Name: 글라이칸-단백질 상호 작용 해체: 핵 자기 공명(NMR)을 위한 구조 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-17T14:25:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: 학습하세요 NMR을 활용한 글라이칸-단백질 상호작용 해체 방법으로, 포화 전달 차이 및 화학적 이동 섭동 분석을 통해 결합 부위를 식별하고 분자 인식 메커니즘을 규명하는 구조 당생물학 프로토콜입니다.

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MCIN/AEI/10.13039/501100011033가 후원하는 Severo Ochoa Center of Excellence Accreditation CEX2021-001136-S와 Instituto de Salud Carlos III(ISCIII, Madrid, Spain)의 이니셔티브인 CIBERES에 대해 스페인의 Agencia Estatal de Investigación에 감사드립니다. 우리는 또한 GLYCOTWINNING 프로젝트를 위해 유럽연합 집행위원회(European Commission)에 감사를 표합니다.

글라이칸-단백질 상호 작용 분석을 위한 고급 NMR 기술

<ol><li>Solís, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+into+glycosciences%3A+How+chemistry%2C+biochemistry+and+biology+cooperate+to+crack+the+sugar+code%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">A guide into glycosciences: How chemistry, biochemistry and biology cooperate to crack the sugar code.</a> Biochim Biophys Acta. 1850 (1), 186-235 (2015).</li>
<li>Poveda, A., Jimenez-Barbero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR+studies+of+carbohydrate-protein+interactions+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">NMR studies of carbohydrate-protein interactions in solution.</a> Chem Soc Rev. 27, 133-144 (1998).</li>
<li>Kogelberg, H., Solís, D., Jiménez-Barbero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+structural+insights+into+carbohydrate-protein+interactions+from+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">New structural insights into carbohydrate-protein interactions from NMR spectroscopy.</a> Curr Opin Struct Biol. 13 (5), 646-653 (2003).</li>
<li>Widmalm, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycan+shape%2C+motions%2C+and+interactions+explored+by+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22JACS+Au%22%5BJournal%5D)">Glycan shape, motions, and interactions explored by NMR spectroscopy.</a> JACS Au. 4 (1), 20-39 (2024).</li>
<li>Marchetti, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((34%3BRules+of+Engagement%26%2334%3B+of+protein-glycoconjugate+interactions%3A+A+molecular+view+achievable+by+using+NMR+spectroscopy+and+molecular+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22ChemistryOpen%22%5BJournal%5D)">34;Rules of Engagement&#34; of protein-glycoconjugate interactions: A molecular view achievable by using NMR spectroscopy and molecular modeling.</a> ChemistryOpen. 5 (4), 274-296 (2016).</li>
<li>Ardá, A., Jiménez-Barbero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+recognition+of+glycans+by+protein+receptors.+Insights+from+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Commun%22%5BJournal%5D)">The recognition of glycans by protein receptors. Insights from NMR spectroscopy.</a> Chem Commun. 54 (38), 4761-4769 (2018).</li>
<li>Gimeno, A., Valverde, P., Ardá, A., Jiménez-Barbero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycan+structures+and+their+interactions+with+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22A+NMR+view.+Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Glycan structures and their interactions with proteins.</a> A NMR view. Curr Opin Struct Biol. 62, 22-30 (2020).</li>
<li>Cañada, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+and+structural+characterization+of+carbohydrates+and+their+interactions+studied+by+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Conformational and structural characterization of carbohydrates and their interactions studied by NMR.</a> Curr Med Chem. 29 (7), 1147-1172 (2022).</li>
<li>Valverde, P., Quintana, J. I., Santos, J. I., Ardá, A., Jiménez-Barbero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+NMR+avenues+to+explore+the+conformation+and+interactions+of+glycans%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Omega%22%5BJournal%5D)">Novel NMR avenues to explore the conformation and interactions of glycans.</a> ACS Omega. 4, 13618-13630 (2019).</li>
<li>Jiménez-Barbero, J., Asensio, J. L., Cañada, F. J., Poveda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+and+protein-bound+carbohydrate+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Free and protein-bound carbohydrate structures.</a> Curr Opin Struct Biol. 9 (5), 549-555 (1999).</li>
