Name: 유충에서 유년기까지 무균 제브라피시 모델의 생성, 유지 관리 및 식별 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-12T13:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 38 s
Description: 학습하세요 무균 제브라피시 모델의 생성 및 유지 관리 방법을 통해 장내 미생물과 숙주 건강의 상호작용을 연구하세요. 이 기술은 면역 및 발달 생물학 연구에 활용됩니다.

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충칭 의과대학 인재 프로젝트(R4014 - DSP, R4020 - PPJ), 중국 국가자연과학재단(NSFC, No.32200386 - PPJ), 충칭 박사후 과정 혁신 멘토 스튜디오(X7928 DSP) 및 중국과학원(CAS)/중국-스리랑카 교육 연구 공동 센터(CAS)의 중국-스리랑카 수자원 기술 연구 및 시연 프로그램 프로그램의 지원에 진심으로 감사드립니다.

GF 제브라피시 모델 최적화: 생성, 유지 관리 및 미생물 연구

GF Artemia 의 프로토콜은 중국 국가 지적 재산권국에 의해 특허로 부여되었으며, 저자의 허가를 얻은 후 방법의 제한된 사용을 완화할 것입니다. 저자는 다른 경쟁 또는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

GF fish 및 GF 식품 준비 프로토콜 내의 중요한 단계 GF 물고기 모델을 생성하는 동안 멸균 물질 준비, 배아 멸균, GZM의 일일 갱신, 다양한 샘플 채취 및 여러 방법을 사용한 각 샘플의 멸균 검사를 포함하여 몇 가지 중요한 단계가 포함되었습니다. 이러한 단계 중 배아의 초기 치료는 GF 모델의 성공에 기본적이고 결정적인 역할을 합니다. 제제, 농도 및 처리 시간을 제어하는 것은 최적의 멸균 속도와 부화 성공을 달성하는 데 매우 중요합니다. GF 물고기 배아를 유충에게 취급할 때 매일 배지를 교체하고 인큐베이터에서 플레이트를 제거할 때 자외선 또는 오토클레이브를 사용하여 재료와 플랫폼을 철저히 멸균하도록 하는 세심한 주의가 필요합니다. 겨울철 온도 조건과 작동 시간을 모니터링하는 것은 깨끗한 벤치에서 낮은 온도로 인한 유충 사망을 예방하는 데 필수적입니다.
멸균 달걀 노른자와 GF Artemia 는 장기 GF 모델에 대한 멸균 상태를 보장하기 위해 7dpf 후에 물고기에게 먹이기 전에 검출을 받아야 합니다. 공급 기간 동안 폐기물 매체를 갱신할 때 검출을 위해 수집된 샘플의 일부로 음식물 찌꺼기를 청소하는 것이 중요합니다. 제한된 주변 환경과 수질 문제로 인한 GF 물고기 손실을 방지하기 위해 성장 및 개발 단계에 따라 컨테이너, GZM의 부피 및 먹이 질량을 조정해야 합니다. 이러한 매개변수의 정기적인 모니터링 및 조정은 GF 물고기 모델의 성공적인 유지 관리에 기여합니다.
이러한 프로토콜의 수정 사항 및 중요성 AB-GZM, PVP-I 및 NaClO 용액의 최적화된 약제, 농도 및 노출 시간을 포함하는 GF 제브라피시 배아 생성을 위한 간소화된 3단계 프로세스는 높은 멸균률과 건강한 모델 개발을 보장합니다. 또한 일일 샘플에 대한 멸균 검출 방법은 일반적인 박테리아 프라이머를 사용하는 분자 기술과 함께 호기성 및 혐기성 조건에서 플레이트 및 액체 배지 배양을 포함하도록 완성되었습니다. 박테리아 및 곰팡이 오염 물질에 대한 테스트에 대한 추가 경험은 GF 동물 기술48 동안 절연체 오염 물질 및 멸균 테스트를 최적화하는 것을 목표로 합니다.
물고기 모델의 살아있는 식품으로서의 GF Artemia nauplii 에 대한 특정 프로토콜은 우리 연구에서 조사되었으며, 중국 국가 지적 재산권 관리국(China National Intellectual Property Administration)에 의해 PPJ 및 DSP에 특허가 부여되었습니다(No. ZL202210482684.8). 장기적인 GF 물고기 모델은 부적절하고 부적절한 영양으로 인해 지속적으로 제한되어 소화 및 흡수와 관련된 장 기능의 약점을 악화시킵니다. 다양한 생애 단계에 있는 메다카 및 제브라피시 모델을 위한 신뢰할 수 있는 식품 공급원인 GF Artemia sp.는 간단한 절차, 짧은 배양 시간 및 일상적인 사용을 위한 실시간 멸균 감지로 쉽게 준비할 수 있어야 합니다. 이 방법에서는 정상적인 쑥 낭종을 무균이 될 수 있는 충분한 농도의 NaClO로 헹구고 필름 코팅된 병에 배양하고 플레이트와 액체 배지에 넣어 검출합니다. 이것은 GF 물고기 먹이를 위해 갓 부화하는 nauplii 를 지원합니다. Artemia의 멸균 속도와 부화 속도, 몸 길이, 무게 및 활성도가 우수하여 실제로 사용 가능한 응용 분야를 나타냅니다.
GF 물고기 및 GF 식품 프로토콜에서 이러한 수정의 중요성은 연구자들이 배아, 유충, 유년기, 심지어 해양 및 담수 modeμspecies의 초기 성인 및 성인 단계에서 모델을 생성하는 데 도움이 됩니다. 장기 GF 동물은 숙주 성장 및 발달 동안, 특히 면역 및 관련 장 세포주의 성숙도에서 약물 스크리닝 및 미생물 기능에 대한 연구에서 생체 내 모델과 같이 허가를 제공할 것입니다. 예를 들어, 제브라피시 유충은 첫 주에만 선천적 면역을 가지고 있으며, 흉선 성숙도31,49와 함께 7-21 dpf 동안 적응 면역 시스템을 발달시킵니다. 또한, GF 물고기 모델은 유기체의 동적 집락화 및 이동 과정에 대한 실시간 관찰을 통해 박테리아-박테리아 및 미생물군-숙주 상호 작용을 분석할 수 있는 가능성을 제공할 수 있습니다(50,51).
