High-Speed Atomic Force Microscopy Imaging of DNA Three-point-Star Motif Self Assembly Using Photothermal Off-Resonance Tapping(광열 오프-레조넌스 태핑을 이용한 DNA 3점-별 모티프 자기 조립)

우리 실험실에서는 나노 단위 생물학을 위한 새로운 측정 기술을 개발합니다. 특히 우리는 나노미터 규모에서 역동적인 생물학적 과정을 연구하기 위한 고속 원자력 현미경 개발에 중점을 두고 있습니다. 이를 위해 우리는 최근 Photothermal Off Resonance Tapping 또는 PORT라고 하는 새로운 이미징 모드를 개발했습니다.

이 모드에서는 전용 드라이브 레이저를 사용하여 고속으로 제어되는 캔틸레버를 작동시키므로 기존의 오프 공진 탭핑보다 최대 두 배 더 빠르게 데이터와 데이터를 얻을 수 있습니다. 고속 AFM의 황금 표준은 공진 모드 이미징입니다. 이 모드에서 캔틸레버는 이 공진 주파수에서 작동하며, 이는 캔틸레버 위치를 제어할 수 없고 진동 진폭만 제어할 수 있음을 의미합니다.

정상 속도 AFM의 경우 오프 공진 모드가 점점 더 보편화되고 있습니다. 그러나 여기서는 작동 주파수가 제한되어 이 이미징 모드가 매우 느립니다. 보조 레이저를 사용하여 캔틸레버를 작동시킴으로써, 우리는 더 높은 작동 주파수를 달성할 수 있으며, 이는 더 높은 이미징 속도를 의미합니다.

이 접근 방식을 통해 다른 오프 공진 인력 배치 모드와 관련된 이점을 유지할 수 있으며, 이는 이미징 감도와 속도 간의 균형을 최적화할 수 있음을 의미합니다. 우리는 가장 높은 인물 사진에 의해 이미징 속도가 제한됩니다. 세로를 높이려면 동일한 작동 진폭을 유지하기 위해 레이저 출력을 높여야 합니다.

이로 인해 힘 제어가 제대로 되지 않고 샘플이 손상될 수 있습니다. 캔틸레버의 크기를 줄이고 레이저 흡수 효율을 개선하여 캔틸레버의 대역폭을 향상시키면 적절한 샘플 클리어런스를 보장하면서 더 높은 포트 속도를 얻을 수 있습니다. 이러한 발전은 어셈블리 역학의 복잡성을 검사하는 데 중요한 이미징 속도를 더 빠르게 할 것입니다.

시작하려면 캔틸레버를 청소하고 준비합니다. 주사 전자 현미경 또는 SEM 시스템과 호환되는 홀더에 캔틸레버를 장착합니다. 그런 다음 가스 주입 시스템에 사용할 전구체 가스를 가열하여 새 팁을 성장시킵니다.

진공이 10 미만에서 음의 5mbar의 전력에 도달하면 가스 주입 라인을 각각 2초 동안 10회 퍼지하여 노즐 라인에 남아 있는 공기를 제거합니다. SEM을 사용하여 캔틸레버의 끝을 찾습니다. 원자력 현미경 이미징을 위해 캔틸레버를 올바르게 정렬하기 위해 홀더를 비스듬히 기울이십시오.

탄소 나노 팁이 자랄 캔틸레버 팁을 명확하게 볼 수 있도록 SEM의 위치와 초점을 조정합니다. 다음으로, 소프트웨어에서 증착 매개변수를 설정하여 새 팁을 성장시킵니다. 전구체 가스를 주입하는 동안 캔틸레버 팁에 전자빔의 방사선으로 팁을 성장시키는 증착 프로세스를 시작하고 증착이 완료되면 가스 주입을 중지합니다.

성장 후 SEM 이미징을 수행하여 반경 및 길이를 포함하여 새로 자란 팁의 품질과 특성을 평가합니다. SEM 챔버에서 홀더를 제거합니다. 먼저 고속 원자력 현미경을 준비합니다.

핀셋을 사용하여 캔틸레버 홀더의 스프링 클립 아래에 매우 짧은 캔틸레버를 놓습니다. 주사기를 사용하여 왼쪽 유체 액세스 포트를 통해 50마이크로리터의 액체를 추가합니다. 그런 다음 AFM 헤드에 있는 세 개의 손잡이를 사용하여 캔틸레버의 판독 레이저를 정렬합니다.

