrix&nbsp; 코닝, 356231&nbsp;</td></tr><tr><td>Cy5 AffiniPure 당나귀 안티-마우스 IgG</td><td>잭슨 면역</td><td>715-175-151</td><td></td></tr><tr><td>DAKO&nbsp; 구연산염 완충액, pH 6.0, 10x 항원 리트리버</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, 다름슈타트, 독일</td><td>C9999-1000ML</td><td></td></tr><tr><td></td><td>DAPI Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>당나귀 안티 토끼 Alexa Fluor Plus 555</td><td>Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>A32794</td><td></td></tr><tr><td>당나귀 안티 염소 IgG Alexa Fluor Plus 488</td><td>Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>A32814</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&acute; s 인산염 완충 식염수&nbsp;</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Epredia Richard-Allan Scientific HistoGel</td><td>Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>Epredia HG-4000-012</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 24-well 폴리스티렌&nbsp;</td><td>코닝, 베를린, 독일&nbsp;</td><td></td><td></td>351447</tr><tr><td>깃털 메스&nbsp;</td><td>Pfm medical, 쾰른, 독일</td><td>200130010</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>포르말린 37% 무산, 안정화</td><td>Morphisto, Offenbach am Main, 독일</td><td>1019205000</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>35050038</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td></td><td></td>156630080</tr><tr><td>인간 EpCAM/TROP-1 항체</td><td>R& D systems, Minneapolis, USA</td><td>AF960</td><td></td></tr><tr><td>Human FGF10</td><td>Peprotech, NJ, USA</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>Human recombinant BMP2</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>PHC7146</td><td></td></tr><tr><td>Human recombinant EGF</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>PHG0311L</td><td></td></tr><tr><td>Human recombinant Heregulin beta-1</td><td>Peprotech, NJ, USA</td><td>100-03</td><td></td></tr><tr><td>LAS X 코어 소프트웨어</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>https://webshare.leica-microsystems.com/latest/core/widefield/</td></tr> <tr><td>Leica TCS SP8 X&nbsp; 백색광 레이저 컨포칼 현미경</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-2 Supplement (100x)</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Omnifix 1 mL</td><td>Braun, Melsungen, Germany</td><td>3570519</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Omnilab, 독일 뮌헨</td><td>5170002</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드&nbsp;</td><td>Morphisto, Offenbach am Main, Germany</td><td>1176201000</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL)</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, 다름슈타트, 독일</td><td>P4333-100</td><td></td></tr><tr><td>PluriStrainer 400 &micro; m</td><td>PluriSelect, 라이프치히, 독일</td><td>43-50400-01</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen, 툴루즈, 프랑스</td><td>ant-pm-05</td><td></td></tr><tr><td>적혈구 용해 완충액</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, 다름슈타트, 독일</td><td>11814389001</td><td></td></tr><tr><td>Roticlear</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td><td>A538.5</td><td></td></tr><tr><td>Surgipath Paraplast</td><td>Leica, Wetzlar, Germany</td><td>39602012</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Nunc Cryovials</td><td>Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>375418PK</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Stain Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme&nbsp;</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>12604-013</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>PanReac AppliChem, 다름슈타트, 독일</td><td>A4974-0100</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>TOCRIS biotechne, Wiesbaden, Germany</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>Zeocin</td><td>Invitrogen, Thermo Scientific, Waltham, USA</td><td>R25001</td><td></td></tr></tbody></table>

난소암 오가노이드의 바이오뱅킹 전략: 조직학적 아형 및 질병 단계에 걸친 환자 간 이질성 해결

Strategy for Biobanking of Ovarian Cancer Organoids: Addressing the Interpatient Heterogeneity across Histological Subtypes and Disease Stages