<li>Quintana, J. I., Atxabal, U., Unione, L., Ardá, A., Jiménez-Barbero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+multivalent+carbohydrate-protein+interactions+by+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">Exploring multivalent carbohydrate-protein interactions by NMR.</a> Chem Soc Rev. 52 (5), 1591-1613 (2023).</li>
<li>Roldós, V., Cañada, F. J., Jiménez-Barbero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbohydrate-protein+interactions%3A+a+3D+view+by+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Carbohydrate-protein interactions: a 3D view by NMR.</a> Chembiochem. 12 (7), 990-1005 (2011).</li>
<li>Unione, L., Ardá, A., Jiménez-Barbero, J., Millet, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR+of+glycoproteins%3A+profiling%2C+structure%2C+conformation%2C+and+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">NMR of glycoproteins: profiling, structure, conformation, and interactions.</a> Curr Opin Struct Biol. 68, 9-17 (2021).</li>
<li>del Carmen Fernández-Alonso, M., Díaz, D., Berbis, M. A., Marcelo, F., Cañada, J., Jiménez-Barbero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-carbohydrate+interactions+studied+by+NMR%3A+from+molecular+recognition+to+drug+design%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protein+Pept+Sci%22%5BJournal%5D)">Protein-carbohydrate interactions studied by NMR: from molecular recognition to drug design.</a> Curr Protein Pept Sci. 13 (8), 816-830 (2012).</li>
<li>Angulo, J., Nieto, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STD-NMR%3A+application+to+transient+interactions+between+biomolecules-a+quantitative+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Biophys+J%22%5BJournal%5D)">STD-NMR: application to transient interactions between biomolecules-a quantitative approach.</a> Eur Biophys J. 40 (12), 1357-1369 (2012).</li>
<li>Mayer, M., Meyer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Group+epitope+mapping+by+saturation+transfer+difference+NMR+to+identify+segments+of+a+ligand+in+direct+contact+with+a+protein+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Group epitope mapping by saturation transfer difference NMR to identify segments of a ligand in direct contact with a protein receptor.</a> J Am Chem Soc. 123 (25), 6108-6117 (2001).</li>
<li>Williamson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+chemical+shift+perturbation+to+characterise+ligand+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Nucl+Magn+Reson+Spectrosc%22%5BJournal%5D)">Using chemical shift perturbation to characterise ligand binding.</a> Prog Nucl Magn Reson Spectrosc. 73, 1-16 (2013).</li>
<li>Fernández, C., Adeishvili, K., Wüthrich, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transverse+relaxation-optimized+NMR+spectroscopy+with+the+outer+membrane+protein+OmpX+in+dihexanoyl+phosphatidylcholine+micelles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transverse relaxation-optimized NMR spectroscopy with the outer membrane protein OmpX in dihexanoyl phosphatidylcholine micelles.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2358-2363 (2001).</li>
<li>Yee, A., Gutmanas, A., Arrowsmith, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solution+NMR+in+structural+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Solution NMR in structural genomics.</a> Curr Opin Struct Biol. 16 (5), 611-617 (2006).</li>
<li>Skinner, S. P., Fogh, R. H., Boucher, W., Ragan, T. J., Mureddu, L. G., Vuister, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCPNMR+AnalysisAssign%3A+a+flexible+platform+for+integrated+NMR+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+NMR%22%5BJournal%5D)">CCPNMR AnalysisAssign: a flexible platform for integrated NMR analysis.</a> J Biomol NMR. 66 (2), 111-124 (2016).</li>
<li>Gimeno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimizing+the+entropy+penalty+for+ligand+binding%3A+Lessons+from+the+molecular+recognition+of+the+histo+blood-group+antigens+by+human+Galectin-3%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Minimizing the entropy penalty for ligand binding: Lessons from the molecular recognition of the histo blood-group antigens by human Galectin-3.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 58 (22), 7268-7272 (2019).</li>
</ol>

저자는 밝힐 것이 없습니다.

