Name: Puncture Wound Hemostasis and Preparation of Samples for Montaged Wide-Area Electron Microscopy Analysis (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 41 s
Description: 배우세요 쥐 모델에서 천자 상처를 이용한 혈전 형성 및 지혈 메커니즘을 연구하는 방법을. 대면적 전자현미경을 활용해 혈소판 활성화와 혈전 구조를 고해상도로 분석할 수 있습니다.

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<meta charset="utf8"></head><body>Puncture Wound Hemostasis 및 Montaged Electron Microscopy (펑크 상처 지혈 및 몽타주 전자 현미경)

<ol><li>Rhee, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Venous+puncture+and+wound+hemostasis+results+in+a+vaulted+thrombus+structured+by+locally+nucleated+platelet+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Comm+Biol%22%5BJournal%5D)">Venous puncture and wound hemostasis results in a vaulted thrombus structured by locally nucleated platelet aggregates.</a> Comm Biol. 4 (1), 1090(2021).</li>
<li>Pokrovskaya, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tethered+platelet+capture+provides+a+mechanism+for+restricting+circulating+platelet+activation+in+the+wound+site%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Pract+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Tethered platelet capture provides a mechanism for restricting circulating platelet activation in the wound site.</a> Res Pract Thromb Haemost. 7 (2), 100058(2023).</li>
<li>Yadav, S., Storrie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+basis+of+platelet+secretion%3A+emerging+structure%2Ffunction+relationships%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">The cellular basis of platelet secretion: emerging structure/function relationships.</a> Platelets. 28 (2), 108-118 (2017).</li>
<li>Joshi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ferric+chloride-induced+arterial+thrombosis+and+sample+collection+for+3D+electron+microscopy+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Ferric chloride-induced arterial thrombosis and sample collection for 3D electron microscopy analysis.</a> J Vis Exp. (193), e64985(2023).</li>
<li>Guerrero, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+von+Willebrand+factor%2Fglycoprotein+Ib-IX+axis+with+a+platelet-type+von+Willebrand+disease+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Visualizing the von Willebrand factor/glycoprotein Ib-IX axis with a platelet-type von Willebrand disease mutation.</a> Blood. 114 (27), 5541-5546 (2009).</li>
<li>Kato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+glycoprotein+VI+to+stable+platelet+adhesion+and+thrombus+formation+illustrated+by+targeted+gene+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The contribution of glycoprotein VI to stable platelet adhesion and thrombus formation illustrated by targeted gene deletion.</a> Blood. 102 (5), 1701-1707 (2003).</li>
<li>Tomaiuolo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrelationships+between+structure+and+function+during+the+hemostatic+response+to+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+NatlAcad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Interrelationships between structure and function during the hemostatic response to injury.</a> Proc NatlAcad Sci U S A. 116 (6), 2243-2252 (2019).</li>
<li>Cocchiaro, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+lipid+droplets+are+translocated+into+the+lumen+of+the+Chlamydia+trachomatis+parasitophorous+vacuole%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic lipid droplets are translocated into the lumen of the Chlamydia trachomatis parasitophorous vacuole.</a> Proc Natl Acad Sci. 105 (27), 9379-9384 (2008).</li>
<li>Pokrovskaya, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlamydia+trachomatis+hijacks+intra+-+Golgi+COG+complex+-+dependent+vesicle+trafficking+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Chlamydia trachomatis hijacks intra - Golgi COG complex - dependent vesicle trafficking pathway.</a> Cell Microbiol. 14 (5), 656-668 (2012).</li>
<li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements%5BTitle%5D)+AND+%22J+Str+Biol%22%5BJournal%5D)">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> J Str Biol. 152 (1), 36-51 (2005).</li>
