Name: Assessing Rat Diaphragm Motor Unit Connectivity Outcome Measures: as Quantitative Biomarkers of Phrenic Motor Neuron Degeneration and Compensation(쥐 다이어프램 운동 단위 연결성 결과 측정, 골격막 운동 뉴런 퇴행 및 보상의 정량적 바이오마커로서의 측정) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-19T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: 배우세요 쥐 횡격막 운동 단위 연결성을 MuNI 기법으로 정량 평가하는 방법을. 이 비침습적 전기생리학적 접근법은 신경근 장애의 종단 연구와 호흡근 기능 이해에 활용됩니다.

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모든 절차는 미주리 대학교의 기관 동물 보호 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)에서 수립한 지침에 따라 승인되고 수행되었습니다. 실험은 11주에서 15주 사이의 성인 수컷 Sprague-Dawley 쥐를 대상으로 수행되었습니다. 이 쥐들은 쌍으로 수용되어 12:12 연암 주기에 따라 유지되었으며 표준 상업용 펠릿 식품과 HCl 처리된 물을 항상 이용할 수 있었습니다.
1. 동물 준비 및 마취 전달
<ol><li>쥐를 다루는 동안 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오.</li>
	<li>3-5% 이소플루란으로 흡입 마취제를 투여하여 적절한 유도를 보장합니다. 쥐가 적절하게 마취되면 누운 자세로 놓고 1-3% 흡입 이소플루란으로 마취를 유지합니다. 집게를 사용하여 뒷다리 발패드에 부드럽게 압력을 가하여 금단 반응이 없는지 확인하여 마취 깊이가 충분한지 확인합니다. 알림: 쥐의 크기와 체중에 따라 마취 깊이를 모니터링하고 그에 따라 이소플루란 농도를 조정합니다.</li>
	<li>자동 온도 조절 가열판을 사용하여 37°C의 온도를 유지하여 CMAP 진폭 및 대기 시간에 영향을 줄 수 있는 온도 변화를 방지합니다.</li>
	<li>동물용 석유 성분의 연고를 눈에 바르면 눈이 건조해지는 것을 방지할 수 있습니다. 호흡수를 관찰하고 집게로 발패드에 압력을 가할 때 철수 반응을 확인하여 마취 깊이를 모니터링합니다.</li>
	<li>가위를 사용하여 연구할 가슴과 목의 아래쪽 3분의 1에서 머리카락을 제거합니다. 전체 실험 동안 쥐의 호흡을 모니터링합니다. 알림: CMAP 및 MUNE 녹음 및 마취 중단 후 쥐가 충분한 의식을 회복할 때까지 쥐를 방치하지 마십시오. 완전히 회복될 때까지 동물을 홈 케이지에 반환하지 마십시오.</li>
</ol>2. 전극 배치 및 설정
