Name: 닭의 위장관에서 혐기성 박테리아의 배양을 강화하기 위한 전략 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 36 s
Description: 배우세요 닭 위장관에서 혐기성 박테리아를 분리하고 배양하는 방법을. 무산소 기술을 활용하여 다양한 균종을 회복하고 마이오이노시톨 대사 경로를 연구하세요. 이 프로토콜은 가금류 장내 미생물 군집 이해를 높입니다.

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<meta charset="utf8"></head><body>Cultivation Strategies for Uncultured Microbial Diversity in the Chicken GI Tract(닭 위장관의 배양되지 않은 미생물 다양성을 위한 배양 전략)

<ol><li>Wylensek, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+collection+of+bacterial+isolates+from+the+pig+intestine+reveals+functional+and+taxonomic+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">A collection of bacterial isolates from the pig intestine reveals functional and taxonomic diversity.</a> Nat Comm. 11 (1), 6389(2020).</li>
<li>Medvecky, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+genome+sequencing+and+function+prediction+of+133+gut+anaerobes+isolated+from+chicken+caecum+in+pure+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Geno%22%5BJournal%5D)">Whole genome sequencing and function prediction of 133 gut anaerobes isolated from chicken caecum in pure cultures.</a> BMC Geno. 19 (1), 561(2018).</li>
<li>Zenner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early-life+immune+system+maturation+in+chickens+using+a+synthetic+community+of+cultured+gut+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22mSystems%22%5BJournal%5D)">Early-life immune system maturation in chickens using a synthetic community of cultured gut bacteria.</a> mSystems. 6 (3), 1110-1128 (2021).</li>
<li>Borda-Molina, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+on+the+ileal+microbiota+of+phosphorus+and+calcium+utilization%2C+bird+performance%2C+and+gender+in+japanese+quail%5BTitle%5D)+AND+%22Animals%22%5BJournal%5D)">Effects on the ileal microbiota of phosphorus and calcium utilization, bird performance, and gender in japanese quail.</a> Animals. 10 (5), 885(2020).</li>
<li>Bonnet, M., Lagier, J. C., Raoult, D., Khelaifia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+culture+through+selective+and+non-selective+conditions%3A+The+evolution+of+culture+media+in+clinical+microbiology%5BTitle%5D)+AND+%22New+Micro+New+Infect%22%5BJournal%5D)">Bacterial culture through selective and non-selective conditions: The evolution of culture media in clinical microbiology.</a> New Micro New Infect. 34, 100622(2020).</li>
<li>Tanaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hidden+pitfall+in+the+preparation+of+agar+media+undermines+microorganism+cultivability%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A hidden pitfall in the preparation of agar media undermines microorganism cultivability.</a> Appl Environ Microbiol. 80 (24), 7659-7666 (2014).</li>
<li>Kawasaki, K., Kamagata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphate-catalyzed+hydrogen+peroxide+formation+from+agar%2C+gellan%2C+and+%CE%BA-carrageenan+and+recovery+of+microbial+cultivability+via+catalase+and+pyruvate%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Phosphate-catalyzed hydrogen peroxide formation from agar, gellan, and κ-carrageenan and recovery of microbial cultivability via catalase and pyruvate.</a> Appl Environ Microbiol. 83 (21), e01366-e01417 (2017).</li>
<li>Kato, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+previously+uncultured+slow-growing+bacteria+by+using+a+simple+modification+in+the+preparation+of+agar+media%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Isolation of previously uncultured slow-growing bacteria by using a simple modification in the preparation of agar media.</a> Appl Environ Microbiol. 84 (19), e00807-e00818 (2018).</li>
<li>Lewis, W. H., Tahon, G., Geesink, P., Sousa, D. Z., Ettema, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innovations+to+culturing+the+uncultured+microbial+majority%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Innovations to culturing the uncultured microbial majority.</a> Nat Rev Microbiol. 19 (4), 225-240 (2021).</li>