방법의 한계 유년기에서 초기 성체(28 dpf-2.5 mpf) 및 성적으로 성숙한 성체(>2.5 mpf)로 GF 물고기를 배양하는 것은 모델 유지 관리 중 폐사율 증가와 박테리아 오염 위험으로 인해 여전히 어려운 과제로 남아 있습니다. 이러한 한계는 주로 GF 환경에서 생활하는 물고기에게 적합한 자동 배양 시스템이 없기 때문에 발생합니다. 이러한 시스템에는 동물과 환경을 효과적으로 유지하고 외부 미생물로부터 완전히 격리할 수 있도록 깨끗한 공기, 물 및 식품 시스템이 포함되어야 합니다. 생쥐 및 닭52와 같은 다른 GF 동물 모델과 달리 CR 부모로부터 해부학적 작업을 통해 GF 제브라피시를 얻는 것은 그들의 수생 습관과 자연 수정 스타일로 인해 어렵습니다.
성체 동물을 장내 미생물군이 전혀 없는 동물로 취급하는 것도 어려운 일입니다. 항생제 처리는 분변 샘플에서 검출되는 감소된 미생물군을 특징으로 하는 특정 병원체가 없는(SPF) 동물과 유사한 상태를 유발할 수 있지만 진정한 GF 성체 어류 모델을 달성하는 것은 여전히 어렵습니다. GF 모델을 수립하고 유지하는 것과 관련된 과제는 특히 청소년 상태에서 장기 상태로 전환하는 동안 중요합니다. 미생물 연구에서 성인 GF 물고기의 GF F1 또는 F2 알과 같은 GF 자손의 중요성이 인정되고 있습니다. 그러나 장기적인 성체 GF 물고기 모델을 수립하고 유지하는 데 있어 어려움을 극복하려면 상당한 시간이 필요합니다.
특정 세균 집락을 가진 gnotobiotic 제브라피시가 개발되어 GF 모델을 기반으로 만성 생존을 보여주고 있다는 점은 주목할 가치가 있습니다. 그럼에도 불구하고 이러한 모델이 세균 감염 및 생물 의학 연구에서 GF 모델에 대한 실행 가능한 대안으로 사용될 수 있는지 여부는 불확실합니다.
GF 물고기 모델의 미래 응용 분야 이 연구에서는 배아에서 청소년으로 진행되는 GF 제브라피시 모델을 생성하기 위한 프로토콜을 개선했습니다. 이러한 발전은 발달 생물학, 면역학, 인간 질병 연구 및 기관 발생에 중요한 응용 분야를 가지고 있습니다. 대량 분리 및 식별을 통해 이 연구는 단일 박테리아 균주의 기능, 메커니즘 및 장 유래 대사 산물을 탐구합니다. 조사에는 통풍구가47,53단계를 연 후 GF 제브라피시 모델을 감염시키는 것이 포함됩니다. 또한, 형광을 가진 표지된 박테리아는 다른 미생물의 영향으로부터 자유로운 살아있는 GF 유충의 집락화 및 분포를 관찰하는 데 도움이 된다54. 해양 또는 담수 메다카와 같은 유사한 GF 물고기 모델은 다양한 에이전트 또는 매체 변화와 유사한 방법을 사용하여 만들 수 있습니다.
인간의 질병 메커니즘을 조사하기 위해 이 연구는 FMT 방법을 사용하여 환자 또는 기증자로부터 샘플을 건강한 동물 또는 GF 모델55로 전달합니다. 재래식 사육(CR) 동물과 달리, GF 모델은 특히 미생물총(microbiota)에서 표적 박테리아를 조절하기 위해 박테리오파지(bacteriophage)와 결합할 때 숙주에서의 미생물 기능, 영향 또는 반응에 대한 강력한 증거를 제공한다(46).
요약하면, GF 제브라피쉬는 민감하고 순수한 장내 환경으로 인해 박테리아 안전성, 약물 효과, 오염 물질 독성 또는 화합물 간섭을 평가하기 위한 강력한 모델 역할을 합니다. GF 물고기 응용 프로그램에 대한 향후 탐색은 다양한 생활 단계에 걸친 미생물 기능에 대한 더 깊은 이해를 위해 성인 GF 물고기 모델을 만들어야 하는 다양한 분야를 포괄해야 합니다.

미생물군(즉, 고세균, 박테리아, 진핵생물 및 바이러스)은 개인의 장 장벽, 상피 표면 및 점액 기능 내에서 공생적 상호 작용을 통해 생리학적 및 병리학적 과정에 영향을 미침으로써 숙주의 건강을 유지하고 다양한 질병의 발병에 기여하는 데 중요한 역할을 합니다 1,2,3. 유아기에서 청소년기, 성인기, 노화기에 이르기까지 다양한 생애 단계에 걸친 미생물군의 구성과 비강, 구강, 피부 및 장 부위와 같은 다양한 위치에 존재하는 미생물총은 다양한 서식지와 환경에 의해 동적으로 형성됩니다4. 유기체의 장내 미생물군은 영양소 흡수, 면역 반응, 병원체 침입, 대사 조절 등에 관여합니다 5,6. 환자에 대한 연구에 따르면 장내 미생물군의 교란은 인간의 비만, 수면 장애, 우울증, 염증성 장 질환(IBD), 신경 퇴행성 질환(파킨슨병, 알츠하이머병), 노화 및 다양한 암과 관련이 있습니다 7,8,9. 또한, 장내 미생물군과 숙주 사이의 상호 작용 경로에는 염증 요인, 신경 전달 물질, 대사 산물, 장 장벽 및 산화 스트레스가 포함되며, 이는 생쥐와 어류 모델을 사용한 이전 연구에서 관찰되었습니다10,11.
