Name: Fast Protein 액체 크로마토그래피 시스템을 사용한 6X-His-Tagged 단백질의 친화성 정제 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-26T13:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: 학습하세요 FPLC 시스템을 활용한 6X-His-Tagged 단백질 친화성 정제 방법을. FEN1 단백질을 정제하여 DNA 복제 및 수복 과정에서의 기능을 연구하고 생물학적 역할을 이해하는 데 활용할 수 있습니다.

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<meta charset="utf8"></head><body>His-tagged FEN1 단백질의 효율적인 정제를 위한 FPLC 최적화

<ol><li>Balakrishnan, L., Bambara, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flap+endonuclease+1%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Flap endonuclease 1.</a> Annu Rev Biochem. 82, 119-138 (2013).</li>
<li>Asagoshi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FEN1+functions+in+long+patch+base+excision+repair+under+conditions+of+oxidative+stress+in+vertebrate+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">FEN1 functions in long patch base excision repair under conditions of oxidative stress in vertebrate cells.</a> Mol Cancer Res. 8 (2), 204-215 (2010).</li>
<li>Lyamichev, V., Brow, M. A., Dahlberg, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-specific+endonucleolytic+cleavage+of+nucleic+acids+by+eubacterial+DNA+polymerases%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure-specific endonucleolytic cleavage of nucleic acids by eubacterial DNA polymerases.</a> Science. 260 (5109), 778-783 (1993).</li>
<li>Bornarth, C. J., Ranalli, T. A., Henricksen, L. A., Wahl, A. F., Bambara, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+flap+modifications+on+human+FEN1+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Effect of flap modifications on human FEN1 cleavage.</a> Biochemistry. 38 (40), 13347-13354 (1999).</li>
<li>Xu, Y., Potapova, O., Leschziner, A. E., Grindley, N. D., Joyce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contacts+between+the+5%27+nuclease+of+DNA+polymerase+I+and+its+DNA+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Contacts between the 5' nuclease of DNA polymerase I and its DNA substrate.</a> J Biol Chem. 276 (32), 30167-30177 (2001).</li>
<li>Wen-Hui, K., Kuo, K., Chase, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+the+interactions+between+poly-histidine+fusion+tagsand+immobilized+metal+ions%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Lett%22%5BJournal%5D)">Exploiting the interactions between poly-histidine fusion tagsand immobilized metal ions.</a> Biotechnol Lett. 33 (6), 1075-1084 (2011).</li>
<li>Charlton, A., Zachariou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilized+metal+ion+affinity+chromatography+of+native+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Immobilized metal ion affinity chromatography of native proteins.</a> Methods Mol Biol. 421, 25-35 (2008).</li>
<li>Ononye, O. E., Njeri, C. W., Balakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+DNA+processing+enzyme+FEN1+and+its+regulation+by+protein+lysine+acetylation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of DNA processing enzyme FEN1 and its regulation by protein lysine acetylation.</a> Methods Mol Biol. 1983, 207-224 (2019).</li>
<li>Econo-column flow adaptor instruction manual. Bio-Rad. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M7380014.pdf">https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M7380014.pdf</a> (2015).</li>
<li>NGC Chromatography systems and ChromLab software instrument guide version 3.3. Bio-Rad. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/10026252.pdf">https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/10026252.pdf</a> (2015).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>4x Laemmli 시료 완충액</td><td>BioRad</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Merck</td><td>UN2789</td><td></td></tr><tr><td>베타-메르캅토에탄올(BME)</td><td>Sigma</td><td>M-6250</td><td></td></tr><tr><td>Chromlab 소프트웨어 버전 6.1.27.0</td><td>BioRad</td><td></td>는 <td>NGC 시스템을 운영합니다.</td></tr> 완전한 <tr><td>MINI 프로테아제 억제제 정제</td><td>Roche</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue</td><td>R Sigma</td><td>B0149</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Dot Scientific</td><td>DSD11000</td><td></td></tr><tr><td>Econo-Column glass</td><td>BioRad</td><td>7371512</td><td></td></tr><tr><td>Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA)</td><td>Dot Scientific</td><td>DSE57020</td><td></td></tr><tr><td>Flow adaptor</td><td>BioRad</td><td>7380014</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Dot Scientific</td><td></td><td></td>DSG22020</tr><tr><td>Imidazole</td><td>Dot Scientific</td><td>DSI52000</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412</td><td></td></tr><tr><td>Mini PROTEAN TGX 젤</td><td>BioRad</td><td>4561084</td><td></td></tr><tr><td>NGC 크로마토그래피 시스템</td><td>BioRad</td><td></td><td>자동 액체 크로마토그래피 시스템&nbsp;</td></tr><tr><td>Ni-NTA 아가로스</td><td>Qiagen</td><td>1018244</td><td></td></tr><tr><td>Phenyl-methyl-sulfonyl fluoride</td><td>Dot Scientific</td><td>DSP20270</td><td></td></tr><tr><td>PreScission Plus 단백질 이중 색상 표준&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>1610374</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>도트 사이언티픽</td><td>DSS23020</td><td></td></tr><tr><td>TALON 금속 친화 수지</td><td>Takara</td><td>635502</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td></td><td>DST60040</td><td></td></tr></tbody></table>