<ol><li>그림 28과 같이 한 쌍의 단극 바늘 전극을 배치하여 CMAP, SMUP 및 MUNE를 기록합니다.<ol><li>활성(E1) 바늘 전극을 마지막 늑골 경계선보다 아래쪽인 중간 쇄골선 위에 피하로 배치하고 기준(E2) 바늘 전극을 xyphoid process와 마지막 흉골 연골 사이의 각도로 피하로 배치합니다. 알림: 바늘 전극은 횡격막 근육에 삽입되어서는 안 됩니다. 대신, 그들은 피하 부위에 위치해야 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>경동맥 시트에서 횡격막 신경을 자극하기 위해 한 쌍의 28G 단극 바늘 전극을 신경 자극을 위한 음극 및 양극으로 사용하고 약 1cm 떨어진 전방근과 중간 비늘근 사이의 외측 목에 피하로 배치합니다. 자극 바늘의 위치가 네 번째 경추(C4) 아래 높이에 있는지 확인하십시오. 알림: 횡격막 신경 또는 기타 구조의 손상을 방지하기 위해 자극 전극을 너무 깊게 삽입하지 마십시오. 그림 1 은 전극 배치를 보여줍니다.</li>
	<li>접지 전극의 경우 꼬리에 일회용 표면 전극을 놓습니다.</li>
</ol>3. 데이터 수집
<ol><li>프레닉 CMAP<ol><li>0.1ms의 지속 시간과 60에서 100mA 범위의 강도를 가진 단상 음극 구형파 펄스를 적용하여 횡격막 CMAP 반응을 기록하여 횡격막 CMAP 반응을 기록합니다.</li>
		<li>반응의 진폭이 더 이상 증가를 보이지 않을 때까지 자극 강도를 점진적으로 증가시키면서 CMAP 반응을 얻습니다. 초최대대 자극을 보장하려면 자극 강도를 최대 반응을 이끌어내는 데 사용되는 수준의 약 120%로 높이고 추가 반응을 기록합니다. CMAP 크기가 더 이상 증가하지 않으면 이 응답을 최대 CMAP로 간주합니다. 알림: CMAP 기록 중 동시 근육 활동 소음을 최소화하려면 호기 중에 자극을 전달하는 것이 좋습니다.</li>
		<li>CMAP의 피크 대 피크 진폭을 밀리볼트(mV) 단위로 측정하고 문서화합니다(그림 2). 참고: CMAP 진폭은 베이스-피크 및 피크-피크로 평가할 수 있습니다. 임상 전기 진단 시스템은 등전 기준선에서 초기 음의 피크까지 계산되는 베이스-피크를 평가하기 위해 기본적으로 설정되는 경우가 많습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>평균 단일 모터 단위 전위(SMUP) 크기 및 MUNE 계산<ol><li>증분 자극 기법을 사용하여 평균 SMUP 크기를 계산합니다.<ol><li>증분 반응을 이끌어내려면 1Hz 주파수에서 0.1ms 지속 시간으로 준최대값 자극을 투여하고 최소 전부 또는 전무 반응이 달성될 때까지 0.03mA 단위로 강도를 점진적으로 증가시킵니다. 2mA에서 10mA 사이의 자극 강도로 초기 반응을 얻습니다.</li>
			<li>초기 반응이 2mA에서 10mA 사이의 자극 강도로 발생하지 않는 경우 자극 음극의 위치를 수정하여 목의 횡격막에서 더 가깝게 또는 더 멀리 이동하여 필요한 자극 강도를 각각 줄이거나 높입니다.</li>
			<li>첫 번째 증분 응답이 2mA에서 10mA 범위의 자극 강도로 달성되는 경우 첫 번째 반응을 저장하고 점진적으로 더 높은 자극 강도로 추가 증분을 획득하여 0.03mA 단위로 조정하여 3.2.2단계에서 다음 기준을 충족하는 총 9개의 추가 증분을 달성합니다. 참고: 각 SMUP는 이전 증분에서 각 증분을 빼서 정량화됩니다.</li>
		</ol></li>
		<li>증분 반응을 측정하는 동안 각 증분이 다음 기준을 충족하는지 확인하십시오.<ol><li>증분 응답의 초기 음수 피크가 최대 CMAP 응답의 음수 피크와 시간적으로 일치하는지 확인합니다. 참고: 호흡 주기의 배경 소음으로 인해 관찰된 미세한 움직임은 실험의 특성에 내재되어 있습니다. 그러나 실시간 관찰 중에 SMUP가 일관되게 존재하면 특정 CMAP에 대한 SMUP의 신원을 확인할 수 있습니다.</li>