최근에는 임상 및 동물 모델에서 이러한 질환에 대한 잠재적인 프로바이오틱스 및 분변 미생물군 이식(FMT)을 포함한 여러 박테리아 관련 접근법 또는 치료법이 탐구되었습니다. 이러한 탐색은 미생물군-장-뇌/간/신장 축, 미생물군 유래 산물 및 변형된 수용체 활성과 관련된 발견을 기반으로 합니다12,13. 그러나 미생물군 숙주 시스템의 개발, 다양한 기능 및 메커니즘은 미생물 군집의 복잡성과 강력한 인간과 유사한 질병 모델을 생성해야 하는 과제로 인해 여전히 완전히 이해되고 식별되지 않습니다.
이러한 문제를 해결하기 위해 19세기 중반에 무균(GF) 동물 모델이 긴급히 제안되었으며 주로 20세기에 개발되었습니다. 미생물 검출 및 관찰 기술의 발전과 함께 항생제 처리 및 gnotobiotic 모델을 포함한 후속 개선은 이러한 모델을 더욱 완성했습니다 14,15,16. 자신의 배경을 지우고 환경 미생물을 피함으로써 만들어진 GF 동물은 미생물과 숙주 사이의 상호 작용을 탐구하기 위한 훌륭한 전략을 제공한다17. 동물 모델과 정제된 프로토콜의 적용을 통해 연구원들은 GF 마우스와 어류의 환자에서 발견되는 유사한 미생물 구성을 성공적으로 복제했습니다. 또한, 개, 닭, 돼지와 같은 다른 GF 동물 모델은 연구 대상(18,19,20,21)으로서 다양한 옵션을 제공한다. 이 접근법은 인간의 암 면역 요법을 포함하여 다양한 질병에 대한 공생 마이크로바이옴의 잠재적 치료 효과에 대한 연구를 가능하게 했습니다16,18. GF 모델은 숙주 내 특정 박테리아 집락화, 이동, 증식 및 상호 작용의 특성과 메커니즘에 대한 보다 정확한 통찰력을 제공합니다. 이는 미생물총(microbiota) 관련 질병의 발생 및 발병에 대한 중요한 새로운 통찰력을 제공합니다22,23. 미생물 연구에서 GF 제브라피시를 확립하고 적용하는 역사는 2004년 Rawls et al.과 2006년 Bates et al.의 보고서에서 2017년 Melancon et al.의 프로토콜(16,24,25)로 발전했습니다. 그러나 성체 또는 번식 GF 모델의 실현 가능성은 여전히 장기간의 과정이며 다양한 수명, 성공률 및 건강 문제를 수반합니다.
다양한 동물 모델 중에서 제브라피시(Danio rerio)는 인간 장기 및 유전체학과의 유리한 유사성, 짧은 발달 주기, 높은 번식력 및 투명한 배아로 인해 기초 및 생물 의학 연구 모두에 중요한 도구로 두드러집니다19,26. 제브라피쉬는 신뢰할 수 있는 인간 질병 모델 역할을 하며, 생체 내에서 생리학적 및 병리학적 과정을 시각적으로 표현하여 숙주-미생물 상호 작용의 매력적인 특징에 대한 통찰력을 제공합니다. 특히, 제브라피쉬는 뚜렷한 세포 계통을 나타내어 장 생리학, 미생물 역학, 생식선 및 생식 발달, 숙주 면역 체계의 성숙, 행동 및 신진대사를 이미징할 수 있습니다27. 제브라피시 배아는 부화할 때까지 보호 융모막 내에서 발달하여 수정 후 3일(dpf)에 유충이 됩니다. 그들은 5 dpf에서 적극적으로 먹이를 사냥하고 수정 후 약 3 개월 (mpf) 28 성적 성숙에 도달합니다. Rawls et al.24에 의해 보고된 최초의 성공적인 무균(GF) 제브라피쉬는 난황 흡수 후 오토클레이브 사료를 먹인 유충이 8 dpf에서 조직 괴사와 20 dpf에서 총 폐사를 나타냈다는 것을 보여주었습니다. 이는 장기(>7 dpf) GF 물고기를 대상으로 한 실험에서 식이요법의 효과 또는 외인성 영양소 공급을 고려하는 것의 중요성을 나타냈다29. 후속 연구는 다양한 물고기 모델에서 완성된 멸균 식품과 방법을 사용하여 GF 물고기의 생성 프로토콜을 개선했습니다16.
그러나 GF 제브라피시 모델에 대한 대부분의 연구는 24시간에서 48시간 동안 5dpf에서 세균 감염을 포함하는 초기 생애 단계에 초점을 맞추었으며, 실험 종료 시 7dpf 이전에 수집된 샘플은 25,30,31입니다. 인간과 제브라피시를 포함한 유기체의 미생물총(microbiota)은 생명이 시작될 때 군락을 이루고 성장과 발달 과정에서 형성된다는 것은 널리 알려진 사실입니다. 이 조성은 성인 단계에서 안정적으로 유지되며, 숙주에서 미생물군의 역할은 특히 노화, 신경 퇴행성, 대사 관련 비만 및 장 질환 측면에서 일생 동안 매우 중요합니다3. 따라서 생존 기간이 더 긴 GF 동물의 관점은 어린 시절 어류 유충의 미성숙한 면역 및 생식 시스템을 고려할 때 숙주 기관 발달 및 기능에서 미생물 역할의 메커니즘에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 제브라피쉬 장의 박테리아 균주는 이전 연구에서 분리 및 확인되어 GF 동물 모델을 감염시켜 프로바이오틱스를 선택하거나 숙주19,25에서 박테리아 기능을 연구할 수 있는 가능성을 제공했지만, GF 피쉬 모델의 생성 및 적용은 주로 초기 생애 단계로 제한되어 왔습니다. 복잡한 생산 공정, 높은 유지 보수 비용, 식품 및 면역과 관련된 문제로 인한 이러한 한계는 숙주에서 미생물군의 발달 및 만성 영향을 조사하기 위한 연구 노력을 방해합니다.