fast protein 액체 크로마토그래피 시스템을 사용한 6x-his-tagged 단백질의 친화성 정제 

Affinity Purification of a 6X-His-Tagged Protein using a Fast Protein Liquid Chromatography System

hFEN1을 발현하는 BL21(DE3) 세포 용해물을 평형화된 Ni-NTA 및 TALON 수지를 통과시켰다. Ni-NTA 수지는 Ni2+ 이온으로 충전되어 높은 결합 능력을 가지고 있습니다. 그 결과 Ni-NTA 수지는 TALON 수지에 비해 더 많은 양의 FEN1을 산출하는 것으로 나타났습니다(그림 7). Ni-NTA 수지는 또한 다른 염색체로 발현되는 단백질에 비특이적으로 결합하는 것으로 알려져 있습니다. 코발트계 수지를 통과한 세포 용해물은 Ni-NTA에 비해 순도는 높지만 수율이 낮게 정제되었습니다. 다른 많은 DNA 결합 단백질과 마찬가지로 FEN1은 불순물을 제거하기 위해 크기 배제 수지를 추가로 통과했습니다. hFEN1은 43kDa 마크에서 식별할 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66529/66529fig01.jpg"> 그림 1: hFEN1에 의한 플랩 절단 메커니즘: 추적 대 스레딩. FEN1(노란색으로 표시)은 처음에는 플랩 구조의 5' 끝에 결합되어 플랩 베이스(왼쪽)까지 추적되는 것으로 생각되었습니다. 이후 연구에 따르면 FEN1은 먼저 플랩 베이스에 결합하고 활성 부위(오른쪽)를 통해 5' 플랩을 끼우는 것으로 나타났습니다. 약어: hFEN1 = 인간 플랩 엔도뉴클레아제 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66529/66529fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66529/66529fig02.jpg"> 그림 2: 플로우 어댑터. (A) 컬럼 패킹 및 정제 공정에 사용되는 플로우 어댑터의 구성 요소; (B) O-링을 조이거나 풀고 어댑터를 제자리에 고정하는 데 사용되는 캠 래치의 세 위치. 확대된 이미지는 위에서 아래로 위치 1,2, 3에서 O-링의 상태(느슨한/팽팽한)를 보여줍니다. 이미지는 9의 허가를 받아 촬영되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66529/66529fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66529/66529fig03.jpg"> 그림 3: Fast protein 액체 크로마토그래피 시스템의 주입 모듈. 주입 모듈의 다양한 포트는 고속 단백질 액체 크로마토그래피 시스템을 컬럼, 시료 루프 및 폐기물에 연결합니다. 이미지는 10의 허가를 받아 촬영되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66529/66529fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66529/66529fig04.jpg"> 그림 4: 시스템 제어. (A) 흐름 설정을 조작할 수 있고 흐름 경로를 볼 수 있는 시스템 제어 탭; (B) 유량 설정 창; (C) 펌프 설정 창. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66529/66529fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66529/66529fig05.jpg"> 그림 5: 분석법 설정 창. 컬럼 유형(column type), 컬럼 부피(column volume), 분석법 기본 단위(method base unit) 및 실행에 대한 유속(flow rate)과 같은 정제 세부 정보를 입력할 수 있는 창입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66529/66529fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66529/66529fig06.jpg"> 그림 6: FPLC 중 UV 곡선의 개략도: UV 곡선은 정제 단계에 따라 상승 및 하강합니다. 평형을 시작할 때 UV 곡선은 튜브에 기포나 오염 물질이 존재하기 때문에 왜곡될 수 있습니다. 평형이 계속됨에 따라 곡선은 평평한 선으로 안정화되어야 합니다. 시료 주입 중에 수지에 결합되지 않은 단백질이 흘러 나오면 최대 임계값에 도달할 때까지 UV 곡선이 상승합니다. 잔류 결합되지 않은 단백질을 씻어내는 세척 단계는 UV 측정에서 점진적인 감소를 보여줍니다. 