Name: 가임력 보존을 겪고 있는 젊은 환자의 난소 예비력을 평가하기 위한 Z-점수 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-25T12:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 42 s
Description: 배우세요 25세 이하 환자의 난소 예비력을 조직학적 평가와 Z-점수 계산으로 정량화하는 방법을. 수정 포뮬러와 연령 표준화 참조 데이터를 활용하여 생식력 보존을 위한 정확한 난소 기능 평가가 가능합니다.

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수행된 모든 절차는 스웨덴 윤리 검토 기관(Sveafertil 환자, Dnr: 2019-03802) 및 헬싱키 대학 병원 윤리 위원회(HCH 환자, Dnr 340/13/03/03/2015)의 승인을 받았습니다. 연구에 대한 서면 및 구두 정보는 연구 간호사에 의해 제공되었으며 헬싱키 선언에 따라 정보에 입각한 동의를 얻었습니다. 18세 미만 환자의 경우 법적 보호자로부터 사전 동의를 받았습니다. 모든 샘플은 유럽 일반 데이터 보호 규정(GDPR)에 따라 가명화되어 처리되었습니다. 이 연구에 사용된 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.
1. 난소 조직 채취 및 처리
참고: 현지 지침(예: 북유럽, 유럽 또는 국제 특정 지침)에 따라 불임 위험이 높거나 매우 높을 수 있는 징후가 있는 경우 가임력 보존에 적합한 모든 환자를 식별합니다. 유럽에서는 가임력 보존 연구 프로그램의 일환으로 미성년자 환자만 모집합니다. 불임 위험을 결정하려면 해당 국가의 가임력 보존 지침을 사용하십시오.
<ol><li>전신 마취하에 수술을 수행합니다. 마취 유도를 위해 프로포폴(2mg/kg), 수펜타닐(0.5마이크로그램/kg), 브로마이드로쿠로늄(0.6mg/kg) 정맥 투여합니다.<ol><li>6-8mL/kg의 일회 호흡량과 6-8cm의 H2O의 호기양압으로 환자를 삽관하고 인공호흡합니다. 흡입 마취를 유지하기 위해 기관내관을 통해 세보플루란을 1%에서 2%까지 전달합니다.</li>
		<li>수술 중 브로마이드(0.15mg/kg)로 신경근 차단을 유지하여 적절한 근육 이완을 제공하고 더 낮은 복강 내 주입 압력에서 복강경을 사용할 수 있도록 합니다.</li>
		<li>이중 스펙트럼 지수를 사용하여 마취 깊이를 안내하여 감소된 마취량으로 빠른 깨어남을 촉진합니다. sugammadex (2-4 mg / kg)로 잔류 신경근 차단을 길항합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>3포트 기법을 사용하여 배꼽의 복막강에 10mm 투관침을 삽입하여 카메라가 부착된 광학 렌즈를 삽입하고, 수술 기구 및 조직 채취를 위해 직접 시야 하에 좌우 장골 영역(위쪽 2cm, 각 전방 상장골 척추 내측 2cm)에 2개의 5mm 투관침을 삽입합니다. 양쪽 난소를 포함한 골반 장기를 검사하여 정상 상태를 확인합니다.<ol><li>가장 쉽게 접근할 수 있는 난소를 파악한 다음 파악합니다. 난소의 약 1/3 크기(또는 윤리적 허가서에 명시된 대로)를 자른 다음 필요한 경우 지혈을 확보하기 위해 투열 요법을 사용합니다. 참고: 수술 중 또는 수술 후 과도한 출혈에 대한 위험 요인 또는 감염 위험 증가와 같은 금기 사항이 없는 경우에만 생검을 수행하십시오. 명확하게 지정하고 해당 국가의 포함 및 제외 기준을 따릅니다. 불임의 위험이 매우 높거나 일부만 절단할 위험이 너무 높다고 간주되는 경우(예: 출혈로 인해) 난소 전체를 촬영할 수 있습니다. 조직을 손상시킬 수 있으므로 샘플을 채취하기 전에 투열 요법을 사용하지 마십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>수술실에서 CaCl2, MgCl2, 1g/L D-glucose, 36mg/L 피루브산이 포함된 1x Dulbecco의 인산염 완충 식염수(PBS) 5mL가 들어 있는 튜브에 조직을 넣고 샘플을 실험실에서 즉시 처리하는 경우(30분 이내) 4°C로 가열하거나 장시간 운송(최대 24시간) 시 4°C로 유지합니다. 참고: 수송 솔루션에는 PBS 및 MEM34와 같은 간단한 완충액뿐만 아니라 상업적으로 이용 가능한 일련의 장기 수송/관류 용액이 포함됩니다.</li>
