Name: Zebrafish 배아에서 Microglia Dynamics의 실시간 이미징 및 특성 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-17T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: 배우세요 Danio rerio 배아에서 공초점 현미경을 이용한 미세아교세포 실시간 이미징 및 역학 분석 방법을. 이 프로토콜은 뇌 발달 과정에서 미세아교세포의 형태와 이동 특성을 연구하는 데 활용됩니다.

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<meta charset="utf8"></head><body>제브라피시 시신경 발달에서 미세아교세포의 거동 규명

<ol><li>Wolf, S. A., Boddeke, H. W., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+physiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Microglia in physiology and disease.</a> Annu Rev Physiol. 79, 619-643 (2017).</li>
<li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+microglial+cells+are+highly+dynamic+surveillants+of+brain+parenchyma+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo.</a> Sci Rep. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li>
<li>Peri, F., Nusslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+neuronal+degradation+by+microglia+reveals+a+role+for+v0-ATPase+a1+in+phagosomal+fusion+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Live imaging of neuronal degradation by microglia reveals a role for v0-ATPase a1 in phagosomal fusion in vivo.</a> Cell. 133 (5), 916-927 (2008).</li>
<li>Marın-Teva, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+promote+the+death+of+developing+Purkinje+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Microglia promote the death of developing Purkinje cells.</a> Neuron. 41 (4), 535-547 (2004).</li>
<li>Paolicelli, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+pruning+by+microglia+is+necessary+for+normal+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development.</a> Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).</li>
<li>Hattori, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microglia-blood+vessel+interactions+in+the+developing+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">The microglia-blood vessel interactions in the developing brain.</a> Neurosci Res. 187, 58-66 (2023).</li>
<li>Colonna, M., Butovsky, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+function+in+the+central+nervous+system+during+health+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration.</a> Annu Rev Immunol. 35, 441-468 (2017).</li>
<li>Xu, H. -T., Pan, F., Yang, G., Gan, W. -B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choice+of+cranial+window+type+for+in+vivo+imaging+affects+dendritic+spine+turnover+in+the+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex.</a> Nat Neurosci. 10 (5), 549-551 (2007).</li>
<li>Shin, J., Park, H. -C., Topczewska, J. M., Mawdsley, D. J., Appel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+cell+fate+analysis+in+zebrafish+using+olig2+BAC+transgenics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Neural cell fate analysis in zebrafish using olig2 BAC transgenics.</a> Methods Cell Sci. 25 (1), 7-14 (2003).</li>
<li>Chi, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxn4+directly+regulates+tbx2b+expression+and+atrioventricular+canal+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Foxn4 directly regulates tbx2b expression and atrioventricular canal formation.</a> Genes Dev. 22 (6), 734-739 (2008).</li>
<li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+%28Danio+rerio%29+laboratory%3A+An+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction.</a> J Vis Exp. (69), e4196(2012).</li>
<li>Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenothiourea+sensitizes+zebrafish+cranial+neural+crest+and+extraocular+muscle+development+to+changes+in+retinoic+acid+and+IGF+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling.</a> PLoS ONE. 6 (8), e22991(2011).</li>
<li>Ariga, J., Walker, S. L., Mumm, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+time-lapse+imaging+of+transgenic+zebrafish%3A+visualizing+retinal+stem+cells+activated+by+targeted+neuronal+cell+ablation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Multicolor time-lapse imaging of transgenic zebrafish: visualizing retinal stem cells activated by targeted neuronal cell ablation.</a> J Vis Exp. (43), e2093(2010).</li>
<li>Ferrero, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+microglia+derive+from+primitive+macrophages+and+are+replaced+by+cmyb-dependent+definitive+microglia+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Embryonic microglia derive from primitive macrophages and are replaced by cmyb-dependent definitive microglia in zebrafish.</a> Cell Rep. 24 (1), 130-141 (2018).</li>
<li>Xu, J., Wang, T., Wu, Y., Jin, W., Wen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+colonization+of+developing+zebrafish+midbrain+is+promoted+by+apoptotic+neuron+and+lysophosphatidylcholine%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Microglia colonization of developing zebrafish midbrain is promoted by apoptotic neuron and lysophosphatidylcholine.</a> Dev Cell. 38 (2), 214-222 (2016).</li>
<li>Svahn, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+ramified+microglia+from+early+macrophages+in+the+zebrafish+optic+tectum%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Development of ramified microglia from early macrophages in the zebrafish optic tectum.</a> Dev Neurobiol. 73 (1), 60-71 (2013).</li>
<li>Thion, M. S., Garel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+ontogeny%2C+diversity+and+neurodevelopmental+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Microglial ontogeny, diversity and neurodevelopmental functions.</a> Curr Opin Genet Dev. 65, 186-194 (2020).</li>
<li>Bohlen, C. J., Friedman, B. A., Dejanovic, B., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+brain+development%2C+homeostasis%2C+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Microglia in brain development, homeostasis, and neurodegeneration.</a> Annu Rev Genet. 53, 263-288 (2019).</li>
<li>Squarzoni, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+modulate+wiring+of+the+embryonic+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Microglia modulate wiring of the embryonic forebrain.</a> Cell Rep. 8 (5), 1271-1279 (2014).</li>
<li>Schafer, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+sculpt+postnatal+neural+circuits+in+an+activity+and+complement-dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent.</a> Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).</li>