특히 무균(GF) 모델에서 어류의 생존율, 행동, 성장, 성숙 및 전반적인 건강은 초기 유충에서 유년기에 이르기까지 입을 벌리고 있는 기간 동안의 영양 섭취 및 흡수를 포함하는 먹이 관행에 의해 크게 영향을 받는다32,33. 그러나 GF 어류 사육의 과제 중 하나는 적절한 멸균 식단이 부족하여 유충의 성장과 생존을 유지하기 위한 영양 지원의 효과를 제한한다는 것입니다. 이 문제를 해결하는 것은 장내 미생물군집의 부재로 인한 발달 방어 메커니즘과 약한 소화 능력을 고려할 때 GF 물고기의 생명을 회복하는 데 매우 중요합니다. 먹이 측면에서 살아있는 소금물 새우 (Artemia sp.)는 어린 물고기에게 입을 벌리고 있는 유충에게 가장 적합한 식단으로 부상하고 있습니다. 살아있는 소금물 새우를 먹인 물고기는 조리된 달걀 노른자 또는 기타 천연 및 합성 미끼를 먹인 물고기에 비해 더 높은 성장률과 생존율을 보이는 것으로 관찰되었습니다34. GF 물고기의 초기 모델은 노른자 지원으로 생존할 수 있고 GF 유충 모델은 멸균 공급으로 유지할 수 있지만 유충에서 유년기에 이르기까지 장기적인 모델을 생성하고 성적 성숙에 도달하는 것은 여전히 어려운 일입니다. 또한 플레이크 또는 분말 식품은 불균등한 영양 구성으로 인해 제한되며 수질에 영향을 미칠 수 있습니다. 대조적으로, 살아있는 쑥은 바닷물과 담수 모두에서 생존하고, 유충에서 성충까지 적합한 작은 크기, 배치의 용이성, 더 높은 부화 품질 등의 장점이 있습니다35. 이전 방법 16,24,30을 기반으로 우리는 복잡한 처리 과정을 단순화하고 쉽게 배양할 수 있는 GF 살아있는 Artemia sp.를 초기 생전 GF 물고기보다 더 오랜 기간 동안 멸균 식품으로 설정함으로써 다이어트 문제를 해결했습니다.
이 연구는 (1) 생성, (2) 유지, (3) 멸균 속도 식별, (4) 무균(GF) 제브라피쉬의 배아에서 유충 및 유년기 성장까지 보장하기 위한 유지 관리 및 먹이를 포괄하는 최적화된 프로토콜을 제시합니다. 이 결과는 GF 제브라피쉬의 부화, 생존, 성장 및 불임에 대한 예비 증거와 함께 GF Artemia sp.에 대한 필수 지표를 제공합니다. 멸균 생식품의 모델 생성 및 준비에 대한 자세한 단계는 장기 GF 물고기 모델을 구성하고 적용하는 데 중요한 기술 지원을 제공할 뿐만 아니라 미생물군-숙주 상호 작용 연구에서 GF Artemia sp.를 제공합니다. 이 프로토콜은 GF 물고기 모델에 대한 박테리아 분리, 식별 및 감염을 다루고, 박테리아 형광 라벨링 방법을 설명하고, 현미경으로 물고기 내장에서 집락을 관찰합니다. GF 물고기, 박테리아 감염이 있는 gnotobiotic 물고기 또는 이식된 인간 미생물군 모델은 숙주 면역, 소화, 행동, 전사체 조절 및 대사 측면에 대한 기능과 효과를 설명하기 위해 다양한 검출을 거칩니다. 장기적으로 이 프로토콜은 해양 메다카와 같은 다양한 야생형 어종으로 확장될 수 있으며, 잠재적으로 특정 조직이나 질병과 관련이 있는 다른 선택된 형질전환 제브라피시 계통으로 확장될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>AB-GZM</td><td>암포테리신: 솔라바이오; &nbsp; kanamycin : 솔라 바이오; 암피실린 : 솔라 바이오.</td><td>암포 테리신 : CAS : 1397-89-3; kanamycin : CAS : 25380-94-0; 암피실린 : CAS : 69-52-313.</td><td>49.6 mL GZM, 50 &마이크로; L 암포테리신 원액(250 &micro; g/mL), 25 &마이크로; L 카나마이신 원액 (10 mg/mL) 및 250 &마이크로; L 암피실린 원액(20mg/mL).</td></tr><tr><td>1.5 mL, 15 mL, 50 mL EP 튜브</td><td>biosharp</td><td>BS-15-M</td><td>샘플 수집 및 보유 에이전트</td></tr><tr><td>2.4 g/L NaClO</td><td>XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd.</td><td>CAS : 7681-52-9</td><td>8 % 차아 염소산 나트륨 수용액으로 희석.</td></tr><tr><td>6웰 플레이트, 24웰, 48웰 플레이트</td><td>LABSELECT&nbsp;</td><td>11112</td><td>어류를 배양하려면</td></tr> <tr><td>Aeronomas</td><td>NCBI 데이터베이스</td><td>번호 MK178499</td><td>2019-JPP-ESN</td></tr><tr><td>혐기성 TSA 플레이트</td><td>트립톤:옥소이드 ; 대두 펩톤:Solarbio ; NaCl : 바이오 샤프; 한천 분말 : BioFroxx.</td><td>트립톤:LP0042B; 대두 펩톤:Cat#S9500; NaCl: BS112; 한천 분말 : 9002-18-0.</td><td>TSA 플레이트는 혐기성 시스템 하에서 트립톤 6g, 대두 펩톤 2g, NaCl 2g 및 한천 분말 6g을 함유하는 400mL 배지로 준비되었습니다.</td></tr><tr><td>혐기성 작업장</td><td>GENE SCIENCE</td><td>E200G</td><td>세균 분리, 멸균 테스트</td></tr><tr><td>분석</td><td>GraphPad Prism 5</td><td>v6.07</td><td>데이터 분석</td></tr><tr><td>API 20 E 키트</td><td>&nbsp; BioMerieux SA, France</td><td>No.1005915090</td><td>Ref 20100 세균 대사 감지 키트</td></tr><tr><td>Artemia (소금물 새우)</td><td>Shangjia Aquarium Co., Ltd.