	<li>난소 표면에서 난소 조직의 작은 조각(2mm x 2mm x 2mm)을 자릅니다. 이 조각은 난소 난포가 있는 난소의 바깥 부분인 피질을 포함하고 있습니다35. 주의: Biosafety Level 2 관행 및 절차를 사용하여 난소와 같은 인체 조직을 다루십시오. 참고: 전문 생식 의학 부서는 환자의 가임력 회복에 잠재적으로 향후 사용할 수 있도록 난소 조직의 나머지 부분을 임상적으로 냉동 보존합니다.</li>
	<li>실온에서 350μL Bouin의 용액에 2시간 동안 또는 4°C에서 350μL의 4% 포름알데히드에 밤새 넣어 조직이 완전히 잠기도록 합니다. 배양 후 70% 에탄올로 조직을 세 번 세척합니다.<ol><li>Bouin의 용액의 경우 노란색이 사라질 때까지 씻으십시오. 조직을 파라핀 왁스36에 삽입합니다. 4μm 두께의 연속 조직 절편을 최소 30개 절단하여 유리 슬라이드에 놓습니다. 주의 : Bouin의 용액과 포름알데히드를 화학 후드 내부와 적절한 보호 장비로 처리하십시오. 알림: 포름알데히드는 조직에 수축 관련 아티팩트를 유발할 수 있습니다. 따라서 Bouin의 솔루션은 조직학을 보존하기 위해 선호되는 선택입니다. 그러나 Bouin의 솔루션에는 추가적인 위험이 있어 여러 기관에서 포름알데히드37의 사용을 선호하게 됩니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Hematoxylin 및 Eosin (H &amp;E) 염색
<ol><li>100mL 오토클레이브 유리병에 에오신 Y 분말 5g을 칭량합니다. 800mL의 95% 에탄올과 200mL의 탈이온수를 추가하여 0.5% 에오신 원액을 만듭니다. 0.25% 에탄올 200mL의 0.5% 에오신 원액을 160mL의 100% 에탄올, 1mL의 아세트산 및 40mL의 탈이온수로 희석하여 40% 에오신 작업 용액을 준비합니다. 알림: 분말은 완전히 녹지 않을 수 있습니다. 침전물을 줄이기 위해 사용하기 전에 용액을 여과하십시오.</li>
	<li>슬라이드를 랙에 놓습니다. 슬라이드가 있는 랙을 크실렌에 15분, 100% 에탄올에 5분, 70% 에탄올에 10회 담그기, 50% 에탄올에 10회 담근 다음 탈이온수에 10회 담그십시오.<ol><li>슬라이드가 있는 랙을 헤마톡실린 용액에 3분 동안 담근 다음 슬라이드가 있는 랙을 증류수가 담긴 용기에 30초 동안 옮겨 과도한 헤마톡실린 얼룩을 씻어냅니다.</li>
		<li>슬라이드가 있는 랙을 분화 용액(70% 에탄올 100mL에 37% HCl 1mL를 추가)이 있는 용기에 1분 동안 넣은 다음 슬라이드가 있는 랙을 증류수 수돗물이 있는 용기로 30초 동안 옮깁니다. 알림: 조직 부분이 액체에 잠겨 있는지 확인하십시오. 필요한 경우 용기에 더 많은 시약을 추가합니다. 많은 양을 염색할 때는 5회 사용 후 크실렌을 교체하십시오. 70% 에탄올을 희석하여 50% 에탄올을 제조합니다(예: 70% 에탄올 35mL를 DPBS 15mL에 추가하여 50% 에탄올 50mL를 만끽). 주의 : 후드 내부의 크실렌을 적절한 보호 장비로 다루십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>슬라이드가 있는 랙을 Scott의 수돗물(블루잉 용액이라고도 함)에 30-60초 동안 넣은 다음 슬라이드가 있는 랙을 증류수 수돗물이 담긴 용기에 30초 동안 옮깁니다. 슬라이드가 있는 랙을 eosin 작업 용액에 1분 동안 담그십시오.<ol><li>슬라이드를 100% 에탄올로 30초 동안, 100% 에탄올이 든 두 번째 용기에 30초 동안 넣고 크실렌에 두 번 담궈 슬라이드를 탈수합니다. 크실렌 용액에서 랙을 제거한 후 후드 내부에 크실렌이 떨어지는 것을 방지하기 위해 유리 용기에서 건조시키십시오.</li>
