Name: 개별 다기능성 세포의 동시 및 순차적 사이토카인 분비를 해결하기 위한 미세유체 접근법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-08T14:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: 학습하세요 단일 세포 수준에서 사이토카인 분비를 정량적으로 측정하는 미세유체 플랫폼을 사용하여 면역 반응의 다기능성을 연구하는 방법을. 이 기술은 IL-6, TNF-α, IL-1β의 동시 검출을 가능하게 합니다.

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<meta charset="utf8"></head><body>single-cell cytokine secretion 분석을 위한 미세유체 액적 분석

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감염은 종종 선천면역계와 후천면역계를 포함하는 복잡한 숙주 반응을 일으킵니다 1,2. 감염 또는 감염원의 인식에 따라, 숙주 세포는 다양한 범위의 화학요법 및 사이토카인을 생산할 수 있으며, 이는 중요한 전달자(critical communicator)로 알려진 작은 단백질이며 면역 체계의 조절제(modulatory of immune system)로 알려져 있다3. 전염증성 사이토카인은 감염 시 조기에 분비되어 면역 반응을 시작하고, 이후 항염증성 사이토카인이 분비되는데, 이는 조직 손상과 그에 따른 만성 또는 자가염증성 질환을 예방하는 데 중요합니다. 위협 제거와 조직 보호 사이의 이러한 균형은 감염 중에 다양한 기능을 발휘하는 사이토카인의 광범위한 레퍼토리로 나타나 반응을 미세 조정할 수 있습니다 4,5. 이 혼합물 내에서는 병원체와 병원체가 유도하는 신호, 조직 위치 및 병원체가 발생하는 면역 세포에 따라 고유한 서명을 관찰할 수 있습니다. 그러나 사이토카인 방출은 또한 분비 역학 및 개별 반응이 다양한 각 세포 집단에 고유한 다기능 생물학적 과정을 구성하는 것으로 보입니다. 이러한 이질성은 수년 동안 문헌에 기술되어 왔으며, 예를 들어 T세포 하위집단(T-cellsubpopulations)6,7에서 자가염증성 질환 및 중증 COVID-19 감염에 대한 조사에서 환자 내 및 환자 간 염증 마커의 기능적 다양성이 큰 것으로 나타났습니다 8,9. 최근에는 단세포 염기서열분석(single-cell sequencing)의 출현으로 이전에는 나타나지 않았던 면역 미세환경 내 하위 집단 간의 높은 가소성과 누화(crosstalk)가 부각되었으며, 이는 이러한 이질성을 포착하기 위해 단세포 분석법이 필요하다는 것을 나타냅니다10,11. 전사체를 분석하기 위한 새로운 방법이 개발되고 있지만, 단일 세포 수준에서 단백질 분비에 대한 동시, 정량 및 시간 분해 측정이 필요하기 때문에 표현형 분석은 여전히 어려운 과제입니다. 이러한 측정을 통해 레퍼토리 또는 사이토카인 패널에 대한 분비 세포 정체성, 역학 및 분비 패턴(느림/빠름, 초기/늦음, 동시/순차)을 조사할 수 있습니다. 면역 반응 중 사이토카인 방출의 역학을 정량적 및 시간적 해상도로 연구할 수 있게 함으로써 도출된 통찰력을 통해 세포 앙상블과 유도 반응을 이해할 수 있습니다.
표준 프로토콜에서 사이토카인은 일반적으로 효소 결합 면역 흡착 분석법(ELISA)을 사용하여 세포 현탁액 및 혈청의 상층액에서 검출되어 대량 분비량을 생성합니다. 벌크 측정은 각 세포에서 생성되는 사이토카인 양의 정량화를 허용하지 않으며, 이는 특히 이질적인 세포 샘플에서 두드러지는 문제입니다. 세포 내 사이토카인 염색, 효소 결합 면역스팟(ELISpot) 분석 또는 마이크로 조각 분석(예: Isoplexis)과 같은 대체 방법은 개별 세포에서 발현되는 사이토카인을 검출하지만 종말점 측정만 제공합니다12,13. 이는 배양 시간 동안 세포 분비 패턴에서 발생할 수 있는 분비 역학 및 변화가 무시된다는 것을 의미합니다. 또한 종말점 측정은 동시 사이토카인 분비와 순차적 사이토카인 분비를 구별할 수 없기 때문에 이러한 방법을 사용하여 사이토카인 분비에서 면역 세포의 동시 다기능성의 실제 범위는 불분명합니다.