포화 전달 차이 NMR(STD-NMR)은 리간드-단백질 상호 작용을 연구하기 위해 가장 많이 사용되는 다재다능한 NMR 방법이 되었습니다. 위에서 볼 수 있듯이 포화 전달 현상에 의존하며, 실험 설정에는 두 개의 1차원(1D) 1H스펙트럼, 즉 on-resonance¬ 및 ¬off-resonance 스펙트럼의 획득이 포함됩니다. 온 공명 실험 중에 단백질의 특정 양성자의 포화는 특정 기간(포화 시간 범위는 일반적으로 1-3초 범위) 동안 저전력 무선 주파수 펄스 트레인을 적용하여 달성됩니다. 리간드의 직접적인 포화를 피하기 위해, 포화 펄스의 주파수와 길이는 단백질의 특정 양성자를 선택적으로 조사하도록 최적화됩니다. 즉, 모든 리간드 신호의 빈 주파수에 적절한 길이로 적용되어야 합니다(그림 1). 일반적으로 50ms 포화 펄스의 경우 포화 영역에서 가장 가까운 리간드 신호까지 1ppm의 차이를 유지해야 합니다. 일반적으로, 단백질의 지방족 영역에 적용되는 선택적 포화 펄스는 증가된 포화 효과를 제공합니다. 대안적으로, 리간드 분자가 어떠한 방향족 신호도 포함하지 않는 경우 방향족 양성자(6-7 ppm)를 조사할 수 있다. 이것은 방향족 그룹을 가지고 있지 않기 때문에 자연적으로 발생하는 글라이칸에 매우 유용합니다. 단백질의 특정 영역에 선택적으로 조사되면 포화도는 쌍극자 1 H-1H 교차 이완(스핀 확산)을 통해 단백질을 따라 전파됩니다. 결국, 포화도는 결합 부위의 단백질 양성자에 도달하고, 이는 분자간 1 H-1H NOE를 통해 수용체와 밀접하게 접촉(r < 5 Å)되는 당 양성자로 전달됩니다. 분명히, 포화 리간드 양성자의 신호 강도는 감소합니다. 포화를 받은 후 결합 역학으로 인해 일시적으로 결합된 리간드(빠른 교환이 필요함)가 해리되고 포화 정보가 자유 상태로 축적됩니다. 이 과정으로 인해 NMR 온 공명 스펙트럼은 감소된 신호를 나타냅니다(그림 2).
결합 글라이칸의 1H핵의 이러한 강도 섭동을 명확하게 나타내기 위해, 포화가 동일한 조건에서 수용체 또는 탄수화물 신호(보통 40-100ppm 사이)에서 멀리 떨어진 곳에 적용되는 제어 양성자 NMR 스펙트럼(오프 공명)을 획득합니다. off-resonance와 on-resonance 사이의 빼진 1D 스펙트럼은 강도가 수정된 리간드의 1H핵의 신호, 즉 자화를 받을 수 있을 만큼 수용체 결합 부위에 충분히 가까운 신호를 독점적으로 보여줍니다(그림 2).
그럼에도 불구하고 결합 된 탄수화물의 모든 1H핵이 동일한 양의 포화도를받는 것은 아닙니다. 이론적으로, 수용체에서 결합된 리간드로의 자화 전달은 거리에 따라 달라집니다(1/r6). 이는 글리칸 1H핵 사이의 전이 포화 강도가 리간드의 양성자와 수용체의 양성자 사이의 공간적 근접성에 대한 정보를 포함하고 STD NMR 강도가 수용체에 더 가까운 양성자에 대해 더 크다는 것을 의미합니다. 따라서 STD NMR 실험은 단백질 표면에 더 가깝게 위치한 리간드의 양성자가 결합에 직접 참여하지 않는 것보다 더 높은 강도를 보여주기 때문에 탄수화물의 결합 에피토프를 결정할 수도 있습니다(그림 2 및 그림 3).
이 실험은 약한 친화도-중간 친화도를 가진 시스템에 적용할 수 있으며, 낮은 μM 또는 nM 범위에서 강한 친화도를 가진 시스템에는 드물게 적용할 수 있습니다. 실제로, 이완 시간 척도에서 해리 속도가 빨라야 합니다. 그렇지 않으면 리간드가 해리되기 전에 이완을 통해 포화 전달 정보가 손실됩니다.
반면에 단백질 기반 NMR 실험은 원자 분해능 구조를 해결하지 않고 아미노산 수준 정확도로 리간드-단백질 상호 작용을 밝히는 데 독특합니다. 공결정화(co-crystallization) 없이 용액 내 분자 인식 현상을 직접 검사합니다. CSP 분석 매핑은 리간드를 발견하고 단백질 결합 부위를 매핑하는 데 매우 강력합니다(그림 4 및 그림 5). 이 방법은 mM과 nM 범위 사이의 친화도의 모든 범위에 적용 가능하며, 화학적 이동 시간 척도(21)에서 환율이 느린 시스템의 경우에도 적용할 수 있다.
그럼에도 불구하고 이 접근법은 이완 문제로 인해 분자량이 30-40kDa 이상인 단백질에는 효과가 없을 것입니다. 그런 다음 TROSY 대안18 을 사용할 수 있으며, 단백질 중수소화와 결합할 때 특히 강력합니다. 또한, 단백질은 15N으로 균일하게 표지되어야 합니다(그리고 필요한 백본 할당을 완료할 수 있도록 13C 및 15N으로 이중 표지된 또 다른 샘플). 따라서, 해당 발현 시스템을 포함한 단백질 발현 조건은 밀리그램 양의 단백질을 얻을 수 있도록 최적화되어야 합니다. 올리고머화(oligomerize) 또는 응집(응집) 경향을 보이는 단백질도 이 분석에 적합하지 않습니다. NMR 데이터를 기록하기 위해 본 명세서에서 사용되는 기기는 TCI cryoprobe가 장착된 Bruker 800MHz 분광계이다. 이 방법론을 600MHz 미만의 기기를 사용하거나 극저온 프로브 없이 사용하는 것은 매우 어려울 수 있습니다.