합계를 최대화하면서 흰 종이에 있는 캔틸레버의 그림자를 관찰하십시오. 그런 다음 두 개의 전용 손잡이를 사용하여 레이저 스폿을 포토 다이오드의 중앙에 놓습니다. 다음으로, Excitation VI에서 Excitation Enabled 상자를 선택하여 전원을 켜고 드라이브 레이저를 정렬하여 캔틸레버를 작동 및 진동시킵니다.

캔틸레버 여기 및 편향 신호를 오실로스코프에 표시합니다. 그림자 방법을 사용하고 구동 레이저 조정 노브로 진동 진폭을 최대화하십시오. 포트에서 캔틸레버 발진 진폭을 조정하려면 여기 VI의 구성 상자에 있는 레이저 다이오드 제어 회로에 DC 전압을 추가하고 레이저 다이오드 제어 회로에 대한 피크 대 피크 AC 입력을 입력합니다.

상호 작용 곡선을 얻으려면 Z 컨트롤러 VI를 접촉 모드로 설정하고 시작을 클릭하여 샘플 표면에 접근합니다. 표면에 도달하면 캔틸레버 편향 감도 보정을 위해 램프 VI에서 힘 대 거리 곡선을 수행합니다. 철회를 클릭하여 팁이 도달할 수 없는 표면에서 Z 피에조를 후퇴시킵니다.

완전히 철회 한 후 Z 컨트롤러 VI에서 포트 모드로 전환하고 여기 VI에서 여기 레이저를 켭니다. 포트 모드를 원하는 주파수로 설정하십시오. 비파괴 생체 시료 이미징에 중요한 접촉 진동에서 자유 진동을 빼서 명확한 상호 작용 곡선을 얻었습니다. 100킬로헤르츠 포트 속도에서 우수한 이미징 품질을 달성했습니다.

그러나 여기 주파수가 캔틸레버 공진에 가까워짐에 따라 피드백 제어가 저하되어 상호 작용 곡선이 모호해지고 이미지 품질이 저하되었습니다. 시작하려면 10 밀리 몰의 마그네슘 아세테이트 용액을 준비하십시오. 해밀턴 주사기를 사용하여 50마이크로리터의 용액을 캔틸레버 홀더의 유체 채널에 주입하여 캔틸레버를 둘러싸는 액체 방울을 만듭니다.

스캔 VI의 스캔 크기를 800 x 800 나노미터로 설정하고 라인 속도를 100 헤르츠로 설정합니다. 표면을 스캔하려면 프레임 화살표를 클릭하여 품질을 확인합니다. 스캔 후 Z 컨트롤러 VI에서 withdraw를 클릭하여 표면에서 캔틸레버를 집어넣습니다.

해밀턴 주사기를 사용하여 캔틸레버 홀더에서 완충 용액을 제거합니다. 그런 다음 희석된 DNA 3점 별 용액을 준비하고 이 용액 50마이크로리터를 캔틸레버 홀더에 주입합니다. 800 x 800 나노미터 영역의 기본 라인 속도인 100 Hz로 이미징을 수행합니다.

초기 스캔 후 이미징 크기와 속도를 조정하고 추가 데이터 수집을 위해 VI를 지정된 값으로 스캔합니다.Z 컨트롤러 VI 설정값 상자의 설정점에 대한 입력을 이미징 프로세스 전반에 걸쳐 정확한 추적에 필요한 가장 낮은 수준으로 유지합니다. 필요한 모든 샘플 영역에 대해 이 작업을 반복합니다. 이 프로토콜을 사용하여 고속 포트 AFM에 의해 DNA 3점 별 모티프가 안정적인 섬으로 실시간 조립되는 것을 관찰했습니다.

선명한 이미지는 100kHz 포트 속도에 대해 100 및 200 헤르츠 라인 속도에서 얻어졌습니다. 그러나 포트 속도를 높이지 않고 이미징 속도를 높이면 빠른 지형 변화로 인해 이미지 품질이 저하되었습니다. 가장 낮은 피크 대 피크 AC 입력에 대한 DNA 3점 별의 이미징 결과는 손상되지 않은 구조를 보여주었고 가장 높은 피크 대 피크 AC 입력은 더 높은 힘으로 인해 관찰 가능한 샘플 손상을 초래했습니다.

마찬가지로, 가장 낮은 DC 오프셋 입력은 손상되지 않은 구조를 드러낸 반면 가장 높은 DC 오프셋 입력은 구조적 손상을 일으켰습니다.