단일 세포 수준14,15에서 고유한 사이토카인 분비 표현형에 대한 면역 세포를 연구하기 위해 액적 미세유체역학을 사용하여 피코리터 크기의 물리적 구획을 생성하고 처리하여 단일 세포 분리능을 달성할 수 있습니다. 이러한 구획은 수중유 에멀젼으로 구성되며 미세유체 칩(16,17)을 사용하여 생성할 수 있습니다. 실제로, 액적 기반 미세유체 분석은 단일 세포 수준에서 다양한 생물학적 시료 및 레퍼토리를 분석하고 업스트림(세포 및 시약 처리) 및 다운스트림 프로세스(단일 세포 분류, 단백질체학 또는 시퀀싱)와의 통합을 가능하게 하는 데 있어 매우 다재다능함을 보여주었습니다18,19,20,21,22. 특히, 액적 고정화를 허용하는 설정을 통해 시간 경과에 따른 단일 세포 기능을 측정할 수 있으며, 이는 단백질 분비 분석에 유용합니다18. 또한, 다중화된 정량 분석을 통합하면 이전에는 접근할 수 없었던 차원에서 공동 분비 및 다기능 면역 세포의 식별과 같은 프로세스에 대한 추가 조사를 용이하게 할 수 있습니다23,24.
이 프로토콜에서는 개별 세포에서 병렬로 최대 3개의 사이토카인의 분비를 검출, 정량화 및 시간적으로 측정하기 위한 고정화된 액적 기반 단일 세포 워크플로우를 설명합니다(17,23). 이 기술은 20,000개 이상의 세포에서 사이토카인 반응을 병렬로 모니터링할 수 있는 기능을 제공합니다.
제시된 워크플로우는 단일 면역 세포와 기능성 나노입자를 60pL 유중수(water-in-oil) 방울로 미세유체 캡슐화로 구성합니다. 관찰 챔버에서 &gt;100,000개의 액적을 고정화하고 시간 분해 형광 현미경을 통해 각 액적과 각 사이토카인 내에서 사이토카인 분비 역학을 측정할 수 있습니다(그림 1A). 액적 내의 각 개별 세포에 대해 사이토카인 분비는 샌드위치 면역분석법으로 측정되며, 여기서 특정 포획 항체로 기능화된 자성 나노입자가 분비된 사이토카인과 결합하여 형광 표지된 검출 항체의 후속 재배치 및 결합을 유도합니다(그림 1B, C). 비드라인은 자성 나노입자를 정렬하여 형성되며, 사이토카인의 존재 하에 형광 재배치를 정량화할 수 있습니다. 여기서, 형광 재배치는 비드라인에서 발견되는 평균 형광 강도를 나머지 액적의 평균 형광 강도로 나눈 값으로 정의됩니다. 이 분석은 서로 다른 기능화된 나노입자 배치와 서로 다른 형광 채널(23)에서 표지된 각각의 검출 항체를 혼합하여 여러 사이토카인에 대해 다중화할 수 있으며, 그 결과 서로 다른 채널에서 특정 형광 재배치가 발생합니다. 맞춤형 분석 스크립트의 도움으로 형광 재배치 값을 추출할 수 있으며, 이미지를 모든 개별 세포 및 사이토카인에 대한 분비 동적 프로파일로 변환할 수 있습니다. 따라서 결과 데이터 세트는 시간 경과에 따른 정량적 분비 측정, 공동 분비 하위 집단의 식별, 분비된 양, 속도 및 사이토카인의 조합에 따른 세포 분포와 같은 수많은 판독값을 제공합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66492/66492fig01.jpg"> 그림 1: 워크플로우 및 분석 원리. (A) 자극 후 사이토카인 분비 세포를 분석하기 위한 워크플로우 개요. 단일 세포 현탁액 및 자성 나노 입자를 준비하고 60pL 용량의 오일/물 에멀젼(액적)으로 캡슐화합니다. 액적을 고정하고 나노 입자를 자기장 내부에 정렬한 후 30분마다 최대 4시간 동안 측정합니다. 마지막으로, 이미지를 분석하고 모든 액적, 타임포인트 및 형광 채널에 대한 파라미터를 추출합니다. 이 수치는17에서 수정되었습니다. (B) 액적 샌드위치 생물학적 검정의 원리. 기능화된 나노입자는 분비된 사이토카인(cytokine)과 결합하여 형광 표지된 검출 항체를 나노입자로 재배치합니다. 이러한 형광의 재배치는 재조합 사이토카인(recombinant cytokines)으로 수행된 보정 실험을 통해 정량화되고 검증됩니다. 서로 다른 기능성 나노입자를 혼합하면 최대 3개의 사이토카인을 동시에 다중 측정할 수 있습니다. (C) 세포 기반 실험에서는 측정 시간 동안 액적을 추적하고 나노 입자에 대한 형광 재배치의 시간이 지남에 따라 증가하여 세포를 분비하는 것을 식별합니다. 회로도는 규모에 맞지 않습니다. BioRender.com 로 만든 그림입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66492/66492fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>008-FluoroSurfactant</td><td>RAN Biotechnologies</td><td>008-FluoroSurfactant-10G</td><td></td></tr><tr><td>2-Stream flow-focusing droplet maker, 30 &micro; m 노즐, PFOS 소수성 표면 처리</td><td>Wunderli 칩</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 NHS Ester&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>A20006</td><td></td></tr><tr><td>https://www.thermofisher.com/ch/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/labeling-chemistry-protocols/fluorescent-amine-reactive-alexa-fluor-dye-labeling-of-igm-antibodies.html