글라이칸의 분자 인식은 건강 및 질병과 관련된 많은 과정에 필수적입니다. 글라이칸에 대한 생물학적 수용체(렉틴, 항체, 효소)의 특이성과 선택성은 엔탈피의 다양한 구성 요소(CH-π 및 van der Waals, 수소 결합, 정전기)와 엔트로피(소수성, 역학, 용매-탈용매화) 간의 불안정한 균형을 조정하는 데 크게 좌우됩니다1.
글라이칸의 큰 화학적 다양성과 동적 특성을 감안할 때, NMR 방법은 25년 이상 글라이칸 상호 작용을 해부하는 데 널리 사용되어 왔습니다2, 이러한 방법론은 다른 방법론을 사용하여 필요한 상호 작용 증거를 검색할 수 없는 경우에도 원자 분해능 3,4에서 정확한 세부 정보와 함께 분자 인식 이벤트에 대한 탁월한 정보를 제공하기 때문입니다. 요점으로, NMR은 다재다능하며 원자 수준에서, 다양한 시간 규모에서 동적 이벤트를 연구할 수 있게 해주어 용액 내 글라이칸의 구조, 형태 및 역학을 연구하기 위한 최고의 기술을 구성합니다. 그럼에도 불구하고, 이러한 정보를 분리하는 것은 신중한 데이터 분석과 함께 잘 정의된 전략을 필요로 하는 다소 복잡한 과정일 수 있다5.
NMR 기술은 다양하며 실제로 글리칸-단백질 상호 작용을 밝히기 위해 사용할 수 있는 많은 방법론이 있습니다6. 여기에서는 현재 글리칸-수용체 상호 작용을 해독하기 위해 사용되는 두 가지 기본 NMR 접근법을 설명하며7,8, 주요 글라이칸 에피토프와 단백질 결합 부위9의 제시를 푸는 방법에 중점을 둡니다.
임의의 분자 인식 이벤트에서, 수용체가 주어진 리간드에 결합할 때, 결합(10)에 있는 참가자의 많은 NMR 파라미터에 영향을 미치는 화학적 교환 과정이 있다. 따라서, NMR 관점에서, 상호 작용은 글라이칸 리간드의 관점에서 또는 단백질 수용체11의 관점에서 모니터링될 수 있다. 일반적으로 단백질 수용체는 큰 생체 분자(느린 회전 운동, ns 시간 척도의 속도, 따라서 빠른 횡방향 이완)인 반면, 상호 작용하는 글라이칸은 중소형 분자(빠른 회전 운동, ps 시간 척도의 속도 및 느린 횡방향 이완)로 간주될 수 있습니다12. 표준 관점에서 볼 때, 글리칸의 NMR 신호는 좁고 수용체의 NMR 신호는 넓습니다13.
리간드 기반 NMR 방법은 자유 상태에서 결합 상태로 전달할 때 많은 글라이칸 NMR 매개변수가 경험하는 극적인 변화에 의존합니다(14). STD-NMR은 용액 상태에서의 결합의 존재를 추론하는 것부터 글리칸 결합 에피토프의 결정에 이르기까지 다양한 글리칸 결합 특징(15)을 평가하기 위해 가장 많이 사용되는 실험적 NMR 기술이다. 즉, 단백질 수용체(16)와 접촉하는 리간드의 원자.
대안적으로, 수용체-기반 NMR 방법은 apo 상태(17)에 대해 기록된 것들에 대해 글라이칸의 존재 하에 단백질 수용체의 신호에서 발생하는 변화를 모니터링한다. 이들은 주로 두 상태 사이의 단백질 신호의 화학적 이동 섭동을 스크리닝하는 데 중점을 둡니다. 가장 일반적으로 사용되는 실험은 1 H-15N HSQC 또는 TROSY 대안18입니다.
두 접근 방식의 조합을 통해 광범위한 친화력을 나타내는 많은 다양한 시스템에 NMR을 적용할 수 있습니다. 그러나 수용체 기반 NMR 방법의 경우 리간드를 기반으로 하는 방법과 달리 상대적으로 많은 양의 용해성, 비응집성, 안정 동위원소 표지(15N) 단백질을 사용할 수 있어야 합니다.
여기에서는 두 가지 방법을 모두 설명하고 강점과 약점을 강조합니다. 프로토콜에 설명된 기본 단계는 Bruker 분광계 사용에 대한 예제로 사용됩니다. 결과적으로 명령 및 매개 변수 이름은 TopSpin(Bruker의 분광계 제어 소프트웨어)에서 사용되는 것과 일치합니다.