		<li>장착 용액 2방울로 슬라이드를 장착합니다. 기포가 생기지 않도록 커버 슬라이드를 조심스럽게 놓고 장착 용액을 건조시키십시오. 주의 : 후드 내부의 크실렌을 적절한 보호 장비로 다루십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>가능한 경우 슬라이드 스캐너를 사용하여 슬라이드를 스캔하여 디지털화합니다. 이 옵션을 사용할 수 없는 경우 20-40x 배율의 일반 도립 현미경을 사용하여 난포를 직접 계산합니다. 이미지 분석 소프트웨어에서 면적 측정을 용이하게 하기 위해 전체 생검의 이미지를 촬영해야 합니다.</li>
</ol>3. 여포 세기
<ol><li>슬라이드가 디지털화된 경우 적절한 소프트웨어(예: 오픈 소스 소프트웨어 QuPath38)를 사용하여 파일을 엽니다. 디지털화되지 않은 경우 도립 현미경과 해당 소프트웨어를 사용하여 직접 분석을 수행합니다.<ol><li>파일을 QuPath의 기본 창으로 드래그합니다. 이미지 유형을 Brightfield H&amp;E 로 설정합니다( 그림 1A 참조). 스케일 바를 사용하여 표면 상피(표면을 둘러싸고 있는 직육면체 세포의 단일 층)에서 1mm를 정의합니다. 타원 도구를 클릭하고 모낭에 주석을 답니다( 그림 1B 참조).</li>
		<li>이 1mm 영역 내에 있는 원시 단계부터 1차 단계까지 난포의 수를 세십시오. 각 난포의 단계(원시 - 난모세포를 둘러싼 편평한 과립구 세포의 층, 중간 단계 - 편평한 과립세포와 직육면체 과립구 세포의 혼합물, 1차 - 난모세포를 둘러싼 직육면체 과립세포 세포의 전체 층 1개)를 확인합니다.</li>
		<li>샘플 ID, 연령, 각 슬라이드에 대한 모낭 수, 단면 두께 및 계산된 n번째 단면을 Follicle Z-score 계산기 Excel 파일의 Follicle (mm3)이라는 시트에 입력합니다(보충 파일 1 및 그림 2A 참조). 참고: 모낭의 직경(가장 작은 모낭&gt;35μm)으로 인해 동일한 모낭이 연속된 섹션에 나타날 수 있습니다. 단면 사이의 거리가 모낭 직경보다 작은 단면을 계산할 때 각별한 주의를 기울이십시오. 바람직하게는, 매 10번째 섹션(예를 들어, 섹션 #10, #20, #30)에서 모낭을 세는 것이다. 표면 상피는 조직 처리 중에 분리될 수 있으며 슬라이드에 부분적으로만 존재할 수 있습니다. 눈에 보이는 세포질이 있는 난포만 계산합니다. 품질 관리를 위해 두 사람이 독립적으로 모낭을 세고 그들의 수가 얼마나 잘 일치하는지 결정하도록 합니다. 동일한 샘플에 대한 각 관찰자의 여포 수 간의 간단한 상관 함수를 사용하여 관찰자 간 일치를 계산합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>눈으로 측정하여 계수된 각 섹션에서 가장 큰 10%의 난포를 식별합니다. 선 도구를 클릭하고 난모세포막을 통해 두 개의 수직선을 그린 다음 Measure(측정)를 선택한 다음 Show annotation measurements(주석 측정값 표시 )를 선택하여 이러한 난모세포의 평균 직경을 측정합니다( 그림 1C 참조).<ol><li>길이 μm 컬럼 아래에 측정값을 기록합니다(그림 1D 참조). Follicle Z-score calculator Excel 파일의 각 슬라이드에 대한 평균 난모세포 직경(μm) 필드에 모든 난모세포의 평균 직경을 입력합니다(mm3의 여포, 보충 파일 1 및 그림 2A 참조).</li>
	</ol></li>
	<li>QuPath의 화면 중앙에 이미지를 배치한 다음 ImageJ 아이콘을 클릭합니다. 스냅샷을 ImageJ로 보내기 를 선택합니다( 그림 3A 참조). ImageJ에서 브러시 도구를 사용하여 테두리에서 1mm 간격을 둡니다. Image(이미지), Type( 유형)을 차례로 클릭하고 8비트 를 선택합니다( 그림 3B 참조).<ol><li>선 도구를 클릭하고 화면 왼쪽 하단의 눈금 막대에 선을 그립니다(그림 3C 참조). Analyze(분석)를 클릭한 다음 Set Scale(스케일 설정)을 클릭하고 Known Distance(알려진 거리) 필드에 스케일 막대에 표시된 길이를 입력한 다음 OK(확인)를 클릭합니다(그림 3C 참조). Image(이미지)를 클릭한 다음 Adjust(조정), Brightness/Contrast(밝기/대비)를 클릭하고 Auto(자동)를 선택합니다(그림 3D 참조).</li>