마지막으로, 용리 단계에서 표적 단백질이 용리되면 UV 곡선에서 피크가 보입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66529/66529fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66529/66529fig07.jpg"> 그림 7: SDS PAGE 겔 이미지. Lane 1-Molecular weight 마커; 레인 2-1% Ni-NTA 입력(셀 용해물); Ni-NTA 수지로부터의 레인 3-1% 플로우스루; Ni-NTA 수지로부터 정제된 레인 4-hFEN1; 레인 5-1% 입력(세포 용해물); 코발트계 수지로부터의 레인 6-1% 플로우스루; 코발트 기반 수지로부터 정제된 Lane 7-hFEN1; 검은색 화살표는 42.5kDa에서 FEN1을 나타냅니다. 약어: SDS-PAGE = 소듐 도데실 설페이트; MW = 분자량; hFEN1 = 인간 플랩 엔도뉴클레아제 1; NTA = 니트릴로트리아세트산. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66529/66529fig07large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>버퍼 및 용액</td>
			<td>구성 요소</td>
		</tr><tr><td rowspan="8">용해 완충액</td>
			<td>50mM 트리스-HCl [pH 8.0]</td>
		</tr><tr><td>500mM NaCl</td>
		</tr><tr><td>1mM 베타 메르캅토에탄올(BME)</td>
		</tr><tr><td>1mM 페닐-메틸설포닐 플루오라이드(PMSF)</td>
		</tr><tr><td>1mM 방전성 암</td>
		</tr><tr><td>1 정제 완전한 프로테아제 억제제</td>
		</tr><tr><td>10mM 이미다졸</td>
		</tr><tr><td>10% 글리세롤</td>
		</tr><tr><td rowspan="6">평형/세척 버퍼</td>
			<td>50mM 트리스-HCl [pH 8.0]</td>
		</tr><tr><td>500mM NaCl</td>
		</tr><tr><td>1mM BME</td>
		</tr><tr><td>1mM PMSF</td>
		</tr><tr><td>10mM 이미다졸</td>
		</tr><tr><td>10% 글리세롤</td>
		</tr><tr><td rowspan="6">용리 완충액</td>
			<td>50mM 트리스-HCl [pH 8.0]</td>
		</tr><tr><td>500mM NaCl</td>
		</tr><tr><td>1mM BME</td>
		</tr><tr><td>1mM PMSF</td>
		</tr><tr><td>1M 이미다졸</td>
		</tr><tr><td>10% 글리세롤</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">SDS 샘플 로딩 버퍼</td>
			<td>900 μL 4x Laemmli 시료 완충액</td>
		</tr><tr><td>100 μL BME</td>
		</tr><tr><td rowspan="4">Coomassie 브릴리언트 블루 염색 용액</td>
			<td>50 % ddH2O</td>
		</tr><tr><td>40% 메탄올</td>
		</tr><tr><td>10% 아세트산</td>
		</tr><tr><td>0.1% 쿠마시 브릴리언트 블루 R-250</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">탈색 용액</td>
			<td>50 % ddH2O</td>
		</tr><tr><td>40% 메탄올</td>
		</tr><tr><td>10% 아세트산</td>
		</tr></tbody></table>표 1: 버퍼 구성.

Fast Protein 액체 크로마토그래피 시스템을 사용한 6X-His-Tagged 단백질의 친화성 정제 

Functional characterization of proteins requires them to be expressed and purified in substantial amounts with high purity to perform biochemical assays. ...

affinity-purification-6x-his-tagged-protein-using-fast-protein-liquid

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

소설과 고효율 두 단계 친화도 크로마 토그래피 프로토콜이 개발되었고 자세하게 설명되어 있습니다. 방법은 두 개의 본질적 동질성과 작은 정화 태그를 기반으로하고 다른 특성을 가진 대상 단백질의 다양한 적용됩니다.