Anti-Human IL-1&beta; (단클론 마우스), AF647 라벨링 사내</td><td>PeproTech</td><td>500-M01B</td><td></td></tr><tr><td>ARcare92524 양면 접착 테이프</td><td>Adhesvies Reasearch</td><td>ARcare92524</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Adembeads Streptavidin plus 300nm</td><td>Ademtech</td><td>Cat#03233</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylated Goat Anti-Human IL-1&beta;</td><td>PeproTech</td><td>500-P21BGBT</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>세포 스크레이퍼</td><td>TPP</td><td>99002</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace 바이올렛 세포 증식 키트</td><td>Invitrogen</td><td>C34557</td><td>세포 염색 용액</td></tr><tr><td>Chromafil Xtra PTFE-45/25 주사기 필터</td><td>Macherey-Nagel</td><td>729205</td><td></td></tr><tr><td>Costar 6-well Clear Flat 하단 초저 첨부</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>Countess 세포 계수 챔버 슬라이드</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>D-Biotin</td><td>Fluorochem</td><td>M02926</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>14196-094</td><td></td></tr><tr><td>epT.I.P.S.&nbsp; 표준 2-200 & 마이크로; </td><td>l Eppendorf</td><td>30000889</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산 디소듐 염 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3690</td><td></td></tr><tr><td>EZ-LINK-NHS-PEG4-Biotin</td><td>ThermoFisher</td><td>A39259</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/20217</td></tr><tr><td>FcR 차단 시약, 인간</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>편리한 주방 세제</td><td>Migros</td><td>5.01002E+11</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>HFE-7500 오일 3M TM Novec</td><td>Fluorochem</td><td>B40045191</td><td></td></tr><tr><td>Idex F-120 핑거타이트 원피스 피팅, 표준 널, 천연 PEEK, 1/16" OD 튜빙, 10-32 원뿔</td>형 <td>콜-파머</td><td>GZ-02014-15</td><td></td></tr><tr><td>IL-6 단클론 항체(MQ2-13A5 - 쥐), FITC</td><td>ThermoFisher</td><td>11-7069-81</td><td></td></tr><tr><td>IL-6 단클론 항체(MQ2-39C3), 비오틴</td><td>ThermoFisher</td><td>13-7068-85</td><td></td></tr><tr><td>녹아웃 세럼 대체품</td><td>ThermoFisher</td><td>10828-010</td><td></td></tr><tr><td>록타이트 AA 3491 경화형 UV 접착제</td><td>Henkel AG & Co</td><td>3491</td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드 (76x26x1mm, 투명 흰색)</td><td>Menzel Gl&auml; ser</td><td></td><td></td></tr><tr><td>미네랄 오일 라이트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>330779</td><td></td></tr><tr><td>NanoPort 어셈블리 헤드리스, 10-32 콘, 1/16" OD</td><td>Idex</td><td>N-333</td><td></td></tr><tr><td>네오디뮴 블록 자석</td><td>K& J Magnetics</td><td>BZX082</td><td></td></tr><tr><td>Omnifix-F Spritze, 1 ml, LS</td><td>Braun</td><td>9161406V</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 (10,000 U/mL)</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>15140-122년&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127, 