<li>Parkhurst, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+promote+learning-dependent+synapse+formation+through+brain-derived+neurotrophic+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Microglia promote learning-dependent synapse formation through brain-derived neurotrophic factor.</a> Cell. 155 (7), 1596-1609 (2013).</li>
<li>Green, L. A., O'Dea, M. R., Hoover, C. A., DeSantis, D. F., Smith, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+embryonic+zebrafish+brain+is+seeded+by+a+lymphatic-dependent+population+of+mrc1%2B+microglia+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The embryonic zebrafish brain is seeded by a lymphatic-dependent population of mrc1+ microglia precursors.</a> Nat. Neurosci. 25 (7), 849-864 (2022).</li>
<li>Hughes, A. N., Appel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+phagocytose+myelin+sheaths+to+modify+developmental+myelination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglia phagocytose myelin sheaths to modify developmental myelination.</a> Nat Neurosci. 23 (9), 1055-1066 (2020).</li>
<li>Yu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C1q+is+essential+for+myelination+in+the+central+nervous+system+%28CNS%29%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">C1q is essential for myelination in the central nervous system (CNS).</a> iScience. 26 (12), 108518(2023).</li>
<li>Zengeler, K. E., Lukens, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immunity+at+the+crossroads+of+healthy+brain+maturation+and+neurodevelopmental+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Innate immunity at the crossroads of healthy brain maturation and neurodevelopmental disorders.</a> Nat Rev Immunol. 21 (7), 454-468 (2021).</li>
<li>Paolicelli, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+states+and+nomenclature%3A+A+field+at+its+crossroads%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Microglia states and nomenclature: A field at its crossroads.</a> Neuron. 110 (21), 3458-3483 (2022).</li>
<li>Réu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lifespan+and+turnover+of+microglia+in+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">The lifespan and turnover of microglia in the human brain.</a> Cell Rep. 20 (4), 779-784 (2017).</li>
<li>Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., Tetzlaff, W., Rossi, F. M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+self-renewal+can+sustain+CNS+microglia+maintenance+and+function+throughout+adult+life%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Local self-renewal can sustain CNS microglia maintenance and function throughout adult life.</a> Nat Neurosci. 10 (12), 1538-1543 (2007).</li>
<li>Mildner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+the+adult+brain+arise+from+Ly-6ChiCCR2%2B+monocytes+only+under+defined+host+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglia in the adult brain arise from Ly-6ChiCCR2+ monocytes only under defined host conditions.</a> Nat Neurosci. 10 (12), 1544-1553 (2007).</li>
<li>Cook, Z. T., Brockway, N. L., Weissman, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+developing+brain+in+living+zebrafish+using+Brainbow+and+time-lapse+confocal+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualizing the developing brain in living zebrafish using Brainbow and time-lapse confocal imaging.</a> J Vis Exp. (157), e60593(2020).</li>
<li>Tayanloo-Beik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+modeling+of+autism+spectrum+disorders%2C+current+status+and+future+prospective%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Zebrafish modeling of autism spectrum disorders, current status and future prospective.</a> Front Psychiatry. 13, 911770(2022).</li>
<li>D'Amora, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+an+innovative+tool+for+epilepsy+modeling%3A+State+of+the+art+and+potential+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as an innovative tool for epilepsy modeling: State of the art and potential future directions.</a> Int J Mol Sci. 24 (9), 7702(2023).</li>
<li>Langova, V., Vales, K., Horacek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+zebrafish+and+laboratory+rodents+in+schizophrenia+research%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">The role of zebrafish and laboratory rodents in schizophrenia research.</a> Front Psychiatry. 11, 549232(2020).</li>
<li>Chia, K., Klingseisen, A., Sieger, D., Priller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+model+organism+for+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a model organism for neurodegenerative disease.</a> Front Mol Neurosci. 15, 940484(2022).</li>
<li>Astell, K. R., Sieger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+in+vivo+models+of+cancer+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22%5BJournal%5D)">Zebrafish in vivo models of cancer and metastasis.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 10 (8), 037077(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1 L 번식 탱크</td><td>Tecniplast</td><td>ZB10BTE</td><td></td></tr><tr><td>1-phenyl-2-thiourea (PTU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td>배아 색소 침착을 방지하기 위해 E3에서 0.2 mM로 희석</td></tr><tr><td>바닥 유리 이미징 접시</td><td>FluoroDish</td><td>FD3510-100</td><td></td></tr><tr><td>일회용 눈금 이동 피펫</td><td>avantor</td><td>16001-188</td><td></td></tr><tr><td>드라이 블록 히터</td><td>Novolab</td><td>그랜트 QBD4</td><td>37 &deg에서 낮은 용융 아가로스를 유지하기 위해; C</td></tr><tr><td>에틸 3-아미노벤조에이트 메탄설포네이트(트리카인)</td><td>시그마-알드리치</td><td>E10521-50G</td><td></td></tr><tr><td>Imaris 10.0</td><td>옥스포드 기기</td><td></td><td>분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>Imaris 파일 컨버터</td><td>옥스포드 기기</td><td></td><td>https://imaris.oxinst.com/big-data</td></tr><tr><td>레이저 스캐닝 컨포칼 현미경</td><td>니콘</td><td>이클립스 Ti2-E</td><td></td></tr><tr><td>메틸렌 블루</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140-25G</td><td></td></tr><tr><td>마이크로로더 팁</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>NuSieve GTG Agarose</td><td>Lonza</td><td>&nbsp; 50081</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시 (90mm)</td><td>avantor</td><td>391-0559</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11459643001</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 스테인레스 스틸 집게 Dumont No. 5</td><td>FineScienceTools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>실체 현미경</td><td>Leica</td><td>Leica M80</td><td>배아</td></tr><tr><td>놀리는 바늘</td><td>avantor</td><td>76549-024</td><td></td></tr>를 장착하려면</tbody></table>