<li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22J+Str+Biol%22%5BJournal%5D)">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> J Str Biol. 116 (1), 71-76 (1996).</li>
<li>Chan, N. C., Eikelboom, J. W., Weitz, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolving+treatments+for+arterial+and+venous+thrombosis%3A+role+of+the+direct+oral+anticoagulants%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Evolving treatments for arterial and venous thrombosis: role of the direct oral anticoagulants.</a> Circ Res. 118 (9), 1409-1424 (2016).</li>
<li>Kiernan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde%2C+formalin%2C+paraformaldehyde%2C+and+glutaraldehyde%3A+what+they+are+and+what+they+do%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Today%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde, formalin, paraformaldehyde, and glutaraldehyde: what they are and what they do.</a> Microscopy Today. 8 (1), 8-13 (2000).</li>
<li>Storrie, B., Attardi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+mitochondrial+genome+in+HeLa+cells%3A+XV.+Effect+of+inhibition+of+mitochondrial+protein+synthesis+on+mitochondrial+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+CellBiol%22%5BJournal%5D)">Expression of the mitochondrial genome in HeLa cells: XV. Effect of inhibition of mitochondrial protein synthesis on mitochondrial formation.</a> J CellBiol. 56, 819-831 (1973).</li>
<li>Liu, S., Pokrovskaya, I. D., Storrie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+-+pressure+freezing+followed+by+freeze+substitution%3A+an+optimal+electron+microscope+technique+to+study+Golgi+apparatus+organization+and+membrane+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">High - pressure freezing followed by freeze substitution: an optimal electron microscope technique to study Golgi apparatus organization and membrane trafficking.</a> Meth Mol Biol. 2557, 211-223 (2023).</li>
<li>Klarhofer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+blood+flow+velocity+measurements+in+the+human+finger%5BTitle%5D)+AND+%22Mag+Res+Med%22%5BJournal%5D)">High-resolution blood flow velocity measurements in the human finger.</a> Mag Res Med. 45 (4), 716-719 (2001).</li>
<li>Chaudry, R., Miao, J. H., Rehman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology%2C+cardiovascular%5BTitle%5D)+AND+%22StatPearls%22%5BJournal%5D)">Physiology, cardiovascular.</a> StatPearls. , Treasure Island, FL, USA. (2022).</li>
<li>Pokrovskaya, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNARE+-+dependent+membrane+fusion+initiates+a-granule+matrix+decondensation+in+mouse+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Adv%22%5BJournal%5D)">SNARE - dependent membrane fusion initiates a-granule matrix decondensation in mouse platelets.</a> Blood Adv. 2 (21), 2947-2958 (2018).</li>
<li>Pokrovskaya, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+ultrastructural+analysis+of+a-granule%2C+dense+granule%2C+mitochondria%2C+and+canalicular+system+arrangement+in+resting+human+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Pract+Thrombosis+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">3D ultrastructural analysis of a-granule, dense granule, mitochondria, and canalicular system arrangement in resting human platelets.</a> Res Pract Thrombosis Haemostasis. 4 (1), 72-85 (2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0.9% 생리식염</td>수 <td>Medline</td><td>BHL2F7123HH</td><td></td></tr><tr><td>27G x 3/4 EXELint 두피 정맥 세트</td><td>Medline</td><td>NDA26709</td><td></td></tr><tr><td>30G x 1/2 EXELint 피하 주사 바늘</td><td>Medline</td><td>NDA264372</td><td></td></tr><tr><td>33G x 1/2 EXELint 특수 피하 주사 바늘</td><td>Medline</td><td>NDA26393</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 원뿔형 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-443-20</td><td></td></tr><tr><td>알코올 준비 패드 (70 % 이소 프로필 알코올)</td> <td>Medline</td><td>MDS090670Z</td><td></td></tr><tr><td>알루미늄 호일</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-213-100</td><td></td></tr><tr><td>동물 가열판</td><td>Physitemp 기기</td><td>HP-1M</td><td></td></tr><tr><td>Araldite GY 502</td><td>전자 현미경 과학</td><td>10900</td><td></td></tr><tr><td>Axiocam 305 컬러 R2 현미경 카메라</td><td>Carl Zeiss 현미경</td><td>426560-9031-000</td><td></td></tr><tr><td>BD Luer-Lok 주사기, 20 mL</td><td>Medline</td><td>B-D303310Z</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 접시 35mm x 10mm</td><td>Corning Inc.