<li>Su, X. B., Ko, A. L. A., Saiardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulations+of+myo-inositol+homeostasis%3A+Mechanisms%2C+implications%2C+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Biol+Regul%22%5BJournal%5D)">Regulations of myo-inositol homeostasis: Mechanisms, implications, and perspectives.</a> Adv Biol Regul. 87, 2212-4926 (2023).</li>
<li>Monastra, G., Dinicola, S., Unfer, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMonastra%2C+G+%22Physiological+and+pathophysiological+roles+of+inositols+in+A+clinical+guide+to+inositols%22">Physiological and pathophysiological roles of inositols in A clinical guide to inositols</a>. , Elsevier. (2023).</li>
<li>Kanehisa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+understanding+the+origin+and+evolution+of+cellular+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Prot+Sci%22%5BJournal%5D)">Toward understanding the origin and evolution of cellular organisms.</a> Prot Sci. 28 (11), 1947-1951 (2019).</li>
<li>Lee, S. A., Nagalakshmi, D., Raju, M. V., Rao, S. V. R., Bedford, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+phytase+superdosing%2C+myo-inositol+and+available+phosphorus+concentrations+on+performance+and+bone+mineralisation+in+broilers%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Nutri%22%5BJournal%5D)">Effect of phytase superdosing, myo-inositol and available phosphorus concentrations on performance and bone mineralisation in broilers.</a> Animal Nutri. 3 (3), 247-251 (2017).</li>
<li>Farhadi, D., Karimi, A., Sadeghi, G., Rostamzadeh, J., Bedford, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+high+dose+of+microbial+phytase+and+myo-inositol+supplementation+on+growth+performance%2C+tibia+mineralization%2C+nutrient+digestibility%2C+litter+moisture+content%2C+and+foot+problems+in+broiler+chickens+fed+phosphorus-deficient+diets%5BTitle%5D)+AND+%22Poultry+Sci%22%5BJournal%5D)">Effects of a high dose of microbial phytase and myo-inositol supplementation on growth performance, tibia mineralization, nutrient digestibility, litter moisture content, and foot problems in broiler chickens fed phosphorus-deficient diets.</a> Poultry Sci. 96 (10), 3664-3675 (2017).</li>
<li>Weber, M., Fuchs, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+in+the+niche%3A+A+large-scale+genome-based+survey+reveals+inositol+utilization+to+be+widespread+among+soil%2C+commensal%2C+and+pathogenic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microbio+Spect%22%5BJournal%5D)">Metabolism in the niche: A large-scale genome-based survey reveals inositol utilization to be widespread among soil, commensal, and pathogenic bacteria.</a> Microbio Spect. 10 (4), e02013-e02022 (2022).</li>
<li>Kawsar, H. I., Ohtani, K., Okumura, K., Hayashi, H., Shimizu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+transcriptional+regulation+of+myo-inositol+operon+in+Clostridium+perfringens%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">Organization and transcriptional regulation of myo-inositol operon in Clostridium perfringens.</a> FEMS Microbiol Lett. 235 (2), 289-295 (2004).</li>
<li>Hellinckx, J., Heermann, R., Felsl, A., Fuchs, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+binding+affinity+of+repressor+IolR+avoids+costs+of+untimely+induction+of+myo-inositol+utilization+by+Salmonella+Typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">High binding affinity of repressor IolR avoids costs of untimely induction of myo-inositol utilization by Salmonella Typhimurium.</a> Sci Rep. 7 (1), 44362(2017).</li>
<li>Yebra, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+gene+cluster+enabling+Lactobacillus+casei+BL23+to+utilize+myo-inositol%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of a gene cluster enabling Lactobacillus casei BL23 to utilize myo-inositol.</a> Appl Environ Microbiol. 73 (12), 3850-3858 (2007).</li>
<li>Zhang, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+iol+clusters+in+Lactobacillus+casei+strains%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of iol clusters in Lactobacillus casei strains.</a> World J Microbiol Biotechnol. 26, 1949-1955 (2010).</li>
<li>Labeda, D. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLabeda%2C+DP+%22Bergey%27s+manual+of+systematic+bacteriology%22">Bergey's manual of systematic bacteriology</a>. , Springer. (2001).</li>