zebrafish 배아에서 microglia dynamics의 실시간 이미징 및 특성 분석

Live Imaging and Characterization of Microglia Dynamics in the Zebrafish Embryo

녹색 형광 단백질(eGFP)을 발현하는 미세아교세포와 Tg에서 DsRed를 발현하는 내피세포(mpeg1:eGFPgl22; KDRL: CRES898; actb2:loxP-STOP-loxP-DsRedexpress,sd5) 삼중 형질전환 배아(14 )를 설명된 프로토콜에 따라 3 dpf에서 이미징하였다. 단일 제브라피시 배아를 바닥 유리판에 1% 저용융 아가로스에 장착했으며 이미징 과정은 획득 시간 동안 배아의 성장을 방해하지 않았습니다. 타임랩스는 10x 0.45 NA 건식 대물 렌즈가 장착된 상용 포인트 스캐닝 컨포칼 현미경 시스템을 사용하여 기록되었으며, 488nm 및 561nm 여기 레이저는 각각 미세아교세포와 내피세포를 이미징하는 데 사용되었습니다. 또한, 시간 간격, 이미지 해상도, 픽셀 크기 및 z 단계는 각각 30초(s), 1024x1024, 0.49μm 및 2.5μm였습니다. 타임랩스 녹화는 3.5시간(h) 동안 지속되었습니다.
획득된 시야는 배아의 머리 전체를 포함했지만, 발달 첫 주 동안 미세아교세포는 주로 등쪽 중뇌의 이 영역의 뉴런 소마층으로 제한되어 조사관이 전체 인구를 동시에 시각화할 수 있기 때문에 분석은 특히 시신경에 초점을 맞췄습니다15. 3D 추적 분석은 위에서 설명한 대로 Imaris 10.0을 사용하여 수행되었습니다. 그림 4에서 볼 수 있듯이 추적이 성공적이었으며, 그 결과 3dpf16에서 시신경에 존재하는 미세아교세포의 예상 수와 일치하는 25개의 추적이 생성되었습니다. 최소한의 수동 트랙 수정이 필요했습니다. 그림 5 는 성공적인 추적 실험에서 추출할 수 있는 데이터의 예를 보여줍니다. 대식세포와 내피세포의 동시 표지를 통해 미세아교세포에 대한 미세아교세포의 상대적 위치를 정량화할 수 있으며, 이를 통해 연구자들은 가장 가까운 내피세포까지의 각 세포의 상대적 거리를 시각화하고 잠재적인 상호 작용의 빈도와 수를 조사할 수 있습니다(그림 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66533/66533fig01.jpg"> 그림 1: 실험 절차의 개요. (A) 제브라피시 배아 준비 및 마취. (B) 샘플 장착 및 위치 지정. (C) 이미지 획득. (D) 이미지 처리 및 운동성 데이터 추출. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66533/66533fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66533/66533fig02.jpg"> 그림 2: 제브라피시 배아의 미세아교세포 이미징 및 뇌 세포 환경과의 상호 작용. (A) 3 dpf 배아 제브라피시 머리와 뇌의 명시야 이미지(등쪽 보기), 시신경 및 뒷뇌 라벨링. 배아 제브라피시의 뇌는 작은 크기와 광학적 투명성으로 인해 이 단계에서 전체를 이미지화할 수 있습니다. (B-D) 미세아교세포의 위치와 거동은 (B,C) Tg(mpeg1:eGFP)gl22 및 (D) Tg(mpeg1:mcherry)gl23과 같은 형질전환 라인을 사용하고 OT에 초점을 맞춰 시각화할 수 있습니다. (B) 리포터 라인 Tg(XlTubb:D sRed)zf148 을 사용하여 뉴런과 그 세포체를 식별할 수 있으며, 미세아교세포-뉴런 상호 작용은 두 전이유전자를 함께 발현하는 라인으로 두 채널을 병합하여 시각화할 수 있습니다. 녹색(미세아교세포)과 빨간색(뉴런, 자홍색) 신호의 병합이 보입니다. (씨,디) 리포터 라인은 또한 내피 세포와의 미세아교세포(녹색) 상호 작용을 밝힐 수 있으며, 여기서는 (C) 이중 Tg(kdrl:cres898; actb2:LOXP-STOP-LOXP-Dsredexpress, SD5) 형질전환, 또는 희소돌기아교세포와 같은 신경교세포와 그 전구체를 이용하여 (D) 이중 Tg(olig2:EGFP; MPEG1:mCHERRY) 형질전환 라인. 1: OT의 희소돌기아교세포 및 전구세포, 2: 소뇌의 eurydendroid 뉴런. 