임상 배경 정보와 함께 환자 유래 오가노이드로부터 난소암 바이오뱅크를 구축하면 연구 및 환자 치료의 발전이 기대되지만, 이 치명적인 악성 종양의 이질성과 오가노이드 기술의 고유한 복잡성으로 인해 표준화는 여전히 어려운 과제로 남아 있습니다. 이 적응형 프로토콜은 전구세포의 환자별 가변성을 고려하여 난소암 오가노이드의 잠재력을 최대한 실현할 수 있는 체계적인 프레임워크를 제공합니다. 최적의 배양 조건과 파종 방법을 선택하기 위한 구조화된 실험 워크플로우를 구현하고 직접 3D 파종과 2D/3D 경로의 병렬 테스트를 통해 대부분의 경우 광범위한 다운스트림 응용 분야에 적합한 강력한 장기 확장 라인을 얻을 수 있습니다. 
특히, 이 프로토콜은 고등급 및 저등급 난소암과 1차 용적 축소, 재발성 질환 및 선행 후 수술 표본을 포함한 매우 이질적인 시작 물질의 많은 증례(N = 120)에서 테스트 및 효과가 입증되었습니다. 낮은 Wnt, 높은 BMP 외인성 신호전달 환경 내에서, 우리는 전구세포가 헤레굴린 1 ß (HERß-1)-경로의 활성화에 다르게 취약하며, HERß-1이 어떤 곳에서는 오가노이드 형성을 촉진하는 반면 다른 곳에서는 오가노이드 형성을 억제하는 것을 관찰했습니다. 환자 샘플의 하위 집합의 경우 최적의 오가노이드 형성 및 장기 성장을 위해서는 섬유아세포 성장 인자 10 및 R-Spondin 1을 배지에 추가해야 합니다. 
또한, 조직 분해 및 전구 세포 분리의 중요한 단계를 강조하고 플라스틱에 대한 2D의 짧은 배양이 기저막 추출물 유형 2 매트릭스의 후속 오가노이드 형성에 도움이 되는 예를 지적합니다. 전반적으로, 최적의 바이오뱅킹을 위해서는 개별 계통에 대한 적절한 성장 환경을 식별하기 위해 모든 주요 조건을 병행하여 체계적으로 테스트해야 합니다. 이 프로토콜은 또한 포괄적인 표현형에 필요한 오가노이드의 고해상도 이미지를 얻기 위한 효율적인 임베딩, 절편화 및 염색을 위한 처리 절차를 설명합니다.