<li>Peterson, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+media+on+transport+and+recovery+of+anaerobic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Effect of media on transport and recovery of anaerobic bacteria.</a> Clin Infect Dis. 25, 134-136 (1997).</li>
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<li>Gilroy, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+microbial+diversity+within+the+chicken+gut+microbiome+revealed+by+metagenomics+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">Extensive microbial diversity within the chicken gut microbiome revealed by metagenomics and culture.</a> PeerJ. 9, e10941(2021).</li>
<li>Huang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chicken+gut+metagenome+and+the+modulatory+effects+of+plant-derived+benzylisoquinoline+alkaloids%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">The chicken gut metagenome and the modulatory effects of plant-derived benzylisoquinoline alkaloids.</a> Microbiome. 6 (1), 1-17 (2018).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+microbial+genomes+and+gene+catalog+of+the+chicken+gut+from+metagenomic+sequencing+of+high-fidelity+long+reads%5BTitle%5D)+AND+%22GigaScience%22%5BJournal%5D)">Improved microbial genomes and gene catalog of the chicken gut from metagenomic sequencing of high-fidelity long reads.</a> GigaScience. 11, 116(2022).</li>
<li>Segura-Wang, M., Grabner, N., Koestelbauer, A., Klose, V., Ghanbari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-resolved+metagenomics+of+the+chicken+gut+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genome-resolved metagenomics of the chicken gut microbiome.</a> Front Microbiol. 12, 726923(2021).</li>
<li>Borrelli, R. C., Fogliano, V., Monti, S. M., Ames, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+melanoidins+from+a+glucose-glycine+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Euro+Food+Res+Technol%22%5BJournal%5D)">Characterization of melanoidins from a glucose-glycine model system.</a> Euro Food Res Technol. 215, 210-215 (2002).</li>
<li>Ferrario, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Untangling+the+cecal+microbiota+of+feral+chickens+by+culturomic+and+metagenomic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Untangling the cecal microbiota of feral chickens by culturomic and metagenomic analyses.</a> Environ Microbiol. 19 (11), 4771-4783 (2017).</li>
<li>Crhanova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+culturomics+shows+that+half+of+chicken+caecal+microbiota+members+can+be+grown+in+vitro+except+for+two+lineages+of+clostridiales+and+a+single+lineage+of+bacteroidetes%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Systematic culturomics shows that half of chicken caecal microbiota members can be grown in vitro except for two lineages of clostridiales and a single lineage of bacteroidetes.</a> Microorganisms. 7 (11), 496(2019).</li>
<li>Rubio, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactobacilli+counts+in+crop%2C+ileum+and+caecum+of+growing+broiler+chickens+fed+on+practical+diets+containing+whole+or+dehulled+sweet+lupin+%28lupinus+angustifolius%29+seed+meal%5BTitle%5D)+AND+%22British+Poult+Sci%22%5BJournal%5D)">Lactobacilli counts in crop, ileum and caecum of growing broiler chickens fed on practical diets containing whole or dehulled sweet lupin (lupinus angustifolius) seed meal.</a> British Poult Sci. 39 (3), 354-359 (1998).</li>
<li>Bjerrum, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+community+composition+of+the+ileum+and+cecum+of+broiler+chickens+as+revealed+by+molecular+and+culture-based+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Poult+Sci%22%5BJournal%5D)">Microbial community composition of the ileum and cecum of broiler chickens as revealed by molecular and culture-based techniques.</a> Poult Sci. 85 (7), 1151-1164 (2006).