스케일 바 = 50 μm. 약어: dpf = 수정 후 일수; OT = 시신경 tectum; HB = 후뇌. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66533/66533fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66533/66533fig03.jpg"> 그림 3: 3 dpf 제브라피시 배아에서 피부 대식세포와 미세아교세포의 형태학적, 공간적 차이. (A,B) Tg(mpeg1:eGFP)gl22 제브라피시 배아의 3 dpf에서의 등쪽 모습, (A) 실질 미세아교세포(자홍색 별표로 표시) 대 피부 대식세포(흰색 별표)를 묘사한 모습으로, (B)에서 볼 수 있듯이 z축을 따라 상대적인 위치를 기준으로 식별되었습니다.)은 z축 색상 코딩으로 렌더링된 단색 3D 이미지를 보여줍니다. (씨,디) (C) A 및 (D) B의 측면도, 배아의 머리 내 mpeg1:eGFP+ 세포의 z-깊이를 보여주고 미세아교세포와 비교하여 피부 대식세포의 표면 국소화를 강조합니다. (E-K) A 와 B에 별표로 표시된 각 세포의 고배율로 (E-G) 아메바이드 미세아교세포와 (H-K) 길쭉한 피부 대식세포 사이의 뚜렷한 형태에 대한 자세한 시각화를 제공합니다. 눈금 막대 = 30 μm. 약어: dpf = 수정 후 일수. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66533/66533fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66533/66533fig04.jpg"> 그림 4: 3 dpf 제브라피시 배아의 미세아교세포 추적. (A) 3 dpf Tg의 머리 등쪽 모습(kdrl:cres898; actb2 : LOXP - 정지 - LOXP - Dsred익스프레스, SD5; MPEG1:eGFPgl22) 미세아교세포(녹색) 및 혈관의 표면 렌더링(자홍색)을 보여주는 삼중 형질전환 배아. (B-D) (B) 3.5시간 동안 미세아교세포의 대표적인 움직임 추적. 개별 세포는 복잡한 궤적을 따르는 것으로 보입니다. (C) 점선 사각형으로 둘러싸인 B 영역의 확대 보기를 보여주는 타임랩스의 세부 정보. 영화의 6개 프레임(45분 간격)이 제시되어 미세아교세포가 미세환경에서 내피세포와 일시적인 접촉을 설정하는 것을 문서화합니다. (D) 시신경 구조 내 개별 소교세포 이동의 궤적으로, X, Y, Z축은 공간 차원을 나타냅니다. 눈금 막대 = 50 μm. 약어: dpf = 수정 후 일수. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66533/66533fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66533/66533fig05.jpg"> 그림 5: 얻은 데이터의 시각화. 설명된 프로토콜을 사용하여 얻을 수 있는 공간 데이터의 예입니다. 그래프는 (A) 미세아교세포의 평균 속도, (B) 1시간 동안 커버하는 평균 거리, (C) 평균 제곱 변위, (D) 서로 다른 시간에서의 공간 분포를 나타냅니다. 또한 용기의 표면 렌더링을 통해 주어진 시간에 미세아교세포와 내피세포 사이의 최단 거리를 (E) 단일 세포 수준과 (F) 전체 평균으로 측정할 수 있었습니다. A, B 및 D의 경우 각 점은 개별 셀을 나타냅니다. N = 하나의 배아. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66533/66533fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
추가 파일 1: <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66533/66533_20240306_SupplementalFile1%20(2).zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Zebrafish 배아에서 Microglia Dynamics의 실시간 이미징 및 특성 분석