0.2 &micro; m 여과 (물 중 10% 용액)</td><td>ThermoFisher</td><td>P6866</td><td></td></tr><tr><td>정밀 와이프</td><td>Kimtech Science</td><td>5511</td><td></td></tr><tr><td>PTFE 마이크로튜빙 0.30 &times; 0.76 mm</td><td>FisherScientific</td><td>1191-9445</td><td></td></tr><tr><td>PTFE 마이크로튜빙 0.56 &times; 1.07 mm</td><td>FisherScientific</td><td>1192-9445</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 IL-1&beta;</td><td>Peprotech</td><td>Cat#200-01B</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 IL-6</td><td>Peprotech</td><td>Cat#200-06</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 혈청 알부민(HSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9731</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 TNF-&알파;</td><td>Peprotech</td><td>Cat#300-01A</td><td></td></tr><tr><td>재사용 가능한 생검 펀치 직경 0.75 mm 및 6 mm</td><td>Stiefel</td><td>&nbsp; 504529 및 504532</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 매체, 페놀 없음 레드</td><td>Gibco</td><td>11835-030</td><td></td></tr><tr><td>표준 LPS, E. coli K12</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-eklps</td><td></td></tr><tr><td>스테리칸 바늘 0.56mm 직경 마이크로튜브용 23G</td><td>FisherScientific</td><td>15351547</td><td></td></tr><tr><td>스테리칸 바늘 0.30mm 직경 마이크로튜브용 27G</td><td>FisherScientific</td><td>15341557</td><td></td></tr><tr><td>TNF alpha 단클론 항체 (MAb11), PE</td><td>ThermoFisher</td><td>12-7349-81</td><td></td></tr><tr><td>TNF-alpha 단클론 항체 (MAb1), Countess</td> Automated Cell <td>Counter</td> Invitrogen T10282 <td></td> 진공 여과 "급속"-Filtermax TPP 99500 장치와 함께 사용하기 위한 biotinylated in-house ThermoFisher 14-7348-85 <td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain (0.4%)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cameo 4 자동 절단기</td><td>Silhouette</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cetoni Base 120 + 3x NEMESYS 저압 주사기 펌프</td><td>Cetoni</td><td>NEM-B101-03 A</td><td></td></tr><tr><td>Countess II 자동 세포 계수기</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>도립 에피 형광 현미경 Ti2</td><td></td><td>Nikon ECLIPSE Ti2-E, Ti2-E/B*1</td><td></td></tr><tr><td>OKO 실험실 케이지 인큐베이터, 어두운 패널</td><td>OKO Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ORCA-Fusion 디지털 CMOS 카메라</td><td>Hammatsu</td><td>C14440</td><td></td></tr><tr><td>SOLA Light Engine</td><td>Lumencor</td><td>sola 80-10247</td><td></td></tr></tbody></table>

개별 다기능성 세포의 동시 및 순차적 사이토카인 분비를 해결하기 위한 미세유체 접근법 

Microfluidic Approach to Resolve Simultaneous and Sequential Cytokine Secretion of Individual Polyfunctional Cells

제시된 기능적 단일 셀 플랫폼을 통해 여러 매개변수를 측정할 수 있었습니다. 첫째, 표준 기법과 유사하게, 세포 분비 빈도는 측정이 끝날 때 표시됩니다(그림 4A). 말초혈액 단핵세포(PBMC) 6시간에 대해 1μg/mL의 지질다당류(LPS)를 자극한 후 세포의 5.81%에서 IL-6(n=1270), 4.55% TNFα(n=995) 및 6.06% IL-1β(n=1326)가 분비되었습니다.