</td><td></td><td></td>430165</tr><tr><td>코튼 팁 애플리케이터</td><td>Medline</td><td>MDS202055H</td><td></td></tr><tr><td>DMP-30 활성제</td><td>전자 현미경 과학</td><td>13600</td><td></td></tr><tr><td>도데세닐 숙신산 무수물/DDSA</td><td>전자 현미경 과학</td><td>13700</td><td></td></tr><tr><td>드레싱 집게, 5", 곡선, 톱니, 좁은 팁</td><td>Integra Miltex</td><td>6-100</td><td></td></tr><tr><td>드레싱 집게, 5", 표준, 톱니 모양의</td><td>Integra Miltex</td><td>6-6</td><td></td></tr><tr><td>EMBED 812 수지</td><td>전자 현미경 과학</td><td>14900</td><td></td></tr><tr><td>에틸 알코올, 무수 200 증거</td><td>전자 현미경 과학</td><td>15055</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 4-Way Tube Rack</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-448-17</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 디지털 타이머</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-649-17</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 단일 주사기 주입 펌프</td><td>Fisher Scientific</td><td>7801001</td><td></td></tr><tr><td>거즈 스폰지 2" x 2"- 4 Ply</td><td>Medline</td><td>NON26224H</td><td></td></tr><tr><td>글루타르알데히드 (10% 용액)</td><td>전자 현미경 과학</td><td>16120</td><td></td></tr><tr><td>이소플루란 액체 흡입제 마취, 100 mL</td><td>Medline</td><td>66794-017-10</td><td></td></tr><tr><td>보석상 스타일 마이크로 파인 집게, 스타일 5F</td><td>Integra Miltex</td><td>17-305</td> 2쌍이 <td>필요합니다.</td></tr><tr><td>L/S 펌프 튜브, 실리콘, L/S 15; 25피트</td><td>VWR</td><td>MFLX96410-15</td><td></td></tr><tr><td>L-아스파르트산</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP374-100</td><td></td></tr><tr><td>질산납</td><td>Fisher Scientific</td><td>L-62</td><td></td></tr><tr><td>말라카이트 그린 4</td><td>전자 현미경 과학</td><td>18100</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S Easy-Load II 펌프 헤드</td><td>VWR</td><td>MFLX77200-62</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S 가변 속도 디지털 드라이브</td><td>VWR</td><td>MFLX07528-10</td><td></td></tr><tr><td>MSC Xcelite 5" 와이어 커터</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-191-9855</td><td></td></tr><tr><td>오스뮴 테트록사이드 4% 수용액</td><td>전자 현미경 과학</td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드(16% 용액)</td><td>전자 현미경 과학</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Physitemp 온도 컨트롤러</td><td>Physitemp Instruments</td><td>TCAT-2LV</td><td></td></tr><tr><td>칼륨 페로시안화물</td><td>시그마-알드리치</td><td>P-8131</td><td></td></tr><tr><td>프로필렌 옥사이드, ACS 시약</td><td>전자 현미경 과학</td><td>20401</td><td></td></tr><tr><td>파이렉스 유리 비커</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-555-25B</td><td></td></tr><tr><td>생쥐용 직장 온도 프로브</td><td>Physitemp Instruments</td><td>RET-3</td><td></td></tr><tr><td>스카치 매직 인비저블 테이프, 3/4" x 1000"</td><td>3M Company</td><td>305289</td><td></td></tr><tr><td>Cacodylate Sodium Cacodylate Buffer 0.2M, pH 7.4</td><td>전자 현미경 과학</td><td>11623</td><td></td></tr><tr><td>SomnoFlo 저유량 전자 기화기</td><td>Kent Scientific</td><td>SF-01</td><td></td></tr><tr><td>SomnoFlo 스타터 키트</td><td>마우스 Kent Scientific</td><td>SF-MSEKIT</td><td></td></tr><tr><td>스테인리스 스틸 Minutien Pins</td><td>Fine Science 도구</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>실체 현미경 steREO Discovery.V12</td><td>Carl Zeiss 현미경</td><td>495015-9880-010</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 실리콘 엘라스토머</td><td>세계 정밀 기기</td><td>SYLG184</td><td>실리콘 매트</td></tr><tr><td>Tannic Acid</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>21700</td><td></td></tr><tr><td>Thiocarbohydrazide (TCH)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>88535</td><td></td></tr><tr><td>Uranyl Acetate</td><td>전자 현미경 과학</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Spring Micro Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Von Graefe Eye Dressing Forceps, 2.75", 곡선, 톱니 모양의</td><td>Integra Miltex</td><td>18-818</td><td>2쌍이 필요합니다.</td></tr><tr><td>Wagner 가위</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>14068-12</td><td></td></tr><tr><td>Wahl MiniFigura 동물 트리머</td><td>Braintree Scientific</td><td>CLP-9868</td><td></td></tr><tr><td>Zen Lite 소프트웨어</td><td>Carl Zeiss 현미경</td><td>410135-1001-000</td><td></td></tr></tbody></table>