작은 Bispecific 선호도 태그에 의해 용이 직교 단백질 정제

탠덤 친화 정화 단백질 바인딩 파트너의 식별을위한 강력한 접근이다. 개념 증명으로서,이 방법론은 숙주 세포의 요인 번역 개시에 관여 공동 침전물에 잘 특성화 번역 개시 인자의 eIF4E에 적용되었다. 이 방법은 쉽게 다른 세포 또는 바이러스성 단백질에 적응하고 있습니다.

탠덤 동질 정제를 사용하여 단백질 나누기 파트너의 식별

우리는 액체 처리 로봇을 사용하여 재조합 단백질의 친 화성 태그 정화하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 일반적으로 높은 처리량 형식에 용해 그의 태그 단백질의 작은 규모의 정화에 적용됩니다.

선호도 태그 재조합 단백질의 높은 처리량 정화

출처: Becker, B. 외 효모에서 리신 독소 A 사슬(RTA) 수송에 필요한 세포 구성 요소를 규명하기 위한 간단한 형광 기반 리포터 검사법. J. Vis. 경험 (2017).이 영상은 니켈 기반 친화성 크로마토그래피를 이용해 폴리히스티딘 표지된 재조합 단백질을 정제하는 과정을 보여줍니다. 이 연구는 초음파 검사를 통한 박테리아 용해, 용해액의 정화 및 여과, 그리고 이미다졸을 이용한 표적 단백질의 선택적 결합 및 용출 등 주요 단계를 설명합니다.

 재조합 박테리아 단백질 정제를 위한 친화 크로마토그래피 기법

이 비디오에서는 클로스트리듐 디피실리 박테리아에서 히스티딘 태그가 지정된 피로포스포키나제 효소를 정제하는 니켈 친화성 크로마토그래피 기술을 보여줍니다.

니켈 친화성 크로마토그래피 기반 단백질 정제: 박테리아 세포 용해물에서 폴리히스티딘 표지 재조합 단백질을 정제하는 기술

이 비디오는 친화성 액체 크로마토그래피를 사용하여 히스티딘 태그가 지정된 자체 조립 단백질 나노 입자 또는 SAPN의 정제를 보여줍니다. 그 결과 정제된 SAPN 분획은 백신 개발에 적합하며 잠재적인 면역 치료 응용 분야에 대한 가능성을 가지고 있습니다.

Affinity Chromatography를 사용한 자체 조립 단백질 나노 입자의 정제

본 프로토콜에서는, 고유 분해 가능한 GST-태그 및 그의 작은 태그를 조합하여 재조합 단백질의 정제를 허용하는 매우 효율적이고 비용 효과적인 소량의 단백질 정제 방법을 보여준다.

GST - 그의 정화 : 전체 길이 정제 된 단백질을 항복 2 단계 친화력 정화 프로토콜

여기에서는, 극저온 온도에서 고체 밀링에 의해 포유류 세포를 파괴 얻어진 세포 분말로부터 세포 추출물을 제조하고, 항체의 결합 마이크론 스케일 상자성 비드에 친 화성 포획하여 관심 단백질 복합체를 분리하는 프로토콜을 기술한다.

Cryomilled 포유 동물 세포에서 단백질 단지 선호도 캡처

여기에서 우리는 라벨 무료 양적 질량 분석을 사용하여 단백질 상관 프로파일 다음에 친 화성이 단백질 복합체의 정화 및 파란색 기본 페이지에서 자신의 분리를위한 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 서로 다른 단백질 복합체에 상호 작용 체를 해결하는 데 유용합니다.

블루 기본 페이지와 단백질 상관 관계 프로파일 링에 의한 선호도 정제 단백질 복합체 해결

프로시저 refolding dCACHE periplasmic ligand 바인딩 도메인 포함 시체와 단백질의 밀리 그램 수량을 정화에서 Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3의의 대 한 제공 됩니다.

효율적인 Refolding 및 Chemoreceptor Ligand 바인딩 도메인의 정화 방법

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Fast Protein 액체 크로마토그래피 시스템을 사용한 6X-His-Tagged 단백질의 친화성 정제

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