사이토카인 분비를 정량화하기 위해 알려진 농도의 재조합 사이토카인으로 보정 곡선을 생성했습니다(그림 4B). 이러한 보정 곡선을 통해 시간 경과에 따른 액적 내 사이토카인 농도를 정량화할 수 있습니다. 예를 들어, LPS 자극 PBMC의 경우 평균 액적 내 IL-6 농도가 90분 후 안정기에 도달한 반면, 평균 액적 내 IL-1β는 90분에서 더 빠르게 증가하여 플랫폼의 동적 분해능과 특정 사이토카인을 분비하는 세포 하위 집단을 추출할 수 있는 가능성을 표시했습니다(그림 4C). 측정 지점 간에 농도가 변함에 따라 사이토카인당 동적 분비 속도를 계산할 수 있습니다. 각 사이토카인(cytokine)의 평균 분비 속도를 살펴보면(그림 4D), IL-6 분비 세포는 평균 분비 속도가 지속적으로 감소하는 반면, TNFα 및 IL-1β 분비 세포는 모두 90분 측정 시간 후 분비 속도가 증가하고 150분 후 두 번째 감소를 보였습니다.
또한, 분비된 사이토카인(cytokine)과 함께 분비된 사이토카인(co-secreted cytokine)에 따라 세포를 부분집단(subpopulation)으로 군집화할 수 있습니다(그림 4E). 여기서 IL-6 또는 TNFα를 분비하는 세포는 각각 30.2%와 26.4%가 IL-6 및 TNFα를 단일분비하는 반면, 단일 분비 IL-1β 세포는 전체 IL-1β 분비세포의 68.8%를 차지합니다. 또한, 분비 농도 및 분비 속도에 대한 공동 분비의 효과를 해결할 수 있습니다(그림 4F). IL-6 분비 세포를 관찰한 결과, 세포가 TNFα 또는 IL-1β를 추가로 생산할 경우 다른 양의 IL-6가 분비되었습니다. 마찬가지로, 측정 시 평균 분비율의 분포는 IL-6만 분비하는 세포 또는 IL-6를 분비하는 세포와 TNFα(높은 분비율) 및 IL-1β(낮은 IL-6 분비율)와 함께 통계적으로 차이를 보였습니다.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66492/66492fig04.jpg"> 그림 4: 1 μg/mL LPS로 6시간 자극 후 IL-6, TNFα 및 IL-1β가 PBMC를 분비하는 대표적인 결과. (A) 4시간 측정 종료 시 IL-6, TNFα 및 IL-1β를 분비하는 PBMC의 백분율. (B) 다중화된 사이토카인 보정 곡선은 알려진 농도의 재조합 사이토카인으로 생성됩니다. 이를 통해 재배치 값에서 액적 내 사이토카인 농도를 계산하여 세포 실험을 정량화할 수 있습니다. 점은 비선형 단상 연관 곡선 적합치, r2=0.9926(IL-6), 0.9901(TNFα), 0.9990(IL-1β)을 사용하여 적합되었습니다. (C) 4시간 측정 시간 동안 PBMC를 분비하여 방출되는 IL-6, TNFα 및 IL-1β의 평균 분비 농도. (D) 4시간 측정 시간 동안 IL-6, TNFα 및 IL-1β의 평균 분비율. (E) IL-6, TNFα 또는 IL-1β를 분비하는 공동 분비 세포 및 이들의 조합의 상대적 백분율. 각 사이토카인에 대해 검출된 모든 분비 세포로 정규화됩니다. (F) 동시 분비 분해능을 가진 IL-6 분비 세포에 대한 측정 시간 동안의 평균 IL-6 농도 및 평균 분비 속도(log) 분포(IL-6 전용 n=383, IL-6 + TNFα의 경우 n=531, IL-6 + IL-1β의 경우 n=213, IL-6+TNFα+IL-1β의 경우 n=143). 분비 속도 분포의 통계적 차이는 95% 신뢰도로 양측, 쌍을 이루지 않은, 비모수 Kolmogorov-Smirnov 테스트를 사용하여 평가되었으며 p-값이 표시됩니다. ** (p &lt;0.002) 및 **** (p &lt;0.0001). 전체 선은 중앙값을 나타내고 점선은 사분위수를 나타냅니다. n총 셀 = 21 866. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66492/66492fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