Microglia are highly dynamic cells and their migration and colonization of the brain parenchyma is a crucial step for proper brain development and ...

live-imaging-characterization-microglia-dynamics-zebrafish

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오에서는, 우리는 공촛점 현미경으로 단세포 해상도 라이브 zebrafish의 배아에서 개발 척추 두뇌를 분석하는 방법을 보여줍니다. 이것은 우리가 단일 셀 zebrafish 배아를 주입하고 이후 개발 두뇌를 마운트와 이미지하는 방법을 포함합니다.

공촛점 현미경으로 Zebrafish 배아 뇌 영상 라이브

이 프로토콜은 zebrafish 배아를 생활에서 개별 뉴런 또는 신경 능선 세포의 이미징을 설명합니다. 이 방법은 형광 공촛점 시간 경과 현미경을 사용하여 셀룰러 행동과 굴지의 현지화을 검사하는 데 사용됩니다.

세포 운동성 및 Zebrafish 태아의 개별 뉴런과 신경 크레스트 세포의 굴지의 Cytoskeleton의 라이브 영상

초기 배아를 형성 morphogenetic 프로세스를 이해하는 데 핵심 고해상도로 이미지 세포 수있는 능력입니다. 우리는 여기서 세포막 타겟 그린 형광 단백질로 전체 zebrafish의 배아에서 세포의 단일 세포 또는 작은 클러스터를 라벨에 대한 기술을 설명합니다.

Zebrafish의 Hindbrain에 라벨 부착 및 이미징 셀

출처: Niu, L. 외. 제브라피시 배아에서 마이코박테리아 감염 중 대식세포 용해세포 사멸을 생체 내 현미경을 통해 시각화합니다. J. Vis. 경험 (2019)이 영상은 마이코박테리움 마리눔 감염 후 제브라피시 배아에서 대식세포 용해세포 사멸을 시각화하기 위해 생체 내 공초점 현미경을 사용해 보여줍니다.