			<li>횡격막은 호흡에 관여하는 동적 근육이기 때문에 각 호흡 주기는 기본 움직임을 유도할 수 있습니다. 따라서 세 개의 중복 반응에서 일관성을 확인하여 각 증분 반응에서 분획의 안정성과 부재를 확인합니다. 알림: 낮은 진폭으로 유발된 전위, 특히 첫 번째 SMUP를 호흡 활동으로 인한 배경 소음과 구별하려면 경계를 늦추지 않고 3-4번의 호흡 주기를 관찰하는 것이 중요합니다. 또한 정확도를 위해 피크를 CMAP의 피크와 정렬해야 합니다.</li>
			<li>각 증분이 뚜렷하고 이전 증분보다 커야 합니다. 따라서 증분 응답을 실시간으로 시각적으로 구별하여 이전에 기록된 증분 위에 겹쳐지는 것을 관찰할 수 있습니다. 참고: 각 진폭에서 자극을 여러 번 반복하여 증분의 일관성을 보장하고 사전 정의된 기준을 준수하도록 할 수 있습니다.</li>
			<li>앞서 언급한 기준에 따라 각 증분을 육안으로 확인한 후 증분 진폭이 25μV 이상인지 확인합니다. 증분이 25μV 미만인 경우 측정값을 버리고 응답을 다시 평가합니다.</li>
			<li>10개의 증분 응답을 기록한 후 각 증분 응답의 진폭이 10개 증분 모두의 결합된 진폭의 1/3보다 크지 않은지(최종 응답의 총 진폭을 나타냄)를 확인합니다. 이 기준이 충족되지 않으면 10개의 증분 반응에 대한 측정을 반복합니다. 알림: 1/3의 임계값은 각 증분 응답이 단일 모터 장치의 활성화를 나타낸다는 가정을 기반으로 합니다. 증분 응답의 진폭이 10개 증분 모두의 결합된 진폭의 1/3을 초과하는 경우, 이는 응답이 단일 모터 장치의 활성화에만 전적으로 기인하지 않을 수 있음을 시사합니다. 대신, 추가 모터 단위의 모집 또는 전기 노이즈 또는 인공물과 같은 비특이적 활동의 존재에 의해 영향을 받을 수 있습니다22,26.</li>
			<li>SMUP의 평균 진폭을 추정하려면 10개 증분의 값의 평균을 구하십시오. 평균 SMUP 진폭을 측정하는 또 다른 방법은 최종 증분 응답의 전체 진폭을 총 증분 수11로 나누는 것입니다.</li>
		</ol></li>
		<li>최대 CMAP 진폭(피크-피크)을 평균 SMUP 진폭(피크-피크)으로 나누어 MUNE를 결정합니다. 특정 전기생리학 시스템에서 SMUP는 마이크로볼트(μV)로 기록되는 반면 CMAP는 일반적으로 밀리볼트(mV)로 표시됩니다. 필요한 경우 MUNE를 계산하기 전에 CMAP 및 SMUP 측정값을 동일한 단위로 변환합니다. 참고: 피크 투 피크 CMAP, 평균 SMUP 및 MUNE는 일반적으로 클리닉 근전도 시스템에 의해 자동으로 계산됩니다. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66568/66568eq01v2.jpg" style="margin: auto;"> CMAP = 복합 근육 활동 전위 SMUP = 단일 모터 단위 전위 MUNE = 모터 단위 번호 추정</li>
	</ol></li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>신경퇴행의 설치류 모델에서 횡격막 운동 단위 기능 정량화