<table><tbody><tr><td>5mm Shigemi 마이크로튜브 세트 매트</td><td>CortecNet SAS</td><td>S30BMS-005B</td><td></td></tr><tr><td>알파-락토스-아가로스</td><td>시그마-알드리치 Qu&iacute; 운모 SL</td><td>7634-5ML</td><td></td></tr><tr><td>염화 암모늄 (15 N, 99 %)</td><td>LC-0179-N-50G</td><td>예광탄 Tecnolog&iacute; Anal&iacute로; ticas S.L</td><td></td></tr><tr><td>암피실린(나트륨 염)&nbsp;</td><td>Melford Laboratories LTD</td><td>A40040</td><td></td></tr><tr><td>BIOVIA 디스커버리 스튜디오&nbsp;</td><td>BIOVIA, 다쏘시스템&egrave; mes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BL21(DE3) 화학적으로 유능한 세포&nbsp;</td><td>머크 생명과학, S.L.U.</td><td>CMC0014-40X40UL</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td>Allegra X-22R</td><td></td></tr><tr><td>D2O&nbsp;</td><td>케임브리지 동위원소 연구소, Inc.</td><td>DLM-4-1000</td><td></td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>Eppendorf</td><td>Innova 42</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (Isopropyl &szlig;-D-1-thiogalactopyranoside)</td><td>VWR International Eurolab S.L.</td><td></td><td></td>VW437144N</tr><tr><td>LacNAc</td><td>Elicityl</td><td>GLY008</td><td></td></tr><tr><td>Luria Bertani (LB) Broth</td><td>Merck Life Science, S.L.U.</td><td>3397-1KG</td><td></td></tr><tr><td>마트라즈 에를렌마이어 B N 5000 CC&nbsp;</td><td>VWR 국제 Eurolab S.L.</td><td>214-1137</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Bio-Rad</td><td>1610780</td><td></td></tr><tr><td>PyMOL</td><td>PyMOL 분자 그래픽 시스템</td><td>버전 2.0 Schr&ouml; dinger</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>음향 & 재료, Inc.</td><td>VC 505</td><td></td></tr><tr><td>초전도 NMR 자석</td><td>Bruker</td><td>600MHz AVANCE III</td><td></td></tr><tr><td>초전도 NMR 자석</td><td>Bruker</td><td>800MHz AVANCE III</td><td></td></tr></tbody></table>

글라이칸-단백질 상호 작용 해체: 핵 자기 공명(nmr)을 위한 구조

Disentangling Glycan-Protein Interactions: Nuclear Magnetic Resonance (NMR) to the Rescue