puncture wound hemostasis and preparation of samples for montaged wide-area electron microscopy analysis

Puncture Wound Hemostasis and Preparation of Samples for Montaged Wide-Area Electron Microscopy Analysis

천자 상처 출혈 시간에 대한 약물 효과의 정량화 천공 상처 출혈 시간은 마우스에서 쉽게 수행할 수 있는 약물 위험의 생리학적 모델을 제공합니다. 찔린 상처 실험에서 나온 결과는 예측적입니다. 여기에서, 우리는 dabigatran 용량-반응 출혈 곡선을 보여줍니다. 트롬빈 억제제인 다비가트란(Dabigatran)은 경구용 직접 작용 항응고제로 사용되며, 이를 DOAC12라고 합니다. 경정맥 천자 상처 모델은 마우스에서 지연된 혈전 형성을 통한 잠재적인 장기 출혈을 통해 다양한 용량의 다비가트란에 내재된 위험을 평가하는 데 사용되었습니다. 15, 50 또는 150 μg/kg의 다양한 용량의 다비가트란을 경정맥 천자 20분 전에 정맥 주사(i.v.)로 투여하였다. 우리는 dabigatran의 다양한 농도에서 출혈 시간 평균을 보여줍니다 (그림 4). 용량 수준에서, 출혈 시간의 유의한 연장이 관찰된다, p &lt;0.051. 이것은 인간에 있는 약의 사용에 있는 중요한 위험 요인을 나타냅니다. 실험적으로, 이러한 용량의 약물은 혈전 형성의 미세 구조에 상당한 영향을 미칩니다.
형성 천자 상처 혈전에서 혈소판 활성화 상태 평가 WA-TEM 접근법은 낮은 배율에서 볼 때 단일 평면에서 상처 부위의 개요와 높은 배율에서 많은 세부 정보를 제공합니다(그림 5). 얻은 세부 정보는 개요의 컨텍스트 내에 직접 배치할 수 있습니다. 우리는 이 접근법을 사용하여 원반형 혈소판이 천자 상처 혈전을 형성하는 것을 평가했습니다. 순환 혈소판은 원반형이므로 이름이 붙여졌으며 전체 분비 과립 세트를 포함하고 있습니다. 핵심 질문은 순환하는 혈소판이 어떻게 남아 있는 혈소판의 자유로운 흐름 특성을 방해하지 않고 성장하는 혈전에 동원될 수 있는가 하는 것이었습니다. 우리의 연구는 순환 혈소판이 테더링 과정을 통해 전체 세포 소기관 세트를 포함하는 원반형 혈소판으로 하나씩 혈전으로 모집되는 Tether and Activate 가설을 지적합니다2. 이에 대한 증거는 천자 후 1분 후 경정맥 혈전의 WA-TEM에서 비롯됩니다. 아직 출혈이 진행 중인 상처 중앙에서 완전한 혈전 절편을 얻기 위한 절편 후, SerialEM 소프트웨어10을 사용하여 자동화된 스테이지와 투과 전자 현미경을 사용하여 혈전의 전체 치수를 가로질러 직사각형 XY 래스터 그리드에서 500-800 프레임, 4,000 x 4,000 픽셀, 3.185 nm 픽셀 크기를 이미지화했습니다. 그런 다음 IMOD 프로그램 suite11의 일부인 eTomo 소프트웨어를 사용하여 프레임을 함께 연결했습니다. 그 결과 다양한 크기의 단일 이미지(예: 120,000 x 90,000 픽셀)가 IMOD 프로그램 제품군의 일부인 3DMOD 소프트웨어를 사용하여 낮은 줌(0.02)에서 전체 화면 또는 높은 줌(0.25-1.0)에서 세부 이미지가 생성됩니다(그림 5). 넷에서, 소프트웨어 기반 분석은 천자 구멍 내의 말초에 결합된 혈전 관련 원반형 혈소판이 끈의 구슬처럼 간격을 두고 있다는 것을 발견했습니다. 혈전 내에서 짧은 거리에서, 원반형 모양은 덜 뚜렷했고, 혈소판은 서로 더 밀접하게 연관되어 있었다. 혈전 내부 더 깊은 곳에서는 혈소판이 둥글고 단단히 포장되어 부분적으로 과립이 제거되었습니다. 일련의 형태학은 긴 테더 분자(아마도 폰 빌레브란트 인자)를 통해 혈소판이 혈전에 초기에 결합하는 것을 시사했으며, 추가적인 혈소판 활성화 단계는 혈전 형성의 내부로 제한되었습니다. 