단일 세포 수준에 대한 추가 정보를 추출하기 위해 시그모이드 기능을 각 세포와 사이토카인의 농도-시간 지점에 맞출 수 있습니다(그림 5). 한 세포에 대한 시간 경과에 따른 농도 데이터 세트와 해당 시그모이드 적합도가 그림 5A에 표시되어 있습니다. 여기서 최소 제곱 피팅 절차는 곡선의 상한 고원 값에 해당하는 C, 0에서 곡선의 시간별 이동을 정량화하는 t50 , 측정 전반에 걸쳐 10% 및 90% 농도 값에 도달한 시그모이드 곡선의 상승 부분의 경사도를 설명하는 언덕 기울기 m을 생성합니다. 이러한 맞춤 매개변수에서 7.12단계에서 설명한 대로 일부 곡선 설명자를 추출할 수 있습니다. 데이터의 가장 높은 농도 값인 Cmax, 상부 고원 농도 값의 10%에 도달하는 것으로 정의되는 분비 시작 시간인 t 시작, 곡선의 상승 부분 동안의 분비 속도인 SRlin을 산출합니다.
세포 하위 집단을 분류하기 위해, 모든 단일 세포 적합에서 얻은 곡선 설명자는 각각 세 가지 범주로 분류되었습니다: Cmax 값은 t에 대해 낮음, 중간 및 높음으로 그룹화되었으며, t는 초기, 중간 및 후기로 시작되고 SRlin은 느림, 중간 및 빠른 분비기로 그룹화되었습니다. 이러한 분류를 설명하기 위해, 4개의 예시적인 단세포 분비 곡선 및 그에 상응하는 곡선 설명자가 나타나 있으며(그림 5A-D), 여기서 곡선 A는 중간 속도의 초기 낮은 분비인자, 곡선 B는 초기, 느리고 높은 분비자, 곡선 C는 초기의 빠른 높은 분비인자, 곡선 D는 후기의 낮은 분비물을 나타냅니다. 이러한 기준에 대한 컷오프는 세포, 사이토카인 및 분석 매개변수에 따라 다르며 각 연구 질문에 맞게 조정해야 한다는 점에 유의해야 합니다. 또한, 6시간 동안 1μg/mL LPS 자극 후 PBMC의 IL-6 분비만 고려되었는데, 이는 대부분의 세포가 각각 80%와 79%로 초기 및 고분 분비자임을 의미합니다(그림 5E-F). 분비 속도와 관련하여, IL-6 분비 세포의 55%는 느린 분비인자, 39%는 빠른 분비 인자로 양극성 반응이 관찰되었습니다(그림 5G).
분비 거동을 더욱 특성화하기 위해 각 세포에 대한 곡선 설명자를 서로에 대해 표시하고 서로 다른 클러스터를 추출했습니다(그림 5H-J). tstart와 Cmax 사이에는 명확한 상관관계가 없습니다(그림 5H): 가장 큰 두 집단은 분비 시작과 무관한 초기의 낮은 분비자와 높은 분비자였습니다. tstart와 SRlin 사이의 관계를 고려할 때(그림 5I), 대부분의 세포는 초기에 높은 분비인자와 소수의 느린/중간에서 늦은 분비인자를 가진 초기의 느린 분비인자였습니다. SRlin 및 Cmax(그림 5J) 상관관계와 관련하여, 빠른 저분비인자는 거의 없었으며, 빠른 저분비인자의 모집단만이 더 많았다. 또한, 최대 측정 농도에 의존하지 않는 빠른 분비인자의 집단이 많았고, 고분비인자의 두 집단은 느리거나 빠르게 분비되었습니다. 요약하면, 개별 세포에 대한 곡선 설명자 간의 관계를 조사하면 훨씬 더 자세한 분석이 가능하며 단일 세포 분비 측정에서 새로운 생물학적 결과를 추출할 수 있다는 결론을 내릴 수 있습니다.