글라이칸과 단백질의 상호 작용은 건강 및 질병과 관련된 많은 이벤트를 조절합니다. 사실, 이러한 인식 사건의 확립과 그 생물학적 결과는 두 파트너의 3차원 구조뿐만 아니라 그들의 역동적인 특징 및 해당 세포 구획에 대한 표현과 밀접한 관련이 있습니다. NMR 기술은 이러한 특성을 풀기 위해 고유하며, 실제로 다양한 NMR 기반 방법론이 개발되어 관련 수용체와 글리칸의 결합 이벤트를 모니터링하는 데 적용되었습니다. 이 프로토콜은 NMR-glycobiology 분야에서 사용되는 가장 강력한 NMR 방법론 중 두 가지인 1H-포화 전달 차이(STD) 및 1 H,15N-Heteronuclear 단일 양자 일관성(HSQC) 적정 실험을 획득, 처리 및 분석하는 절차를 간략하게 설명하며, 각각 글라이칸 및 단백질 관점에서 정보를 보완적으로 제공합니다. 실제로, 이 둘을 결합하면 분자 인식 프로세스의 구조적 측면과 동적 측면을 모두 설명할 수 있는 강력한 툴킷을 제공합니다. 이 포괄적인 접근 방식은 글라이칸-단백질 상호 작용에 대한 이해를 높이고 화학 당생물학 분야의 연구를 발전시키는 데 기여합니다.

여기에서는 렉틴과 작은 올리고당 간의 결합 상호 작용에 대한 세부 사항을 밝히기 위해 1H-STD NMR 및 1 H-15N HSQC 실험을 활용하기 위한 프로토콜을 제시합니다. hGalectin-7(hGal-7)에 의한 LacNAc의 분자 인식 분석에서 얻은 결과가 포함되어 있으며, 이는 프로토콜의 성공적인 구현과 분자 인식 프로세스의 세부 사항을 연구하기 위한 이러한 NMR 방법론의 효과에 대한 예시적인 예시 역할을 합니다. 그림 3은 LacNAc와 hGal-7의 상호 작용에 대한 1H-STD NMR 스펙트럼을 보여줍니다. STD NMR 신호의 존재는 결합을 나타냅니다(그림 3A). 더욱이, 단백질과 밀접하게 접촉하는 양성자에 속하는 신호만 나타나 결합 항원결정기(binding epitope)를 묘사할 수 있습니다(그림 3B). 그림 4는 단백질의 1 H-15N HSQC 스펙트럼을 지문으로 사용할 수 있는 방법을 보여주며, 그림 5는 LacNAc 결합 시 hGalectin-7 백본 아미드 그룹의 화학적 이동 섭동을 정의하기 위해 1 H-15N 이종핵 단일 양자 일관성(HSQC) 적정 실험을 적용하는 방법을 보여줍니다. 이러한 데이터는 상호 작용의 존재를 나타낼 뿐만 아니라 렉틴의 결합 인터페이스를 설명합니다. 그림 6은 적정 데이터 분석을 통해 높은 마이크로몰 범위에 속하는 hGalectin-7에 의한 LacNAc의 결합 친화도를 추정할 수 있는 방법을 보여줍니다. 이 결과는 대체 기술을 사용하여 얻은 결과와 일치합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66530/66530fig01.jpg"> 그림 1: 온 공진 주파수의 선택. pH 7.4에서 중수소화 인산염 완충 식염수에서 LacNAc:hGal-7 50:1 비율의 1H-NMR 스펙트럼이 표시됩니다. 리간드(LacNAc)의 신호는 2.0-5.2ppm 사이의 영역에 국한됩니다. 포화 주파수는 1-2ppm 범위 내에서 리간드 양성자가 없는지 확인하기 위해 신중하게 선택되어 단백질의 양성자를 선택적으로 조사할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66530/66530fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66530/66530fig02.jpg"> 그림 2: STD NMR 실험. STD 실험의 개략도: 첫 번째 스펙트럼(off-resonance)은 참조 역할을 하고 두 번째 스펙트럼(on-resonance)에서는 단백질 포화가 수행됩니다. 포화도는 전체 단백질에 걸쳐 효율적으로 전파되고 단백질과 밀접하게 접촉하는 리간드 양성자로 전달됩니다. 결과 차이 스펙트럼(STD 스펙트럼)은 포화를 경험한 공명만 생성합니다. STD 실험의 분석은 결합 설탕의 epitope 매핑을 허용합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66530/66530fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66530/66530fig03.jpg"> 그림 3: 리간드의 관점에서 본 결합 분석. (A) LacNAc와 hGal-7의 상호 작용에 대한 오프 공진 및 1H STD-NMR 스펙트럼의 중첩. STD 스펙트럼에서는 단백질과 밀접하게 접촉하는 양성자에 속하는 신호만 나타납니다. 리간드의 1H공명에 대한 주석은 오프 공명 스펙트럼에서 보고됩니다. (B) 상대적인 STD 강도는 LacNAc의 화학 구조에 컬러 매핑되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66530/66530fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66530/66530fig04.jpg"> 그림 4: 단백질의 1 H-15N HSQC 스펙트럼은 지문을 나타냅니다. (A) apo 형태로 100μM의 hGal-7의 1 H-15N HSQC 스펙트럼. 스펙트럼은 25°C에서 기록되었습니다. 일부 NH cross-peaks는 해당 아미노산의 라벨로 주석을 달았습니다. (B) 각 NH 쌍은 화학적 환경과 결과적으로 단백질의 3D 구조에 따라 달라지는 고유한 화학적 변화를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66530/66530fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66530/66530fig05.jpg"> 그림 5: 단백질의 관점에서 본 결합 분석. (A) LacNAc를 hGal-7 용액에 적정하기 위해 기록된 1 H-15N HSQC 스펙트럼의 중첩이 표시됩니다. 여러 교차 피크가 화학적 이동 변화를 경험하는 스펙트럼을 검사하면 상호 작용이 명확하게 나타납니다. (B) hGal-7을 사용한 LacNAc(15개 등가물)의 적정에서 추론된 백본 아미드 신호의 최대 화학적 이동 섭동(maxCSP)의 플롯. (C) CSP 분석에 따르면 hGal-7의 가장 교란된 아미노산은 5gal PDB 구조에 매핑됩니다. 3D 모델에서 빨간색은 2σ 이상의 CSP 값을 나타내고 분홍색은 1σ에서 2σ 사이의 값을 나타냅니다. 색상이 지정된 영역은 결합 부위를 나타낼 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66530/66530fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66530/66530fig06.jpg"> 그림 6: 1 H-15N HSQC 적정 실험을 기반으로 한 KD 측정. (A) 연구 시스템의 NMR 시간 척도에서 화학적 교환율에 따른 1 H-15N HSQC 기반 적정의 패턴 표현(빠름, 중간 또는 느림). LacNAc/hGal-7 상호작용의 경우 빠른 교환 체제가 관찰되었습니다. (B) hGal-7 및 LacNAc 이당류의 모델 시스템에 대한 다양한 리간드 농도에서 CSP 분석에서 얻은 피팅 곡선및 KD 추정. 추정된 KD는 20개의 서로 다른 아미노산에 대한 데이터의 평균으로서 해당 오차와 함께 보고됩니다. (C) 적정 중 선택된 교차 피크의 이동을 표시하는 1 H,15N-HSQC 스펙트럼의 스니펫. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66530/66530fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