따라서 혈전으로의 혈소판 모집은 경정맥 내의 혈액 순환을 방해하지 않고 발생할 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66479/66479fig01.jpg"> 그림 1: 경정맥/대퇴 동맥 천자 상처 혈전 실험을 수행하기 위한 수술 설정. 수술 장비(A)와 기구(B)는 실험 중 타이밍이 중요하기 때문에 움직임의 효율성을 위해 신중하게 배치됩니다. (C) 관류 고정 후, 천자 상처 혈전이 포함된 혈관 부분을 광학 현미경으로 보면서 35mm 배양 접시의 실리콘 매트에 고정합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66479/66479fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66479/66479fig02.jpg"> 그림 2: 혈관에서 WA-TEM 또는 SBF-SEM을 위해 절단될 플라스틱 내장 샘플로 이동. (A) 천자 상처가 있고 축적된 혈관외 혈전(원과 화살표)이 있는 대퇴 동맥이 표시됩니다. (B) 혈전(원 및 화살표)은 후속 2D 이미징을 위한 마이크로톰과 함께 WA-TEM을 위한 절단을 위해 플라스틱에 내장되어 있습니다. (C) 혈전(원과 화살표)이 플라스틱에 내장되어 있으며, SBF-SEM 이미징 챔버 내의 핀에 부착하기 위해 1mm 미만의 짧은 막대기를 제공하도록 다듬어져 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66479/66479fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66479/66479fig03.jpg"> 그림 3: 천자에 의한 혈전 형성에 대한 천자: 천자 상처(A)에서 천자 후 1분 경정맥 혈전(B)의 이미지 절편까지의 분취 흐름 개략도. 혈관 벽은 이미지 조각에서 파란색으로 표시되고, 혈관 벽 근처의 작은 검은색 점은 적혈구이며, 혈전 혈소판 응집체는 짙은 회색 영역으로 나타납니다. 이 수치는1에서 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66479/66479fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66479/66479fig04.jpg"> 그림 4: 경정맥 천자 상처 실험에서 생성된 그래픽 형식의 데이터 예. 다비가트란 용량-반응 출혈 곡선이 보인다. 이 수치는1에서 수정되었습니다. 다양한 농도의 dabigatran에서 블리딩 시간 평균은 플러스 또는 마이너스 표준 편차를 나타내는 오차 막대와 함께 표시됩니다. 학생의 t-검정을 사용한 통계 분석은 p-값이 &lt;0.05로 나타났습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66479/66479fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66479/66479fig05.jpg"> 그림 5: 몽타주를 형성하기 위해 함께 스티칭된 슬라이스의 WA-TEM 이미지. (A) 개별 고해상도 프레임을 수집한 다음 더 큰 컨텍스트에 기능을 배치하기 위해 함께 연결합니다. (B) 확대하면 중요한 세부 사항을 상황에 맞게 나타낼 수 있습니다(폴리: 다형핵 백혈구, 엔도: 내피, 콜: 콜라겐 섬유). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66479/66479fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Hemostasis, the process of normal physiological control of vascular damage, is fundamental to human life. We all suffer minor cuts and puncture wounds ...