초기 조직 해리, 여과 및 계수 후 세포는 위에서 설명한 대로 3D 형식으로 직접 병렬로 파종되고 짧은 2D 확장을 위해 플라스크에 현탁됩니다. 경우에 따라 일시적인 2D 확장이 오가노이드 형성에 긍정적인 영향을 미치며, 이 경로를 통해 장기 라인이 성공적으로 설정되는 반면 비교 병렬 3D 시딩은 성장 정지를 초래할 수 있습니다(그림 1). 처리되는 각 기증자 조직에 대해 세포는 배지 매트릭스에 따라 테스트됩니다. 이 전략에 따라 바이오뱅크에는 이제 그림 2와 같이 각 표준 성장 조건을 나타내는 선이 포함됩니다. 다양한 배지 및 파종 모드를 테스트하는 이 미니 스크리닝 플랫폼을 엄격하게 구현하여 1차 고급 장액, 선행 후 간격 수술 및 재발성 질환의 다양한 조직학적 유형 및 질병 발병 단계(그림 3)에서 오가노이드 라인을 성공적으로 생성했습니다. 모조직과 비교하여 주요 마커의 면역형광 염색에 의한 오가노이드 라인의 표현형 특성 분석은 상피 종양 구획의 특징이 오가노이드 모델에서 보존됨을 설득력 있게 보여줍니다: 상피 구조 및 (EpCAM), 계통 식별(PAX8) 및 핵에 축적되는 HGSOC의 전형적인 TP53 점 돌연변이 특성으로 표시된 접착.
오가노이드 바이오뱅킹 중 효율적인 의사결정을 위해 몇 가지 중요한 방법론적 사항도 고려해야 합니다. 오가노이드 성장 잠재력은 오가노이드 직경의 증가에 의해서만 결정되는 것이 아닙니다. 또한 표현형 특성은 색상, 어두움 및 윤곽 무결성과 같은 확장 가능성을 결정합니다. 세포질 스트레스 액포의 형성은 차선의 조건을 나타냅니다. 성장 및 오가노이드 형성 잠재력과 관련된 초기 문제는 부적절한 운송 조건과 조직 진행의 지연으로 인해 발생할 수 있습니다. 종양 라인 내에서 확장 잠재력의 높은 개체 간 변동성이 관찰되므로 성장 잠재력에 대한 최종 결정을 내리기 전에 최소 14일을 기다리는 것이 좋습니다. 다른 배지에서 유사한 성장 패턴이 처음에 관찰되면 여러 조건을 확장해야 합니다. 우리의 경험에 비추어 볼 때, 장기적으로 안정적인 성장 잠재력에 대한 명확한 구분은 종종 몇 주 또는 몇 달의 재배 후에만 가능합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66467/66467fig01.jpg"> 그림 1: 후속 오가노이드 생성을 위한 1차 분리체의 2D 간략한 파종의 이점. (A) 양방향, 병렬 시딩 전략을 보여주는 실험 레이아웃 구성: 2D/3D 및 4개의 다른 매체에서 직접 3D 시딩. (B) 트립신화 및 3D 전달 전의 부착된 1차 분리물의 이미지. (C) 병렬 파종(parallel seeding)이 2D/3D 경로의 분명한 이점을 드러낸 1차 광상의 예로, 장기 오가노이드 확장은 초기에 플라스틱에서 분리된 전구체에서만 가능했습니다. 왼쪽 상단 이미지는 왼쪽 아래 그림의 첫 번째 통로(P1이라고 함) 이후 오가노이드 형성이 충분하지 않은 통로 0(P0이라고 함)에서 분리 후 7일 후의 3D 배양을 보여줍니다. 플라스틱에 2D 파종( 그림 1B 참조)한 후 3D 배양으로 옮긴 후 P0에서 더 나은 오가노이드 형성이 이미 명백하며, 장기 확장 가능성은 통로 4(P4)에서 확인됩니다. 스케일 바 = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66467/66467fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66467/66467fig02.jpg"> 그림 2: 환자별 배지 요구 사항. 각각 다른 매체에서 자라는 4개의 서로 다른 장기적이고 안정적인 확장 라인의 예. 스케일 바 = 500μm. 약어: OCM = 난소암 배지; 그녀 = 헤레굴린 1β; HGSO = 고등급 장액성 난소암. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66467/66467fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66467/66467fig03.jpg"> 그림 3: 질병의 모든 단계에서 발생하는 오가노이드 생성. 원발성 질환 발현의 고등급 장액성 및 저등급 장액성 난소암, 간격 수술(선행 화학요법 후) 및 재발성 암 조직에서 장기적으로 안정적인 확장 라인의 이미지. 스케일 바 = 500μm. 약어: HGSOC = 고급 장액성 난소암; LGSOC = 저등급 장액성 난소암; NACT = 선행 화학 요법. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66467/66467fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66467/66467fig04.jpg"> 그림 4: 오가노이드와 부모 암 조직의 표현형이 밀접하게 일치합니다. (A) 암 조직과 (B) 쌍을 이루는 오가노이드 라인의 면역형광 염색에 대한 컨포칼 이미지는 모든 마커, EpCAM(녹색), PAX8(빨간색), TP53(자홍색)의 염색 패턴과 발현 수준에서 매우 높은 유사성을 보여줍니다. 스케일 바 = 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66467/66467fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 1: 이 프로토콜에 사용된 배지 및 분해 혼합물의 구성. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66467/66467_Table%201.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 프로토콜은 다양한 질병 단계의 난소암 오가노이드 확립을 위한 체계적인 프레임워크를 제공하고 환자별 변동성 문제를 해결하여 수율을 높이고 후속 응용 분야에서 강력한 장기 확장을 가능하게 합니다. 여기에는 조직 처리, 파종, 배지 요구 사항 조정 및 면역형광 염색을 위한 자세한 단계가 포함됩니다.

While the establishment of an ovarian cancer biobank from patient-derived organoids along with their clinical background information promises advances in ...