여기에서는 용액에서 단백질-글라이칸 상호 작용을 특성화하는 것을 목표로 하는 일련의 NMR 실험의 획득, 처리 및 분석을 자세히 설명하는 프로토콜을 제시합니다. 가장 일반적인 리간드 기반 및 단백질 기반 방법론이 요약되어 있으며, 이는 의심할 여지 없이 구조 당생물학 및 분자 인식 연구 분야에 기여합니다.

글라이칸-단백질 상호 작용 해체: 핵 자기 공명(NMR)을 위한 구조

The interactions of glycans with proteins modulate many events related to health and disease. In fact, the establishment of these recognition events and ...

당사의 연구는 다양한 글리칸 렉틴 시스템에 대한 연구를 탐구하여 건강 및 질병과의 연관성을 탐구합니다. 우리는 화학, 생물학 및 생물 의학의 방법론을 병합하여 암에서 박테리아 및 바이러스 감염에 이르기까지 병리학자에 대한 면역 반응의 역할을 심층적으로 조사했습니다. 최근 글리코 과학은 구조 분자 인식 측면의 글라이칸 설계, 합성 및 분석을 원자 수준에서 세포 수준으로 변화시킴으로써 획기적인 이정표를 세웠습니다.이러한 발전은 총체적으로 형광 또는 고급 글리칸 기반 치료법을 위한 무대를 마련했습니다. 이 프로토콜은 글라이칸 분야에서 사용되는 가장 강력한 NMR 방법론 중 두 가지를 획득, 처리 및 분석하는 절차를 간략하게 설명합니다. 이러한 방법론, 포화 전달 차이 및 화학적 안전 섭동 분석은 지의류 분자 인식의 구조적 및 동적 측면에 대한 정확한 정보를 제공합니다.

disentangling-glycan-protein-interactions-nuclear-magnetic-resonance

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연구

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화학

이 비디오는 15개의 N-표지된 야생형 및 돌연변이 엔보플라킨 단백질과 표지되지 않은 비멘틴 단백질 사이의 단백질-단백질 상호 작용을 연구하기 위한 핵 자기 공명 분광법 기술에 대해 설명합니다. 야생형 엔보플라킨과 비멘틴 사이의 성공적인 상호 작용은 NMR 스펙트럼에서 광범위한 라인 확장과 피크 소멸로 이어지는 반면, 돌연변이된 엔보플라킨과 비멘틴 사이의 상호 작용이 없으면 NMR 스펙트럼에서 잘 분리된 피크를 초래합니다.