		<li>Image(이미지)를 클릭한 다음 Adjust(조정), Threshold(임계값)를 클릭하고 Auto(자동)를 선택합니다(그림 3E 참조). 지팡이 도구를 클릭하고 영역을 선택한 다음 Ctrl + M을 누릅니다(그림 3F 참조). 면적 값을 Follicle Z-score calculator Excel 파일에 입력합니다(mm3의 여포, 보충 파일 1 및 그림 2A 참조).</li>
	</ol></li>
</ol>4. 여포 조밀도, 대뇌 피질 부피 및 Z 점수 계산
<ol><li>제공된 Follicle Z-score 계산기 Excel 파일을 사용하여 아래에 설명된 계산을 자동으로 수행합니다. 결과는 섹션 3에 표시된 세부 정보가 "mm³의 모낭" 시트에 입력된 경우 Excel 계산기의 "Z-점수(mm³당 모낭)" 시트에 나타납니다( 보충 파일 1 참조).</li>
	<li>이 섹션에서 모낭 밀도를 계산하려면 Schmidt et al.32가 제시한 수정된 공식을 사용하십시오. 먼저, 동일한 여포의 이중 계수를 설명하기 위해 보정 계수 α 적용합니다. 수정된 공식은 다음과 같습니다. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66504/66504eq01.jpg" style="margin: auto;"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/66504/66504eq02.jpg" style="margin: auto;"> 참고: 이 공식에서 t 는 단면 두께, d 는 난모세포의 직경, q 는 난포 직경을 단면 두께로 나눈 몫입니다.</li>
	<li>다음 공식33을 사용하여 섹션의 여포 수에서 피질의 총 여포 수(n 여포)를 외삽합니다. <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/66504/66504eq03.jpg" style="margin: auto;"> 참고: 이 수식은 계산되지 않은 모든 섹션도 고려합니다. 여기서, γ는 계산되지 않는 절편의 수를 나타내고(예를 들어, 매 10번째 절면이 계산되는 경우 γ = 10), α는 4.1에서 계산된 보정 계수이고, N은 계수된 단면의 수이고, ni는 계수된 단면의 총 여포 수이다.<ol><li>다음 공식33을 사용하여 계산된 영역에서 전체 피질 부피(V)를 외삽합니다. <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/66504/66504eq04.jpg" style="margin: auto;"> 참고: 여기서 AI(Ai)는 단면의 면적이고 TI는 조직 두께입니다. γ와 N에 대해서는 4.2단계를 확인하십시오.</li>
		<li>다음 공식33 을 사용하여 난포 밀도를 계산하십시오. <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/66504/66504eq05.jpg" style="margin: auto;"></li>
	</ol></li>
	<li>공식33을 사용하여 Z-점수를 계산하여 감소한(&lt;-1.7 Z-점수) 난소 예비력이 있는지 확인합니다. <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/66504/66504eq06.jpg" style="margin: auto;"> 참고: Z-점수는 섹션 3(모낭 계산)(그림 2B)에 제공된 정보를 기반으로 Excel 계산기(보충 파일 1 참조)의 "Z-점수(mm³당 여포)" 시트에서 자동으로 계산됩니다. 이 공식에서 Z는 Z-점수를 나타내고, x는 연구 샘플(단계 4.4)의 계산된 난포 밀도(follicles/cm3)이고, M은 각 연령 그룹의 평균 난포 밀도이고, SD는 각 연령 그룹의 표준 편차입니다. 0-25세 여성에 대한 기준값은 Hassan et al.33에 의해 확립되었습니다. 각 연령 그룹의 난포 밀도의 평균 및 표준 편차는 Follicle Z-score 계산기 Excel 파일(보충 파일 1)에서 찾을 수 있으며 Z-score 계산에 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>난포 밀도에 대한 Z-Score를 사용하여 젊은 환자의 난소 예비력 평가