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

우리는 두뇌 섹션 sectioning 마우스, 제거 및 sectioning 뇌뿐만 아니라, immunoperoxidase의 얼룩, 수지 포함하고, ultrathin의 transcardiac 재관류에 대한 프로토콜을 설명합니다. 이러한 절차가 완료되면 immunostained 자료 전송 전자 현미경과 함께 시험에 대한 준비가되었습니다.

Immunoelectron 현미경을위한 마우스 뇌 조직의 준비

극저온 전자 현미경은 스캐닝 (SEM) 또는 전송 (TEM) 중 하나는, 널리 높은 수분 함량 1 생체 시료 또는 기타 자료의 특성에 사용됩니다. SEM / 집중 이온 빔 (FIB)는 샘플에 대한 관심의 기능을 식별하고 극저온 TEM에 전송을위한 얇은 전자 투명한 얇은 판을 추출하는 데 사용됩니다.

집중 이온 빔의 극저온 전자 현미경 표본 준비하여 의미

이 프로토콜의 목표는 자연 피부와 유사한 3차원 전체 두께 피부를 구축하는 것입니다. 특별히 제작된 자동 상처 제거 장치를 사용하면 무균 상태를 유지하면서 정확하고 재현 가능한 상처를 생성할 수 있습니다.

3 차원 전체 두께 피부의 세대 동등한 및 자동화 부상

여기에 표시된 것은 탈세포화된 심장 조직에서 세포외 기질 미세 구조를 시각화하는 방법입니다.

침연 (macerated) 조직의 전자 현미경을 스캔하면 세포 외 매트릭스를 시각화하기

악기 및 전송 전자 현미경 검사 법에 대 한 nanoliter 크기의 샘플 볼륨의 준비를 위한 방법 제공 됩니다. 아무 종이 blotting 단계 필요, 따라서이 단백질, 크게 샘플 손실을 감소 시키고 단일 세포 lysate 시각적 proteomics에 대 한 분석을 사용에 대 한 가질 수 해로운 결과 피하는.

전송 전자 현미경 검사 법에 대 한 소형된 샘플 준비

여기에 우리가 두 개의 샘플 처리 기술, 냉동 고압을 결합에 대 한 프로토콜을 현재 그리고 전자 레인지를 이용한 샘플 처리, 집중 된 이온 빔 스캐닝 전자 현미경 (SEM 거짓말)와 데이터 획득에 대 한 포함 하는 최소한의 수 지. 이 마우스 tibial 신경 샘플와 꼬마 선 충을 사용 하 여 보여 줍니다.

고압 냉동, 전자 레인지를 이용한 콘트라스트 향상, 그리고 볼륨 이미지에 대 한 포함 하는 최소한의 수 지에 의해 생물학 견본 준비

여기에서, 우리는 마우스에 있는 대장 내시경 유도핀치 생검을 유도하고 실시간으로 상처 폐쇄를 추적하는 절차에 대한 상세한 설명을 제공합니다. 또한, 상처 침대의 조직학적, 면역 조직 화학 및 분자 분석을 위한 조직의 제조를 위한 방법이 제공됩니다.

마우스에서 대장 내 시경 유도 핀치 생검을 수행하고 후속 조직 변화를 평가

이 프로토콜은 마우스에서 양자, 전체 두께 절제적 상처를 생성하는 방법과 이후에 형태 분석을 위해 상처를 모니터링, 수확 및 준비하는 방법을 설명합니다. 여기에는 직렬 조직학적 섹션을 사용하여 형태학적 결함을 정의하고 정확하게 정량화하고 감지하는 방법에 대한 심층적인 설명이 포함되어 있습니다.

뮤린 흥분 상처 치유 모델 및 조직학적 형태화 상처 분석

여기서, 우리는 투과 전자 현미경 검사법(TEM)을 사용하여 시투에서 거대 카르요세포의 초구조를 분석하는 프로토콜을 제시한다. 뮤린 뼈 졸은 수집, 고정, 에폭시 수지에 내장및 초박형 섹션에서 절단됩니다. 대조 염색 후, 골수는 120 kV에서 TEM 현미경으로 관찰된다.

시투에서 전염 전자 현미경 검사를 사용하여 뮤린 메가 카요포이스의 탐사

본 프로토콜은 동맥 혈전증을 유도하기 위해 FeCl3 매개 손상을 사용하는 방법, 및 전자 현미경 분석을 위해 혈전증의 다양한 단계에서 동맥 손상 샘플을 수집하고 준비하는 방법을 설명합니다.

염화제이철 유발 동맥 혈전증 및 3D 전자 현미경 분석을 위한 시료 수집

배우세요 쥐 모델에서 천자 상처를 이용한 혈전 형성 및 지혈 메커니즘을 연구하는 방법을. 대면적 전자현미경을 활용해 혈소판 활성화와 혈전 구조를 고해상도로 분석할 수 있습니다.

Puncture Wound Hemostasis and Preparation of Samples for Montaged Wide-Area Electron Microscopy Analysis

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