원자 수준의 단백질-단백질 상호 작용을 연구하기 위한 핵 자기 공명

원자 해상도 supramolecular 단백질 어셈블리의 구조 생물학 현상의 다양 한에서 그들의 중요 한 역할 때문에 높은 관련성의 이다. 여기, 우리는 매직-각도 회전 하는 고체 핵 자기 공명 분광학 (매스 SSNMR)에 의해 불용 성 및 비 결정 고분자 단백질 어셈블리에 고해상도 구조 연구를 수행 하는 프로토콜을 제시.

고체 핵 자기 공명 분광학에 의해 고분자 어셈블리의 원자 규모 구조 연구

여기, 안정 동위 원소와 핵 자기 공명 (NMR) 분광학 및 눈금을 사용 하 여 단백질 단백질 상호 작용의 후속 묘사는 생산 및 분류는 단백질의 정화에 대 한 프로토콜 선물이 Thermophoresis (MST) 실험입니다.

핵 자기 공명 분광학 (NMR)와 미 Thermophoresis (MST) 구형 및 Filamentous 단백질의 상호 작용을 측정

이 NMR 기반 프로토콜은 시아노비린-N 및 D-만노스를 사용하여 약한 단백질-글리칸 상호작용을 조사합니다. 리간드 및 단백질 검출 방법을 결합하여 결합 부위를 매핑하고, 알로스테릭 효과를 감지하고, 만남 복합체를 식별합니다. 이 접근 방식은 샘플 준비 및 데이터 분석을 간략하게 설명하며 글리칸 특정 진단 및 인식 메커니즘에 유용한 구조적, 동적 통찰력을 제공합니다.

단백질-글리칸 상호작용 탐구: 핵 자기 공명의 발전

Cu(I)를 갖는 메탈로샤페론 모델 펩타이드의 NMR 용액 구조를 결정하고, 시료 준비, 1D 및 2D 데이터 수집에서 3차원 구조에 이르는 상세한 프로토콜을 설명합니다.

1D 및 2D 1HNMR을 사용한 펩타이드-금속 복합체의 구조 및 배위 측정

환원적으로 13C- 메틸화 된 N- 말단 라이신의 α- 및 ε- 디메틸 아민 핵 자기 공명 신호를 할당하는 두 가지 방법이 설명됩니다. 한 가지 방법은 환원성 메틸화 반응의 pH 유도 선택성을 활용하고, 다른 방법은 아미노펩티다아제를 사용하여 N 말단 라이신을 선택적으로 제거합니다.

의 NMR 공명 확인하는 방법<sup&gt; 13</sup환원 메틸을 단백질에&gt; C-디메틸 N-말단 아민

용해 동적 핵 분극(DNP)이 제공하는 감도 향상으로 NMR 및 MRI에 의해 실시간으로 대사 과정을 수행할 수 있습니다. 효소 반응 연구를 위해 설계된 전용 용출 DNP 설정의 특성과 성능에 대해 설명합니다.

NMR에 의해 실시간 효소 반응 속도 측정을위한 해산 동적 핵 편광 계측

이 프로토콜은 효소(엔톡실라나아제) 가수분해 전에 RE에 2개의 아미노벤즈아미드를 태그한 다음 질량 분석법(MS) 및 핵 자기 공명(NMR)을 사용하여 결과 올리고당을 분석함으로써 헤테록실란의 말단(RE) 및 내부 영역 글리코실 서열의 구조적 특성화에 사용되는 특정 기술을 설명합니다.

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새로운 사용자가 이 새로운 방법을 적용하여 화학적 교환을 겪고 있는 자체 시스템의 운동 매개변수를 얻을 수 있도록 SSTD NMR 방법을 설명하는 자세한 프로토콜이 여기에 제시되어 있습니다.

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글라이칸-단백질 상호 작용 해체: 핵 자기 공명(NMR)을 위한 구조

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