진행성 난소암 환자를 위한 최첨단 중개 연구에서 최고의 임상 관리는 우리 기관의 최우선 과제입니다. 환자 유래 오가노이드의 바이오뱅킹을 통해 우리는 개별 맞춤형 관리를 향한 큰 진전을 이루었습니다. 이를 통해 환자별 특성을 평가하고 예측 바이오마커를 식별할 수 있습니다.우리는 최근 몇 년 동안 진행성 난소암 환자에서 근치적 다내장 수술, 화학 요법, 항 혈관 신생 요법 및 PARP 억제제 요법을 개선하는 데 상당한 진전을 이루었으며 그럼에도 불구하고 생존율을 개선했습니다. 이제 다음 단계는 어떤 환자가 어떤 특정 치료의 혜택을 받을지 더 잘 예측하는 것입니다. 현재 임상 치료 결정은 일반적인 조직병리학적 특징과 상동 권장 결핍에 대한 정보를 기반으로 하거나 파라핀이 포함된 종양 조직에서 테스트합니다.화학요법 및 표적 치료에 대한 특이적 반응을 평가하는 생물학적 모델은 아직 임상에서 구현되지 않았습니다. 우리는 난소암 조직의 주요 특성, 특히 체외에서 재생 잠재력을 유지하는 데 필요한 배양 요구 사항을 확인했으며, 이 지식을 사용하여 오가노이드 라인의 강력한 장기 성장을 달성하고 질병의 다양한 단계에서 샘플에서 바이오뱅크를 구축합니다. 난소암 오가노이드의 바이오뱅킹에 대한 당사의 일상적인 경험은 이 악성 종양의 생물학에서 놀라운 이질성을 효과적으로 보여주며, 이는 새로운 분류로 가는 길을 열거나 STEMI의 잠재력을 표적으로 하는 새로운 치료 솔루션의 기초를 제공할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

3 차원 Heterotypic<em&gt; 체외에서</em난소 암 개시 및 진행하는 동안 Stromal - 상피 조직의 상호 작용&gt; 모델링

환자 유래 오가노이드 (PDO)는 질병의 유전 적 및 표현형 이질성과 개인화 된 항암 요법에 대한 반응을 모두 반영하는 번역 암 연구의 강력한 도구입니다. 여기서, 표현형 분석 및 약물 반응의 평가를 위한 준비로 인간 원발성 방광암 PDOs를 생성하기 위한 통합 프로토콜이 상세히 설명된다.

정밀 의학 도구로서의 방광암 오가노이드의 문화

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중개 의학을 위한 바이오뱅크: 최적의 시료 관리를 위한 표준 운영 절차

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면역형광 분석을 통한 환자 유래 난소암 오가노이드의 DNA 손상 복구 단백질 시각화

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환자 유래 유방 오가노이드의 확립 및 배양

환자 유래 난소암 오가노이드로 치료 약물 테스트를 수행하는 데 사용할 수 있는 프로토콜을 제시합니다.

전임상 약물 검사를 위한 난소암 환자 유래 오가노이드 모델

종양 오가노이드는 암 연구와 개인 맞춤형 의학에 대한 접근 방식에 혁명을 일으켰습니다. 이는 임상적으로 관련성이 높은 종양 모델을 나타내며 이를 통해 연구자들은 임상에서 종양보다 한 발 앞서 나갈 수 있습니다. 이 프로토콜은 신선한 췌장 종양 조직 샘플과 췌장 선암 기원의 환자 유래 이종이식에서 종양 오가노이드를 확립합니다.

췌장암 유래 종양 오가노이드 및 섬유아세포를 신선한 조직에서 확립

이 프로토콜은 근치적 전립선 절제술 표본에서 샘플 수집을 용이하게 하는 방법을 설명합니다. 목표는 해부병리학적 기준에 따라 표본의 조직 샘플을 Biobank에 저장하기 전에 매핑, 특성화 및 미시적 매크로 절개하는 것입니다.

개선된 샘플링 기법 및 조직학적 특성 분석을 통한 전립선 종양 바이오뱅킹 신뢰성 향상

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조직 재생을 연구하기 위한 플랫폼으로서의 인간 난소 표면 상피 오가노이드

이 프로토콜은 시험관 내 및 생체 내에서 고급 장액성 난소 암종(HGSOC) 마우스 모델의 개발을 자세히 설명합니다. 쥐 나팔관 오가노이드의 파생, 인간 HGSOC 유전학을 요약하기 위한 유전자 변형, 종양의 생체 내 발달을 위한 동계 마우스의 난소 활액낭에 도입.

고급 장액성 난소 암종 모델링을 위한 나팔관 상피 세포의 마우스 유래 오가노이드 라인 개발

학습하세요 난소암 오가노이드 바이오뱅킹 프로토콜을 통해 환자별 이질성을 해결하고 장기 배양을 가능하게 하는 방법을. 이 기술은 맞춤형 치료와 예측 바이오마커 발굴에 활용됩니다.

난소암 오가노이드의 바이오뱅킹 전략: 조직학적 아형 및 질병 단계에 걸친 환자 간 이질성 해결

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