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<li>Hassan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reference+standards+for+follicular+density+in+ovarian+cortex+from+birth+to+sexual+maturity%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Biomed+Online%22%5BJournal%5D)">Reference standards for follicular density in ovarian cortex from birth to sexual maturity.</a> Reprod Biomed Online. 47, 103287(2023).</li>
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<li>Bankhead, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QuPath%3A+Open-source+software+for+digital+pathology+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">QuPath: Open-source software for digital pathology image analysis.</a> Sci Rep. 7 (1), 1-7 (2017).</li>
<li>Björvang, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+organic+pollutants+and+the+size+of+ovarian+reserve+in+reproductive-aged+women%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Int%22%5BJournal%5D)">Persistent organic pollutants and the size of ovarian reserve in reproductive-aged women.</a> Environ Int. 155, 106589(2021).</li>
<li>Kwok, R., Johnson, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+biopsy+has+no+role+as+a+routine+diagnostic+test+of+ovarian+reserve%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Biomed+Online%22%5BJournal%5D)">Ovarian biopsy has no role as a routine diagnostic test of ovarian reserve: A systematic review.</a> Reprod Biomed Online. 24, 492-495 (2012).</li>
<li>Ahmad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+spatial+sensitive%2C+quantitative+phase+microscopy+using+low+spatial+and+high+temporal+coherent+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">High-throughput spatial sensitive, quantitative phase microscopy using low spatial and high temporal coherent illumination.</a> Sci Rep. 11 (1), 1-13 (2021).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1x Dulbecco의 인산염 완충 식염</td>수 <td>Thermo Fisher</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>1x 인산염 완충 식염수 w/ CaCl2, MgCl2, 1 g/L D-glucose, 36 mg/L pyruvate&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>14287-080</td><td></td></tr><tr><td>37% 염산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.09057.1000</td><td></td></tr><tr><td>70% 에탄올</td><td>Histolabs</td><td>01370.01L</td><td></td></tr><tr><td>95% 에탄올</td><td>Fisher scientific</td><td>10572143</td><td></td></tr><tr><td>Absolute ethanol</td><td>Histolabs</td><td>01399.01L</td><td></td></tr><tr><td>Bouin의 솔루션</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT10132-1L</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y Free acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4009-5G&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드</td><td>Thermo Fisher</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>헤마톡실린 용액, Delafield</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03971-250ML</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>마이크로톰&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pertex 마운팅 솔루션&nbsp;</td><td>Histolabs</td><td>00840-05</td><td></td></tr><tr><td>프로포폴</td><td>박스터 홀딩 변환기</td><td></td><td>카탈로그 번호 QuPath</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>대신</td></tr> 제공되는 N01AX10 ATC 코드 https://qupath.github.io/ <tr><td>Rocuronium bromide&nbsp;</td><td>B. 브라운 멜숭겐 AG&nbsp;</td><td></td><td>카탈로그 번호 대신 제공되는 M03AC09 ATC 코드 Scott</td></tr><tr><td>의 수돗물 대체 농축액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5134-6x100ml</td><td></td></tr><tr><td>Sevoflurane</td><td>Baxter Medical AB&nbsp;</td><td>카탈로그</td><td>번호 Slide 스캐너 대신 제공되는 N01AB08 ATC 코드</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr> 카탈로그 번호 Sugammadex Baxter Holding B.V. <tr>대신 제공되는 <td>Sufentanil</td><td>Hameln Pharma gmbh</td><td>N01AH03</td><td>ATC 코드</td></tr><tr><td></td><td></td>카탈로그 번호 SuperFrost plus white 대신 <td>제공되는 V03AB35</td><td>ATC 코드</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>히스톨랩&</td><td>nbsp; 06400&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus White 현미경 슬라이드</td><td>Histolabs</td><td>&nbsp; 06400&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>크실렌</td><td>Saveen Werner</td><td>131769.1611</td><td></td></tr></tbody></table>