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</ol>

<table><tbody><tr><td>2 mL 유리 주사기</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>SOMNO-2ML</td><td></td></tr><tr><td>50 mL, 모델 705 RN 주사기</td><td>Hamilton Company</td><td>7637-01</td><td>흉막 내 주사 실시에 활용</td></tr><tr><td>5008 - Formulab Diet</td><td>LabDiet</td><td>0001325</td><td></td></tr><tr><td>오토클레이브 가능 26 G 바늘 (26S RN 9.52 mm 40°C;)</td><td>Hamilton Company</td><td>7804-04</td><td>흉막내 주사를 수행하는 데 사용</td></tr><tr><td>콜레라 독소 B-소단위체(CTB)</td><td>MilliporeSigma</td><td>C9903</td><td>흉막내 주사에 사용되어 생존한 운동 뉴런을 라벨링하는 데 사용</td></tr><tr><td>콜레라 독소 B-소단위체(CTB-SAP)</td><td>고급 표적 시스템</td><td>IT-14</td><td>운동 뉴런 사멸을 유발하는 흉막내 주사에 사용</td></tr><tr><td>분리형 케이블</td><td>Technomed</td><td>202845-0000</td><td>레코더 전극을 전기 진단 기계에 연결</td></tr> 일회용 <tr><td>2" x 2" 리드 포함 디스크 전극</td><td>Cadwell</td><td>302290-000</td><td>접지 전극</td></tr><tr><td>일회용 단극 바늘 28G</td><td>Technomed</td><td>202270-000</td><td>음극 및 양극 자극 전극 기록 전극</td></tr><tr><td>EMG 바늘 케이블(Amp/stim 스위치 박스)</td><td>Cadwell</td><td>190266-200</td><td>단극 전극을 전기 진단 자극기에 연결</td></tr><tr><td>도움의 손길 철제 베이스가 있는 악어 클립</td><td>라디오 쉑</td><td>64-079</td><td>녹음 전극 배치 유지&nbsp;</td></tr><tr><td>이소플루란 (250 mL 병)</td><td>Piramal Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>monoject 곡선 팁 관개 주사기</td><td>Covidien 81412012</td><td></td><td>전극 젤</td></tr><tr><td>PhysioSuite 생리학적 모니터링 시스템과 RightTemp Homeothermic Warming</td><td>포함 Kent Scientific Corporation</td><td>PS-RT</td><td>적외선 온난화 패드, 직장 프로브, 패드 온도 프로브</td></tr><tr><td>포함 Pro trimmer Pet 그루밍 키트</td><td>Oster</td><td>078577-010-003</td><td>제모용 가위</td></tr><tr><td>사포린(SAP)</td><td>고급 표적 시스템</td><td>PR-01</td><td>흉막내 주사에 활용(단독으로 주사 시 조절제)</td></tr><tr><td>Sierra Summit EMG 시스템</td><td>Cadwell Industries, Inc., Kennewick, WA</td><td></td><td>휴대용 전기 진단 시스템</td></tr><tr><td>SomnoSuite 저유량 디지털 마취 시스템</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>SOMNO</td><td>유출 방지, 증기 방지 병 상단 어댑터가 포함되어 있습니다. Y 어댑터 튜브; 숯 청소 필터</td></tr><tr><td>Sprague-Dawley 쥐</td><td>Envigo 식민지 208a, 인디애나폴리스, IN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>수의사 석유 기반 안과 연고&nbsp;</td><td>Puralube</td><td>26870</td>은 <td>각막 손상을 피하기 위해 마취 중에 적용됩니다</td></tr></tbody></table>.

assessing rat diaphragm motor unit connectivity outcome measures: as quantitative biomarkers of phrenic motor neuron degeneration and compensation(쥐 다이어프램 운동 단위 연결성 결과 측정, 골격막 운동 뉴런 퇴행 및 보상의 정량적 바이오마커로서의 측정)

Assessing Rat Diaphragm Motor Unit Connectivity Outcome Measures as Quantitative Biomarkers of Phrenic Motor Neuron Degeneration and Compensation