</td><td>Aquamaster 브랜드</td><td>Artemia 낭종, 그리고 소금물 새우 달걀&nbsp;</td></tr><tr><td>어류 양식을위한 자동 사이클 시스템</td><td>Ningbo Hairui Technology Co., Ltd</td><td>No Cat No</td><td>Cat Keep the fish</td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Zeal Way</td><td>G154DWS</td><td>재료 BHI</td></tr><tr><td>호기성</td><td>Coolaber</td><td>Cat#PM0640</td><td>BHI 배지를 제조했으며, 100mL 배지에는 3.7g BHI 분말이 포함되었습니다.</td></tr><tr><td>BHI 혐기성</td><td>쿨라버</td><td>Cat#PM0640</td><td>BHI 배지를 제조하여 혐기성 시스템 하에서 혐기성 튜브로 나누었습니다.</td></tr><tr><td>생화학 인큐베이터</td><td>LongYue Co., Ltd</td><td>SPX</td><td>물고기와 접시 생물</td></tr><tr><td>안전 캐비닛</td><td>Haier</td><td>HR40-IIA2</td><td>멸균 처리 및 테스트</td></tr><tr><td>표백제 0.02 g / L NaClO</td><td>XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd.</td><td>CAS : 7681-52-9</td><td>차아 염소산 나트륨 (NaClO) 농도의 작업 용액 : 8 % 차아 염소산 나트륨 수용액 또는 166.6 uL 6 % 차아 염소산나트륨으로 500 mL 증류수로 희석.</td></tr><tr><td>혈액 플레이트</td><td>양 혈액 : Solarbio</td><td>Cat. NO. TX0030</td><td>멸균 제세화 된 양 혈액을 TSA에 첨가하여 5 % 혈액 플레이트를 준비했습니다.</td></tr><tr><td>세포 배양 플라스크</td><td>Corning</td><td>430639</td><td>물고기</td></tr><tr><td>CM-Dil 염료</td><td>분자 프로브</td><td>Cat#C7000&nbsp; &nbsp;</td><td>박테리아에 라벨을 붙이려면</td></tr><tr><td>항온 진탕 인큐베이터</td><td>Peiving Co., Ltd</td><td>HZQ-X100</td><td>박테리아 배양</td></tr><tr><td>데이터베이스</td><td>NCBI</td><td>박테리아 및 고세균 데이터베이스</td><td>링크: 고세균 FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Archaea/ 세균 FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Bacteria/</td></tr> <tr><td>일회용 파스퇴르 피펫</td><td>biosharp</td><td>bs-xh-03l</td><td>물을 바꾸고 달걀을 옮기는 데 사용</td></tr><tr><td>일회용 페트리 디쉬</td><td>biosharp</td><td>BS-90-D</td><td>배양 물고기</td></tr><tr><td>DNA 키트</td><td>Solaribio</td><td>Cat#D1600</td><td>세균 게놈 DNA 추출 키트&nbsp;</td></tr><tr><td>전기피펫</td><td>SCILOGEX</td><td>Levo me</td><td>Change water</td></tr><tr><td>Exiguobacterium</td><td>NCBI database</td><td>No.MK178504</td><td>2019-JPP-ESN</td></tr><tr><td>GZM</td><td>Sea salt:LANDEBAO Co., Ltd.</td><td>고양이 없음</td><td>물 1L와 천일염 용액 1.5mL(40g/L)로 구성, 오토클레이브. GZM 용액의 바다 소금 함량은 60mg/L였습니다.</td></tr><tr><td>실험실 순수 시스템</td><td>Hitech Co., Ltd</td><td>Prima-S15</td><td>에이전트 준비</td></tr><tr><td></td><td>Microscope Nikon</td><td>SMZ18</td><td>형광등이 있는 물고기 유충</td></tr><tr><td>PCR 키트</td><td>TIANGEN</td><td>Cat#ET101</td><td>Taq DNA Polymerase kit</td></tr><tr><td>Pipette</td><td>LABSELECT&nbsp;</td><td>sp-013-10</td><td>물</td></tr><tr><td>포비돈 요오드 (PVP-I)</td> <td>알라딘</td><td>Lot # H1217005</td><td>수용액 포비돈 요오드 0.4g / L 순수.</td></tr><tr><td>타이밍 변환기</td><td>PinYi Co., Ltd</td><td>AL-06</td> 빛 TSA 플레이트<td>를 조절하기 위해</td></tr><tr><td></td><td>트립톤 : 옥소이드 ; 대두 펩톤:Solarbio ; NaCl : 바이오 샤프; 한천 분말 : BioFroxx.</td><td>트립톤:LP0042B; 대두 펩톤:Cat#S9500; NaCl: BS112; 한천 분말 : 9002-18-0.</td><td>TSA 플레이트는 트립톤 6g, 대두 펩톤 2g, NaCl 2g, 한천 분말 6g을 함유하는 400mL 배지로 제조되었습니다.</td></tr><tr><td>TSB 호기성</td><td>트립톤:옥소이드 ; 대두 펩톤:Solarbio ; NaCl : 바이오 샤프;</td><td>트립톤:LP0042B; 대두 펩톤:Cat#S9500; NaCl: BS112;</td><td>TSB 배지를 제조하였고, 400 mL 배지에는 트립톤 6g, 대두 펩톤 2g 및 NaCl 2g이 포함되었습니다.</td></tr><tr><td>TSB 혐기성</td><td>트립톤:옥소이드 ; 대두 펩톤:Solarbio ; NaCl : 바이오 샤프;</td><td>트립톤:LP0042B; 대두 펩톤:Cat#S9500; NaCl: BS112;</td><td>TSB 배지를 제조하여 혐기성 시스템 하의 혐기성 튜브로 분할하였다.</td></tr><tr><td>초청정 작업대</td><td>Airtech</td><td>SW-CJ-2FD</td><td>멸균 처리 및 테스트</td></tr><tr><td>어류 배양을 위한 초순수 흐름 시스템</td><td>해양 생물 장비 회사</td><td>No Cat</td><td>어류용 물 생산</td></tr><tr><td>Vibrio</td><td>NCBI 데이터베이스</td><td>번호 MK178501</td><td>2019-JPP-ESN</td></tr></tbody></table>