위에서 소개한 분석을 통해 공동 분비 세포의 분비 역학을 추출했습니다(그림 6). 두 개의 예시 곡선은 두 개의 단일 세포에서 IL-6 및 TNFα에 대한 동시 분비의 서로 다른 역학을 보여주며, 두 사이토카인이 동시에 시작되거나(그림 6A) IL-6가 먼저 분비되는 순차적 분비 시작을 보여줍니다. 모든 동시 분비 세포를 분류하기 위해 60분의 분비 지연을 정의했으며, 이 범위 내에서 분비를 시작하는 모든 세포는 동시 분비인자로 간주하고 더 긴 지연을 가진 모든 세포는 순차적 분비인자로 간주합니다. 이 분석을 통해 어떤 사이토카인이 먼저 분비되는지 관찰할 수도 있었습니다. IL-6 및 TNFα의 경우 세포의 76%에서 주로 동시 동시 분비가 관찰되었으며(그림 6C), IL-6 및 IL-1β의 경우 세포의 86%에서 순차적 동시 분비가 관찰되었으며 대부분의 경우 IL-6가 첫 번째로 분비되는 사이토카인이었습니다(그림 6D).
모든 개별 공동 분비 세포에 대해 서로 다른 사이토카인에 대한 분비 시작 시간을 살펴보면, 수행된 실험에서 분비 시작 시간 간의 명확한 상관 관계가 관찰되지 않았습니다. IL-6 및 TNFα 동시 분비(그림 6E)의 경우, IL-6부터 시작하여 공동 분비 세포가 더 많이 발생하는 0분 부근의 더 큰 수직 클러스터가 존재했습니다. IL-6 및 IL-1β 동시 분비(그림 6F)의 경우, 대부분의 세포는 측정 시작 무렵에 IL-6를 분비하기 시작한 반면, IL-1β는 주로 나중에 분비되었습니다. 요약하면, 여기에 제시된 분석을 통해 다양한 분비물 하위 집단과 복잡한 사이토카인 공동 분비 역학을 식별할 수 있었습니다.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66492/66492fig05.jpg"> 그림 5: 단일 IL-6 분비 세포 곡선에 대한 다양한 분비 동적 패턴의 상세 분석. (A) 피팅된 시그모이드 곡선 및 추출된 매개변수를 사용한 측정 시간 동안의 대표적인 단일 세포 사이토카인 농도 데이터. (비-디) LPS 자극 후 IL-6 분비에 대해 발견된 다양한 사이토카인 분비자 유형에 대한 3개의 예시적인 단세포 사이토카인 농도 곡선. (E-G) 다음 기준에 따라 다양한 분비체 유형으로 분류된 IL-6 분비 세포의 비율(n=633): E. C최대: 낮은 &lt;5 nM, 높은 &gt;19.5 nM, F. t시작: 이른 &lt;30분, 늦은 &gt;120분, G. SRlin: 느린 &lt;250 molecules/s, 빠른 &gt;750 molecules/s. (H-J) 세 개의 분비 곡선 설명자 사이의 관계 Cmax, t시작 및 SRlin 은 각 개별 셀에 대해 다음과 같습니다(n=633). Cmax=20nM에서의 큰 모집단은 분석의 검출 상한에 도달한 결과입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66492/66492fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66492/66492fig06v2.jpg"> 그림 6: single-cell concentration curve에서 co-secretion patterns의 추출. (A-B) IL-6와 TNFα를 동시에 (A) 및 (B)를 순차적으로 동시 분비하는 단일 세포의 대표적인 농도 곡선. (C-D) IL-6 및 TNFα(n=249) 또는 IL-6 및 IL-1β(n=72)의 동시 및 순차적 동시 분비를 나타내는 세포의 비율. 순차적 분비는 사이토카인 분비 시작 사이의 60분 이상의 지연을 통해 정의됩니다. 색상은 어떤 사이토카인이 먼저 분비를 시작했는지를 나타냅니다. (E-F) 각 분비 세포에 대한 서로 다른 사이토카인에 대한 분비 시작 시간 간의 관계(nIL6-TNFα=249, nIL6-IL1β=72). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66492/66492fig06largev2.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Infections, autoimmune diseases, desired and adverse immunological responses to treatment can lead to a complex and dynamic cytokine response in vivo. ...

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Research

연구

JoVE Journal

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