이 보고서에 요약된 CMAP, SMUP 및 MUNE 기술을 사용하면 최소 침습 전극 배치를 사용하여 횡격막 근육의 신경근 기능을 기록할 수 있습니다(그림 1). 진폭 및 면적의 매개변수는 최대 CMAP 크기를 특성화하는 데 사용할 수 있으며, 근육 그룹 출력의 전반적인 측정을 제공합니다(그림 2). 그러나 현재 방법에서는 CMAP와 SMUP 크기를 모두 정량화하기 위해 진폭에 의존합니다. CMAP, SMUP 및 MUNE는 신경근 질환의 다양한 랫트 모델에서 신경근 기능을 측정하는 데 사용할 수 있습니다. MN 변성의 맥락에서 MU 손실을 입증하기 위해 랫트는 횡격막 MN 및 추가 CTB(25μg)를 표적으로 하기 위해 CTB-SAP(25μg)를 동반한 양측 흉막내 주사를 받았고, 대조군 랫트는 비접합 CTB(25μg) 및 SAP(25μg)1,27를 투여받았습니다.
그림 3에서는 흉막내 CTB-SAP 주입 7일 후 성체 대조군 쥐와 성체 쥐(12주)의 결과를 비교했습니다. CTB-SAP의 흉막내 주사 후, 대조군 쥐에서 74개의 기능적 운동 단위의 정상 소견과 비교하여 MUNE는 60개의 추정된 기능적 운동 단위에서 감소합니다. 그러나 CTB-SAP 랫트의 CMAP 진폭(14.25mV 피크 투 피크)은 대조군(14. 5mV 피크 투 피크)에 비해 최소한의 변화를 보였는데, 이는 부수적 발아로 인한 것으로 보입니다. 그림 4에서 다이어프램 CMAP, SMUP 및 MUNE는 양측으로 획득되었으며 주입 후 7일(n = 14), 14(n = 14), 21(n = 6) 및 28(n = 14)일 후에 기준선/사전 주입(n = 14)에서 평균을 냈습니다. 그림 4에서는 그룹 간의 기준선 차이가 발견되지 않았습니다. MUNE는 CTB-SAP 랫트에서 MUNE가 ~40% 감소하면서 시간(p &lt; 0.05), CTB-SAP(p &lt; 0.001) 및 상호 작용 시간 x CTB-SAP(p &lt; 0.01)에 대해 유의한 변화를 보였습니다. CTB-SAP 랫트의 평균 SMUP는 시간(p &lt; 0.05) 및 CTB-SAP(p &lt; 0.01)에 따라 유의한 변화를 보였지만 SMUP 진폭의 ~50-60% 증가와 유의한 상호 작용은 없었습니다. CMAP는 큰 변화를 보이지 않았습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66568/66568fig01.jpg"> 그림 1: 전극 배치. (A) 자극 음극과 (B) 양극은 약 1cm 간격으로 전방근과 중근육 사이의 외측 경부에 피하로 삽입됩니다. (C) "활성" 전극(E1) 및 (D) "기준" 기록 전극(E2)은 시포돌기와 마지막 늑골 연골 사이의 각도를 따라 마지막 늑골 경계보다 아래쪽의 쇄골 중앙선 위에 위치합니다. 또한, (E) 일회용 디스크 전극은 아티팩트를 최소화하기 위해 접지로 꼬리에 위치합니다. BioRender.com 로 만들어졌습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66568/66568fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66568/66568fig02.jpg"> 그림 2: 복합 근육 활동 전위. 좌측 반격막 근육에서 기록된 대표적인 CMAP 반응의 그림. CMAP 피크 대 피크 진폭은 음의 피크 전압에서 양의 피크 전압까지 결정됩니다. 약어: CMAP = 복합 근육 활동 전위. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66568/66568fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66568/66568fig03.jpg"> 그림 3: 대조군 쥐와 CTB-SAP 흉막내 주입 7일 후 성체 쥐의 두 가지 대표적인 CMAP 및 MUNE 기록. (A) 피크 대 피크 진폭이 14.5mV인 대조군 성체 쥐(생후 12주)의 좌 횡격막 복합 근육 활동 전위(CMAP). 화면 감도 = 1mV/분할 및 화면 지속 시간 1ms/분할. (B) 총 진폭이 1.940mV인 10개의 후속 증분 응답을 10으로 나누어 평균 SMUP 크기(0.194mV)를 결정합니다. 화면 감도 = 0.2mV/분할 및 스윕 속도 1ms/분할. 계산된 MUNE = 74 (MUNE=CMAP/평균 SMUP (14.5 mV/ 0.194 mV)) (C) CTB-SAP 주입 7일 후 Phrenic CMAP는 CMAP 피크 대 피크 진폭 14.25mV에서 거의 변화가 없음을 보여줍니다. 