유충에서 유년기까지 무균 제브라피시 모델의 생성, 유지 관리 및 식별

Generation, Maintenance, and Identification of Germ-Free Zebrafish Models from Larvae to Juvenile Stages

제브라피쉬는 포유류와의 게놈적 유사성, 상대적으로 깨끗한 융모막 환경에서 발달한 투명한 배아, 설치류 모델에 비해 매우 빠른 유충 발달로 인해 성장, 면역 및 장내 미생물군에 대한 연구에 귀중한 모델 역할을 합니다. 무균(GF) 제브라피시(Danio rerio)는 오염 물질 독성을 평가하고 미생물 기능과 관련된 인간과 유사한 질병 모델을 확립하는 데 중요합니다. Conventionally Raised (CR) 모델 (일반 양식의 물고기)과 비교하여 GF 제브라피쉬는 숙주 미생물군을 보다 정확하게 조작할 수 있어 미생물과 숙주 간의 인과 관계를 결정하는 데 도움이 됩니다. 결과적으로, 그들은 이러한 관계에 대한 우리의 이해를 발전시키는 데 중요한 역할을 합니다. 그러나 GF 제브라피시 모델은 일반적으로 면역 기능과 영양소 흡수의 제한으로 인해 초기 생애 단계(배아에서 유충까지)에서 생성 및 연구됩니다. 이 연구는 GF 식품( 예: Artemia sp., 염수 새우)을 사용하여 먹이를 주지 않고 장기간 먹이를 주는 초기 GF 제브라피시 모델의 생성, 유지 관리 및 식별을 최적화합니다. 프로세스 전반에 걸쳐 일일 샘플링 및 배양이 수행되었으며 플레이트 및 16S rRNA 염기서열분석을 포함한 여러 검출을 통해 식별되었습니다. GF 제브라피쉬의 무균 속도, 생존 및 발달 지수를 기록하여 생성된 모델의 품질과 수량을 보장했습니다. 중요한 것은 이 연구가 GF 물고기에 대한 박테리아 분리 및 감염 기술에 대한 세부 정보를 제공하여 GF 식품 지원을 통해 유충에서 유년기까지 GF 물고기 모델을 효율적으로 생성할 수 있다는 것입니다. 이러한 절차를 생물 의학 연구에 적용함으로써 과학자들은 장내 박테리아 기능과 숙주 건강 간의 관계를 더 잘 이해할 수 있습니다.

GF 제브라피쉬 모델은 제브라피쉬 쌍에 의해 산란되는 풍부한 알을 활용하여 효율적으로 생산할 수 있으며, 이전 GF 피쉬 모델(35)을 기반으로 최적화된 프로토콜로 생산할 수 있습니다. 단일 6웰 플레이트는 약 30-48개의 배아/유충을 배양할 수 있어 충분한 데이터 수집 및 통계 분석이 가능합니다. 멸균 처리 후, GF 배아는 48-72 시간에 유충으로 부화 할 때까지 깨끗한 인큐베이터에서 배양되며, 무균 상태를 유지하는 데 중요한 수집 된 샘플의 검출로 GZM을 매일 변경했습니다 (그림 1). 7 dpf 후에는 유충에서 유년기까지 난황과 살아있는 쑥 의 먹이를 준비해야합니다. 어류의 성장과 발달 과정에서 GZM의 부피, 용기 및 밀도는 멸균 상태의 폐사 및 실패를 방지하기 위해 적시에 조절되거나 변경되어야 합니다. 검출 결과 세균 오염이 나타나지 않으면 성공적인 GF 모델은 청소년기부터 초기 성인기까지 만성 모델로 유지될 수 있지만 실제로는 생존율이 훨씬 낮습니다. 마지막으로, GF 및 CR 어류 모델의 멸균률, 생존율, 발달 지수, 행동, 조직 병리학적 분석 및 전사 프로필을 측정하여 미생물군 및 약물 스크리닝 분야의 영향을 탐색할 수 있습니다. 이 연구에서는 주요 발달 지표를 비교했으며(보충 그림 1), GF 물고기의 부화율은 CR 물고기보다 45.7% 낮았으며 72hpf에서 60%였습니다. 7 dpf에서 GF 유충의 심박수는 22.6 beats/10 s의 CR fish에 비해 18.2 beats/10 s에서 유의하게 낮았지만, 23.5-23.8 beats/10 s의 비율로 14 dpf에서 두 그룹 간에 차이가 없었습니다. 7 dpf에서 GF 어류의 생존율은 86.7 %로 CR 어류와 같았지만 14 dpf에서 60 %로 CR 어류의 80 %에 비해 감소했습니다. 그러나 GF 및 CR 물고기의 생존율은 섭식 능력이나 습관을 습득 한 입 열린 기간 후에 25 % -10 %로 감소했습니다. 물고기의 무균 상태를 유지하지 못한 것이 생존율이 낮은 이유 중 하나였습니다. 따라서 유년기부터 초기 성체기까지 먹이를 주고 영양을 유지하는 것은 어류 양식에서 중요한 과제입니다.
물고기의 성장과 발달에 영향을 미치는 또 다른 핵심 요소는 먹이입니다. 이 연구에서는 청소년 및 성인에게 장기간 GF 제브라피시 유충을 위한 생식품으로 GF Artemia 를 얻는 여러 방법을 탐구합니다( 그림 2 참조). GF 물고기를 위한 음식의 매일 사용으로 인해, GF Artemia 에 대한 최적화된 프로토콜은 실제로 쉽고 시간을 절약하며 경제적이어야 합니다. 현미경으로 관찰한 nauplii 의 적극적인 움직임과 사멸/부동성, nauplii의 특성, 부화되지 않은 알, 껍질을 비교한 후 방법을 완성했습니다. 매일 배양 후 병에서 얻은 신선한 GF Artemia 의 부화, 생존 및 변형률, nauplii의 길이와 무게를 포함한 지표를 현미경으로 관찰하고 측정했습니다(그림 3). 치료 후 쑥 낭종의 부화율은 평균 88.15%로 높았고 , 수영낭 종의 생존율은 77.83%, 기형율은 1.87%였다. 나우플리의 몸길이는 546.70μm, 체중지수는 3.80mg/100으로 유충 개원기부터 유년기 및 성충기까지 물고기를 잡아 먹이기에 적합하다.