가임력 보존을 겪고 있는 젊은 환자의 난소 예비력을 평가하기 위한 z-점수

Z-Scores for Assessing Ovarian Reserve in Young Patients Undergoing Fertility Preservation

난소 난포는 슬라이드의 성공적인 절편, 염색 및 스캔 후 정량화됩니다. 난포의 다양한 단계와 건강을 구별하고 추가로 분석합니다. 그림 4A에는 성인의 Bouin 고정 난소의 HE 염색 단면이 피질 및 수질 조직의 예와 함께 표시됩니다. 그림 4B 는 표면 상피의 예와 함께 어린이의 난소의 대표적인 사진을 보여줍니다. 난소 예비력(즉, 성장하지 않는 난포 풀)과 작은 성장 난포는 피질에 있습니다. 가상 현미경을 사용하여 난포를 확대하고 분류하여 난소 예비량만 포함되도록 합니다. 그림 5 는 Bouin's-(그림 5A) 및 포름알데히드 고정(그림 5B) 난소 피질 조직에서 발견되고 계수된 난포의 단계를 나타냅니다: (1) 원시 난포(직경 약 40μm), (2) 중간, (3) 원발성 난포. 모낭 4-6은 성숙 단계를 올바르게 할당할 수 없기 때문에 계수에서 제외되는 난포의 예입니다. 그림 6 은 난포가 없거나 적은 난소 피질 조직(그림 6A)과 난포 수가 중간에서 높은 난소 조직(그림 6B)의 대표적인 이미지를 보여줍니다. 그림 7 은 수질 조직만 존재하거나(그림 7A) 조직의 품질이 좋지 않아 제외되는 조직 절편의 대표 이미지를 보여줍니다(그림 7B). 그림 2 는 Follicle Z-score calculator Excel 파일의 스크린샷을 보여줍니다. 계산된 숫자 및 관련 Z-점수는 입력된 데이터에서 자동으로 계산됩니다. Z-점수 &lt;1.7은 터너 증후군 환자의 AUC-ROC(Curve-receiver Operating Characteristic) 곡선 아래 면적을 기반으로 난소 예비력이 감소했음을 나타냅니다16.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66504/66504fig01.jpg"> 그림 1: QuPath 소프트웨어 사용 스크린샷. (A) QuPath에서 이미지 파일을 열고 이미지 유형을 설정하는 과정을 표시합니다. (B) 소프트웨어 내에서 ellipse 도구를 사용하여 모낭에 주석을 달습니다. (씨,디) 주석이 달린 이미지에서 난모세포의 평균 지름을 측정합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66504/66504fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66504/66504fig02v2.jpg"> 그림 2: 여포 Z-점수 계산기 Excel 파일의 스크린샷. (A) "mm³의 모낭" 시트는 샘플 ID, 연령, N번째 섹션, 최종 모낭 수, 면적, 평균 난모 직경, 단면 두께 및 계산된 모든 N번째 섹션에 대한 데이터가 입력될 필드(녹색 셀)를 보여줍니다. 난포 밀도(여포/mm³)는 필요한 모든 데이터가 입력될 때 자동으로 계산됩니다. 불완전한 데이터가 있는 경우 비어 있습니다. (B) "Z-점수(mm³당 모낭)" 시트는 "mm³의 여포" 시트의 ID, 연령 및 모낭/mm³ 데이터를 연결하고 샘플에 대한 Z-점수를 자동으로 계산합니다. 해당 참조 값이 오른쪽 표에 나타납니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66504/66504fig02largev2.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66504/66504fig03.jpg"> 그림 3: ImageJ 소프트웨어 사용 스크린샷. (A) QuPath에서 ImageJ로 이미지 전송. (B) ImageJ 내에서 이미지 유형을 설정합니다. (C) 측정을 위한 스케일 설정. (D,E) 이미지의 밝기/대비 및 임계값을 자동으로 조정합니다. (F) 조정된 이미지 내의 면적을 측정합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66504/66504fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66504/66504fig04.jpg"> 그림 4: 난소 조직의 대표 이미지. (A) 성전환 수술을 받는 성인의 난소 이미지. 체세포의 밀도가 높고 난소 예비량을 포함하는 피질은 골수 조직과 함께 볼 수 있으며, 골수 조직은 밀도가 낮고 체세포가 더 크며 종종 더 많은 혈관을 포함하는 것이 특징입니다. (B) 가임력 보존을 받고 있는 아이의 난소 이미지. 피질은 표면 상피에서 1mm를 측정하여 결정됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66504/66504fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66504/66504fig05.jpg"> 그림 5: 다양한 용액으로 고정된 난소의 난포의 대표적인 이미지. (A) Bouin의 용액과 (B) 다양한 단계에서 4% 포름알데히드로 고정된 여포: (1) 원시 단계 난포, (2) 중간 단계 난포, (3) 1차 단계 난포. 난포 (4)에서 (6)은 눈에 보이는 세포질이 없기 때문에 제외됩니다. 포름알데히드 고정에서 흔히 발생하는 인공물에는 조직에서 기저막의 분리(녹색 화살표로 표시)와 pyknotic granulosa cells(노란색 점으로 표시)가 포함됩니다. 스케일 바는 50 μm를 나타냅니다. 이 그림은 Björvang et al.39에서 발췌한 것입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66504/66504fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66504/66504fig06.jpg"> 그림 6: 아동 난소의 대뇌 피질 생검의 대표 이미지. (A) 난포 수가 적지 않음을 보여주는 생검 및 (B) 난포 수가 중간에서 높은 것으로 보이는 생검. 여포는 별표(*)로 표시되어 있습니다. 파란색 점선은 표면 상피에서 1mm를 나타내고 검은색 선은 표면 상피를 표시합니다. 눈금 막대는 500 μm를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66504/66504fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66504/66504fig07.jpg"> 그림 7: 제외할 조직 절편의 대표 이미지. (A) 피질이 아닌 수질이 채취된 난소 조각. 이 부분은 표면 상피가 없고 세포의 밀도가 낮기 때문에 수질로 특징지어집니다. (B) 조직의 찰과상으로 식별되는 품질이 좋지 않은 조직 단면. 눈금 막대는 500 μm를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66504/66504fig07large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 1: 여포 Z-점수 계산기. 이 파일은 여포 Z-점수의 계산을 용이하게 합니다. 데이터(샘플 ID, 연령, 슬라이드당 모낭 수, 단면 두께, 계산된 N번째 단면 및 면적)를 "mm³의 모낭" 시트에 입력해야 합니다. 그런 다음 Z-점수가 자동으로 계산되어 "Z-점수(mm³당 모낭)" 시트에 요약됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66504/FollicleZ-score_Calculator%2020231110.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