화면 감도 = 1mV/분할 및 스윕 속도 1ms/분할. (D) 총 피크 대 피크 진폭이 2.360mV인 10으로 나눈 10개의 후속 증분 응답을 통해 0.236mV의 평균 SMUP 크기를 얻습니다. 화면 감도 = 0.2mV/분할 및 1ms/분할의 스윕 속도. 따라서 계산된 MUNE는 60입니다. 약어: CMAP = 복합 근육 활동 전위; MUNE = 모터 단위 번호 추정; CTB-SAP = 사포린에 접합된 콜레라 독소 B 단편; SMUP = 단일 모터 유닛 전위. *전기 자극으로 인한 아티팩트를 보여줍니다. 전기 자극의 진폭과 CMAP의 대조와 증분 반응 사이의 대비로 인해 자극의 일부만 그래프로 표시했다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 접근성을 개선하기 위해 증분 응답의 시각화를 향상시키기 위해 블라인드 색상의 친근한 색상이 사용되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66568/66568fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66568/66568fig04.jpg"> 그림 4: CTB-SAP 후 CMAP, SMUP 및 MUNE의 전기생리학적 평가. 그룹 간의 기준선 차이는 발견되지 않았습니다(CTB-SAP 및 대조군 모두에서 11주 된 수컷 쥐 7마리). (A) CMAP는 유의미한 변화를 보이지 않았다. (B) CTB-SAP 랫트의 평균 SMUP은 시간이 지남에 따라(p &lt; 0.05) CTB-SAP의 경우 유의한 변화(p &lt; 0.01)를 보였으며 유의한 상호 작용 없이 SMUP 진폭이 50-60% 증가했음을 나타냅니다. (C) CTB-SAP 투여 7일 후, 평균 MUNE는 ±102.58 ± 20.54에서 72.43 ± 15.59로 27.07% 유의하게 감소하였다. 이러한 하락세는 지속되어 28일 동안 11.75% 추가로 하락했습니다(MUNE: 60.64 ± 11.33, p &lt; 0.01). 주입 후 7일, 14일 및 28일 후의 기준선에서의 모든 측정값은 14마리의 쥐로부터 얻었으며, n = 7마리의 쥐에게 복합 CTB-SAP를 주입하고 n = 7명의 쥐에게 비결합 CTB 및 SAP를 대조군으로 투여했습니다. 21일째에 6마리의 쥐가 사용되었다. CMAP, SMUP, MUNE 데이터는 평균으로 표시하고, 이원 ANOVA를 사용하여 비교를 수행하였다. 별표는 *p &lt; 0.05, **p &lt; 0.01과 같이 다양한 시점에서의 차이를 나타냅니다. 약어: CMAP = 복합 근육 활동 전위; MUNE = 모터 단위 번호 추정; CTB-SAP = 사포린에 접합된 콜레라 독소 B 단편; SMUP = 단일 모터 유닛 전위. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66568/66568fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Assessing Rat Diaphragm Motor Unit Connectivity Outcome Measures: as Quantitative Biomarkers of Phrenic Motor Neuron Degeneration and Compensation(쥐 다이어프램 운동 단위 연결성 결과 측정, 골격막 운동 뉴런 퇴행 및 보상의 정량적 바이오마커로서의 측정)

Loss of ventilatory muscle function is a consequence of motor neuron injury and neurodegeneration (e.g., cervical spinal cord injury and amyotrophic ...

assessing-rat-diaphragm-motor-unit-connectivity-outcome-measures-as

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

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쥐의 횡격장 신경을 자극하여 복합 근육 활동 전위를 측정합니다.

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