GF 물고기와 GF Artemia 의 감지는 모델 유지 관리에도 중요합니다. 샘플 수집 및 여러 테스트 방법에 따르면 결과는 배양 플레이트와 액체 배지에서 처리된 제브라피시 배아 및 아르테미아 낭종의 성공을 제공할 수 있습니다(그림 4). 매일 수집되는 다양한 샘플은 모든 테스트 방법에서 멸균 상태로 감지되어야 하며, 이는 수집 시점의 GF 모델을 나타낼 수 있습니다. GF Artemia 는 GF 물고기를 먹기 전에 감지해야 하며, 또는 플레이트 및 배지 인큐베이터 결과는 신선한 살아있는 nauplii의 멸균 상태를 참조해야 합니다. 즉, 쉐이크 배양에서 TSA 플레이트 또는 TSB 또는 BHI 액체 배지 유리의 낭종에서 GF Artemia 를 배양하여 GF Artemia 와 멸균 검증을 동시에 생성하는 데 사용할 수 있습니다. GF Artemia 프로토콜은 먹이를 위해 제한된 수의 유충을 수용할 수 있습니다. 먹이를 주는 과정에서 GF Artemia 가 GZM 내에서 헤엄친 다음 GF 물고기 유충에게 포획되어 먹히는 것이 분명했습니다.
GF 물고기 모델의 응용 분야에는 생물학 및 의학의 다양한 분야가 관련되어 있어 미생물 기능, 성장 및 발달, 질병 메커니즘, 프로바이오틱스 또는 약물 스크리닝 등을 조사할 수 있습니다46. 예를 들어, 이 연구에서는 두 가지 주요 장내 세균인 Aeromonas sp.와 Vibrio sp.를 제브라피시에서 분리했습니다. 콜로니 특성 및 식별을 수행하고, 상업적으로 이용 가능한 키트를 사용하여 시험관에서 여러 대사 기능을 측정했습니다(그림 5). 이들 박테리아는 16S 염기서열분석으로 분리하고 확인하였으며, 폭발 결과는 이전 보고서(42)에 제시되었다. 확인된 박테리아 균주는 GF 물고기 모델을 감염시켜 단일 또는 결합 미생물군이 숙주 건강에 미치는 영향에 대한 과학적 연구를 가능하게 합니다. 물고기 유충의 투명성으로 인해 CM-Dil 염료를 사용하여 형광 표지 박테리아 세포를 관찰할 수 있어 GF 물고기의 장에서 집락 형성 및 분포를 확인할 수 있습니다( 그림 6 참조). 5 dpf에서 세균 감염 후, GF 제브라피시 유충은 형광 현미경으로 이미지화하고 6에서 14 dpf까지 지속적으로 관찰할 수 있으며, 발달 지표, 조직 병리학적 변화 및 분자 변화와 결합된 미생물 기능에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다47.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66512/66512fig01.jpg"> 그림 1: 배아에서 유충 및 유년기에 이르는 GF 제브라피시의 프로토콜. GF 제브라피시 생성의 주요 단계는 다음과 같습니다: (1) 야생형 제브라피시에서 배아를 채취하고 AB-GZM에 배치합니다. (2) 완전한 멸균을 보장하기 위해 PVP-I 및 NaClO 제제로 헹굼 처리합니다. (3) GZM을 사용한 6웰 플레이트에서 GF 배아/유충 배양, 매일 배지 갱신. (4) 최적의 성장과 발달을 위한 배양 조건의 조절. (5) 다양한 발달 단계에서 샘플링한 후 플레이트 및 액체 배지 방법을 사용한 무균 테스트. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66512/66512fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66512/66512fig02.jpg"> 그림 2: GF 물고기를 위한 살아있는 음식으로서의 GF Artemia 준비 프로토콜. 주요 단계는 다음과 같습니다: (1) 완전한 멸균을 위한 아르테미아 낭종의 헹굼 처리. (2) 배지에서 GF 낭종의 제조. (3) 부화를 촉진하기 위해 24 시간 동안 소금 용액에서 배양합니다. (4) 활성 nauplii를 수집하기 위해 부화에 실패한 알과 빈 알을 여과합니다. (5) 수거된 나우플리를 세척하여 이물질을 제거하여 고품질의 오염되지 않은 생식품을 보장합니다. (6) GF 물고기 유충에 먹이기 전에 GF Artemia 의 무균 테스트. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66512/66512fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66512/66512fig03.jpg"> 그림 3: 24시간 동안 배양한 GF 아르테미아 낭종 및 나우플리의 인덱스. (A) 불순물 필름이 있는 처리되지 않은 아르테미아 낭종(눈금바: 500μm). (B) 수분 흡수 후 표면이 약간 볼록하고 더 깨끗한 외관으로 처리된 쑥 낭종(눈금자: 500μm). (C) 신선하게 배양된 살아있는 GF Artemia nauplii (스케일 바: 2000 μm)의 현미경 검사 및 (D) 1000 μm의 스케일 바를 사용한 배율. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66512/66512fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66512/66512fig04.jpg"> 그림 4: 각 생애 단계에서 GF 물고기 및 GF Artemia의 멸균 감지. (A) 호기성 및 혐기성 조건에서 TSB 및 BHI 액체 매체, TSA 및 혈액판을 사용한 CR 및 GF 어류 샘플의 멸균 테스트. (B) 호기성 및 혐기성 조건에서 TSB 및 BHI 액체 배지, TSA 및 혈액판을 사용하여 치료되지 않은 아르테미아 낭종, GF 아르테미아 낭종 및 나우플리이 의 멸균 테스트. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66512/66512fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66512/66512fig05.jpg"> 그림 5: 제브라피쉬의 장내 세균 분리 및 식별. (A) 박테리아 균주, 콜로니의 특성, 16S 염기서열분석 맵(예: Aeromonas sp. 및 Vibrio sp.). (B) 속(Genus) 및 NCBI 가입. (C) 제브라피시 장에서 분리한 박테리아의 대사 기능. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66512/66512fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66512/66512fig06.jpg"> 그림 6: GF 제브라피시에서 장내 세균 균주의 감염 및 집락화. (A) 감염 실험을 위해 분리되고 확인된 박테리아 균주의 회수. (B) 형광 염료를 사용한 박테리아 표지 및 5 dpf에서 GF 제브라피시 유충 감염. 배율 : 1x. (C) 생체 내 장내 조직에서 박테리아(Vibrio sp.)의 분포 및 집락화 관찰. 배율 : 3x. (D) 일일 샘플링을 통해 각 물고기 유충에서 박테리아 (Aeromonas sp. 및 Vibrio sp.)의 CFU 계산. 데이터는 SEM± 평균을 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66512/66512fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>뇌관</td>