가임력 보존을 겪고 있는 젊은 환자의 난소 예비력을 평가하기 위한 Z-점수

Women are born with a non-renewable pool of ovarian follicles, referred to as the ovarian reserve. This reserve consists of primordial follicles in the ...

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

Oocyte 냉동 보존은 후구형 여성의 불임 보존을위한 금 본위제로 여러 국제 과학 사회에 의해 인식된다. 적절한 임상 및 실험실 전략은 불임 보존 치료의 효능, 효율성 및 안전을 최대한 보장합니다.

오키테 바이트로피화를 통한 불임 보존: 임상 및 실험실 관점

우리는 심각한 난소 기능 장애를 가진 환자를 위한 난소 여포의 약물 없는 체외 활성화 (IVA)를 위한 실험실 절차의 세부 사항을 제시합니다. 이 방법은 난소 과잉 자극 당 회수 가능한 난모세포의 수를 증가시키고 그 환자를 위한 불임 보존을 유익할 수 있었습니다.

심한 난소 기능 장애 환자에서 불 임 보존

여기에서는 전체 탑재 면역 염색, 다중 광자 현미경 검사, 3D 시각화 및 분석을 사용하여 정량적 및 정성적 분석을 위해 전체 난소를 이미징하는 데 최적화된 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 독성학, 임상 진단 및 난소 기능의 게놈 분석에 적용 할 수있는 높은 처리량, 신뢰성 및 반복 가능한 처리를 수용합니다.