제브라피시 배아에서 마이코박테리아 감염 중 대식세포 사사의 실시간 영상

이 비디오는 제브라피시 방사상 신경교세포에서 Notch/DeltaD 신호를 이미지화하기 위한 항체 흡수 분석을 보여줍니다. 여기에는 아가로스가 박힌 탈이온화된 제브라피시 배아를 장착하고, 망막 신경절 세포에 DeltaD 리간드를 표적으로 하는 염료 용액을 주입하고, 비대칭 세포 분열을 위해 형광 현미경으로 이미징하여 Notch/DeltaD 신호 활성화를 확인하는 작업이 포함됩니다.

제브라피시 방사상 신경교세포(Radial Glia progenitor)에서 Notch/DeltaD 신호 전달을 이미징하기 위한 항체 흡수 분석

출처: Lahne, M., et.al. 다광자 현미경에 의한 라이브 셀 이미징을 위한 성체 형질전환 제브라피시 망막 외식의 배양. J. Vis. Exp. (2017)이 비디오는 빛에 의한 광수용체 손상 후 아가로스가 박힌 제브라피시 망막 이식에서 Muller 신경교세포 핵 이동의 라이브 셀 이미징을 보여줍니다. 손상된 광수용체에 의해 방출된 종양 괴사 인자-알파(TNF-α)는 뮐러 신경교세포(Muller glial cell)를 활성화하여 유사분열 및 신경 전구 생성(neuronal progenitor) 생성을 위해 내핵층과 외핵층을 통한 핵 이동을 유발합니다. 캡처된 이미지는 망막 재생 중 핵 이동과 전구 세포 분화의 역학을 보여줍니다.

제브라피시 망막 재생 중 Muller Glial 핵 이동의 라이브 셀 이미징

생체 내에서 세포 기관 및 기타 세포 내 구조의 동적 거동을 이미징하면 생리학적 및 질병 조건에서 그 기능을 밝힐 수 있습니다. 여기에서는 중심체와 미토콘드리아의 두 소기관을 유전적으로 태그하고 광시야 및 컨포칼 현미경을 사용하여 살아있는 제브라피시 배아에서 이들의 역학을 이미징하는 방법을 제시합니다.

살아있는 Zebrafish의 배아에서 세포 이하 구조를 이미징

레이저 스캐닝 현미경 검사 법 긴 파장 다중 광자 형광 여기의 고급 광학 기술의 조합 안내 (sox10:EGFP)에 안내 (foxd3:GFP) zebrafish 태아 신경 크레스트 마이그레이션의 고해상도, 3 차원, 실시간 영상 캡처 구현 되었습니다.

실시간으로 개발을 시각화 하기 위해 다중 광자 시간 경과 영상: 마이그레이션 Zebrafish 태아 신경 크레스트 셀의 시각화

Zebrafish 태아 그리고 애벌레의 microinjection 많은 zebrafish 모델에서 사용 되는 중요 하지만 어려운 기술 이다. 여기, 우리 미 도구 안정화에 도움의 범위와 microinjection 및 이미징 zebrafish의 방향 제시.

최적화 된 Microinjection 및 Zebrafish 애벌레의 이미징 microstructured 장치

우리는 척추 동물의 뇌 조직을 침범하는 교 모세포종 (GBM) 세포에서 미세 소관 역학의 실시간 이미징을 허용하는 기술을보고합니다. 형광 태그가 부착된 GBM 세포를 투명한 제브라피쉬 뇌에 동종 주입하는 것을 고해상도 생체 내 이미징과 결합하면 현장 암 침범 중에 세포 골격 역학을 측정할 수 있습니다.

제브라피쉬의 뇌를 침범하는 교모세포종 세포의 미세소관 역학의 라이브 이미징

여기에 제시된 것은 3차원 형광 현미경을 사용한 유충 제브라피쉬의 생체 내 전뇌 이미징을 위한 프로토콜입니다. 실험 절차에는 샘플 준비, 이미지 획득 및 시각화가 포함됩니다.

생체 내 3차원 형광 현미경을 사용한 제브라피쉬 유충의 전뇌 이미징

배우세요 Danio rerio 배아에서 공초점 현미경을 이용한 미세아교세포 실시간 이미징 및 역학 분석 방법을. 이 프로토콜은 뇌 발달 과정에서 미세아교세포의 형태와 이동 특성을 연구하는 데 활용됩니다.

Zebrafish 배아에서 Microglia Dynamics의 실시간 이미징 및 특성 분석

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