			<td>시퀀스(5'-3')</td>
			<td>제품 길이</td>
		</tr><tr><td>27층</td>
			<td>아가그트가트가트트카그</td>
			<td rowspan="2">1465 bp</td>
		</tr><tr><td>1492R</td>
			<td>ACGGYTACCTTGT타크액트</td>
		</tr><tr><td>63층</td>
			<td>CAGGCCTAACACATGCAAGTC (영어)</td>
			<td rowspan="2">1324 BP</td>
		</tr><tr><td>1387R</td>
			<td>GGGCGGWGTGTACAAGGC</td>
		</tr></tbody></table>표 1: 박테리아 검출에 사용되는 프라이머.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>구성 요소</td>
			<td>단위</td>
			<td>부피 (μL)</td>
		</tr><tr><td>Taq DNA 중합효소</td>
			<td>2.5 U/μL</td>
			<td>0.1</td>
		</tr><tr><td>10× 완충액(Mg2+)</td>
			<td>---</td>
			<td>2.1</td>
		</tr><tr><td>dNTP 혼합물</td>
			<td>2.5 밀리미터</td>
			<td>1.6</td>
		</tr><tr><td>프라이머 27F</td>
			<td>10 마이크로미터</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>프라이머 1492R</td>
			<td>10 마이크로미터</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>DNA/RNA 무료 H2O</td>
			<td>---</td>
			<td>13.2</td>
		</tr><tr><td>템플릿 DNA</td>
			<td>---</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>총 볼륨</td>
			<td>---</td>
			<td>20</td>
		</tr></tbody></table>표 2: 반응당 성분의 최종 농도 및 부피.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>걸음</td>
			<td>온도</td>
			<td>시간</td>
			<td>사이클</td>
		</tr><tr><td>초기 변성</td>
			<td>95 캜</td>
			<td>4 민</td>
			<td>--</td>
		</tr><tr><td>변성</td>
			<td>94 캜</td>
			<td>1분</td>
			<td rowspan="3">35</td>
		</tr><tr><td>어 닐 링</td>
			<td>55 캜</td>
			<td>1분</td>
		</tr><tr><td>확장</td>
			<td>72 캜</td>
			<td>1분</td>
		</tr><tr><td>최종 확장</td>
			<td>72 캜</td>
			<td>10분</td>
			<td>--</td>
		</tr><tr><td>들다</td>
			<td>4 캜</td>
			<td>∞</td>
			<td>--</td>
		</tr></tbody></table>표 3: 16S rRNA 유전자의 증폭을 위한 PCR 프로그램.
보충 그림 1: GF 및 CR 제브라피시 모델의 중요한 발달 지수. (A) 72 hpf에서 CR 및 GF 제브라피쉬의 부화 속도, (B) 7 dpf 및 14 dpf에서 CR 및 GF 물고기의 심장 박동 / 10 초. CR 및 GF 물고기의 생존율(%)은 30dpf에서 86%, 60%-80%로 7일 및 14일에서 10%-25%로 감소했습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66512/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 프로토콜은 무균(GF) 어류 배아를 얻고 유충에서 유년기까지 유지하기 위한 주요 단계를 간략하게 설명하며, 여기에는 불임 상태 샘플링 및 감지가 포함됩니다. 감염과 함께 GF 모델을 사용하는 것은 숙주 건강에서 미생물의 역할을 이해하는 데 중요합니다.

Zebrafish serve as valuable models for research on growth, immunity, and gut microbiota due to their genomic similarities with mammals, transparent ...

이 연구의 범위는 다양한 마이크로바이옴 기능을 조사하는 데 유용하고 강력한 도구가 될 새로운 무균 동물 모델의 생성입니다. 이 분야에서는 최근 초기의 무균 어류 모델이 사용되고 있지만, 다양한 양식 조건과 직원 발달 방어로 인해 장기적인 모델은 여전히 제한적입니다. 현재 GF 물고기 모델은 일반적으로 초기 생명 모델입니다.따라서 멸균 스케일, 시료 검출 방법 및 멸균 식품 제공을 포함한 기술은 극복해야 할 매우 중요한 과제입니다. 무균 제브라피시 모델은 숙주-미생물군의 상호 작용과 이가 발달, 면역 및 질병에 미치는 영향을 연구하는 데 매우 중요합니다. 이 모델을 통해 연구자들은 단일 장내 세균을 정밀하게 조작하고 투명한 제브라피시 배아에 미치는 영향을 관찰할 수 있습니다.이 연구는 질병을 유전하는 장내 미생물의 역할에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다. 앞으로 우리의 연구는 장내 마이크로바이옴의 기능을 더 잘 이해하기 위해 전체 수명 주기에 대한 무균 제브라피시 모델을 확립하는 데 주로 중점을 둘 것입니다.

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연구

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