전체 난소 면역 형광, 클리어링 및 마우스에서 난소 예비의 정량적 3D 분석을위한 다중 광자 현미경 검사

이 프로토콜은 IVF 절차에서 난포액, 체세포 및 미성숙 난모세포를 분리하고 처리하여 고품질 분자 및 세포 분석을 가능하게 하는 표준화된 방법을 간략하게 설명합니다. 이러한 접근 방식은 일반적으로 임상 치료에서 폐기되는 재료를 사용하여 생식력, 생식 노화 및 난소 기능 장애에 대한 중개 연구를 지원합니다.

체외 수정을 받는 개인의 인간 난포액, 난포 체세포 및 미성숙 난모세포 수집

유도만능줄기세포(iPSC), 일차 피질 뉴런 및 성상세포에서 유래한 뉴런으로 구성된 공동 배양 시스템을 생성하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 공동 배양 시스템을 통해 새로운 iPSC 유래 뉴런과 채널로돕신-2를 발현하는 기존 피질 뉴런 사이의 시냅스 접촉 및 회로 형성을 감지할 수 있습니다.

공동 문화 시스템에 신경 연결의 형성을 평가하기위한 Optogenetic 접근

이 프로토콜은 신생아 마우스와 사춘기 쥐에서 개별 난소에서 난소를 사용하여, 마우스 난소 조직의 주요 문화 / 공동 문화를 설명합니다. 배양 기술은 난소에 외인성 제제의 효과의 조사를 가능하게하여 생리 고도로 개발을 지원하고, 난포 사이의 상호 작용.

문화 공동 문화 마우스의 난소와 난소

제브라피시 담즙 유도 간 재생의 기저에 있는 분자 메커니즘을 평가하는 데 도움이 되도록 우리는 니트로환원효소 발현 간세포가 메트로니다졸 처리 시 유전적으로 절제되는 간 손상 모델을 확립했습니다.  이 프로토콜에서는 간세포 절제 및 담즙 주도 간 재생을 능숙하게 조작, 모니터링 및 분석하는 방법을 설명합니다.

담즙 중심의 간 재생을 연구하는 Zebrafish의에서 간세포 특이 절제

장 상피 줄기 세포 (ISCS)는 Paneth 셀과 혼합된다. 이러한 세포 ISCS을 지원 항균 보호를 제공 ISC의 자손을 차별화한다. 여기에서 우리는 우리가 Paneth 세포가 장 상피 세포를 유지하는데 중요한 역할을한다는 설정하는 형질 전환 조건부 마우스 모델을 사용하는 방법을 보여줍니다.

조건을 사용하여 쥐 소장에서 재생성 Paneth 세포의 역할을 분석하기위한 프로토콜<em&gt; Cre 호텔-LOX</em&gt; 마우스 모델

MicroSecure Vitrification은 FDA 우수 제조 및 조직 취급 관행을 준수하는 비상업적인 무균 폐쇄 유리화 장치 시스템으로 개발되었습니다. 소수성 플러그 배아 빨대가 업계에서 철수함에 따라 유리화 절차는 표준 내부 면 플러그 앞에 내부 씰을 포함하도록 수정되었습니다.

수정 MicroSecure의 유리화 : 인간 배반포를위한 안전 간단하고 매우 효과적인 냉동 보존 절차

여기, 우리는 기능, 계약, cardiomyocyte 같은 세포를 생성 하기 위해서는 인간 중간 엽 줄기 세포의 젊은 소스의 심장 감 별 법 잠재력을 효율적으로 활용 하는 방법을 제시 생체 외에서.

생체 외에서 기능 Cardiomyocyte-같은 세포로 인간 중간 엽 줄기 세포의 분화

배우세요 25세 이하 환자의 난소 예비력을 조직학적 평가와 Z-점수 계산으로 정량화하는 방법을. 수정 포뮬러와 연령 표준화 참조 데이터를 활용하여 생식력 보존을 위한 정확한 난소 기능 평가가 가능합니다.

가임력 보존을 겪고 있는 젊은 환자의 난소 예비력을 평가하기 위한 Z-점수

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