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>아세트산</td><td>VWR</td><td>20104.334</td><td></td></tr><tr><td>한천</td><td>VWR</td><td>97064-332</td><td></td></tr><tr><td>염화 암모늄</td><td>Carl Roth</td><td>P726.1</td><td></td></tr><tr><td>혐기성 스테이션</td><td>Don Whitley Scientific</td><td>A35 HEPA</td><td></td></tr><tr><td>부티르산</td><td>Merck</td><td>8.0045.1000</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘 이수화물&nbsp;</td><td>VWR</td><td>97061-904</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>닭 라이소자임(무라미다아제)</td><td>VWR</td><td>1.05281.0010</td><td></td></tr><tr><td>시스테인</td><td>VWR</td><td>97061-204</td><td></td></tr><tr><td>포도당</td><td>VWR</td><td>90000-908</td><td></td></tr><tr><td>인산수소이칼</td>륨 <td>Carl Roth</td><td>P749.1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Carl Roth</td><td>8043.2</td><td></td></tr><tr><td>Legehennen/ Junghennenfutter</td><td>Deutsche Tiernahrung Cremer GmbH & Co. KG, D&uuml; 독일 셀도르프</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>MagAttract HMW DNA Kit</td><td>Qiagen</td><td>67563</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘</td><td>Carl Roth</td><td>2189.1</td><td></td></tr><tr><td>혼합 가스(80% N2(품질 수준 5.0), 15% CO2(품질 수준 3.0) 및 5% H2(품질 수준 5.0))</td><td>Westfalen Gase GmbH, 독일</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Mutanolysin, 재조합 (동결 필리세이트)</td> <td>A & 생명공학</td><td>1017-10L</td><td></td></tr><tr><td>Myo-inositol</td><td>Carl Roth</td><td>4191.2</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1X</td><td>ChemSolute</td><td>8418.01</td><td></td></tr><tr><td>Potassium dihydrogen phosphate</td><td>Carl Roth</td><td>3904.2</td><td></td></tr><tr><td>Propionic acid</td><td>Carl Roth</td><td>6026.1</td><td></td></tr><tr><td>QuantiFluor dsDNA 시스템</td><td>Promega</td><td>E2671</td><td></td></tr><tr><td>RNAse A&nbsp;</td><td>QIAGEN 리보뉴클레아제 A(RNase A)&nbsp;</td><td>19101</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>VWR</td><td>27800.291</td><td></td></tr><tr><td>레사주린나트륨</td><td>VWR</td><td>85019-296</td><td></td></tr><tr><td>티오글리콜산나트륨</td><td>시그마-알드리치 102933</td><td></td><td></td></tr><tr><td>대두 펩톤, GMO-Free, Animal-Free</td><td>VWR</td><td>97064-186</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Bio-Rad</td><td>T100</td><td></td></tr><tr><td>트립톤</td><td>Carl Roth</td><td>8952.1</td><td></td></tr><tr><td>Tween80</td><td>Carl Roth</td><td>9139.2</td><td></td></tr><tr><td>비타민 믹스 (보충제)</td><td>VWR</td><td>968290NL</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Star Lab</td><td>07127/92930</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>Carl Roth</td><td>9257.05</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-D-Fructose</td><td>VWR</td><td>53188-23-1</td><td></td></tr></tbody></table>

닭의 위장관에서 혐기성 박테리아의 배양을 강화하기 위한 전략

Strategies to Enhance Cultivation of Anaerobic Bacteria from Gastrointestinal Tract of Chicken

운송 중 혐기성 상태 모니터링 소듐 레자주린(sodium resazurin)의 첨가로 인해, 샘플을 튜브로 이송하기 전에 수송 용액의 색상이 분홍색으로 변하는 것은 혐기성 조건의 유지가 중단되거나 실패했음을 나타냅니다. 따라서 그림 2에서 볼 수 있듯이 색상 변화를 보이는 튜브는 운송 중 사용을 자제하고 색상 변화가 없는 튜브만 사용했습니다.
염기서열분석 결과 분석 과도한 배경 잡음 또는 기준선의 중단, 신호 강도가 낮은 피크, 단일 위치에 여러 개 또는 겹치는 피크의 존재, 샘플의 오염, 불균일한 증폭 또는 염기서열분석 공정 중 문제를 나타내는 신선하고 순수한 배양을 사용하여 크로마토그램 데이터가 있는 분리체의 DNA 추출을 반복했습니다. NCBI에서 BLAST 검색을 수행할 때 가장 높은 퍼센트 ID와 높은 쿼리 커버를 보여주는 균주는 분리체와의 관련 균주였으며 이는 분리체 식별로 이어졌습니다.
광범위한 혐기성 박테리아 배양 혐기성 박테리아의 분리로 인해 5개의 서로 다른 배지에서 얻은 600개 이상의 분리액이 별도의 병에서 준비 및 멸균되었습니다. 16S rRNA 유전자를 사용한 식별은 15개의 서로 다른 박테리아 속을 생성했습니다(그림 4). 총 분리체 수 중 절반 이상은 엄격한 혐기성 박테리아를 나타내고 나머지는 통성 혐기성 박테리아입니다.
분리물의 다양성에는 8 가지 균주가 포함되며, Clostridiaceae, Lactobacillaceae 및 Oscillospiraceae 계통의 구성원과 관련된 새로운 분류 학적 종을 보여줍니다 (표 5) 25. 이러한 결과는 배양 배지 준비 및 다양한 배지 사용에서 좋은 관행을 고수하는 것이 재배 연구의 성공을 위해 중요하다는 것을 강조합니다.
표적 격리 최소 한천 매체에서 콜로니를 관찰하면 MI를 탄소원으로 활용할 수 있는 혐기성 박테리아가 존재할 가능성이 있음을 시사합니다(그림 5). 이러한 결과를 유전자 수준에서 결정적으로 확인하기 위해 전체 게놈 염기서열 분석을 통한 포괄적인 분석을 수행할 수 있습니다. 이 염기서열분석 접근법을 통해 iolA, iolB, iolC, iolD, iolE, iolF, iolG, iolH, iolI, iolJ, iolT 및 iolW를 포함하여 MI 대사와 관련되거나 기여하는 특정 유전자를 식별할 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66570/66570fig01.jpg"> 그림 1: 혐기성 박테리아 배양을 위한 GIT 절편을 샘플링하고 운반하는 과정. 1) 섹션은 절단하기 전에 고정되어 닫힙니다. 점선은 권장 절단 위치를 나타냅니다. 2) 샘플링된 섹션을 운송 용액으로 채워진 Hungate 튜브로 옮깁니다. 3) 혐기성 상태를 유지하기 위해 수송액을 주입하여 공기 대기를 교체합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66570/66570fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66570/66570fig02.jpg"> 그림 2: 닭의 회장 절편에서 얻은 샘플이 들어있는 Hungate 튜브의 그림. 이 이미지는 Hungate 튜브를 수송 용액으로 적절하게 충전하여 샘플이 없는 대조군에 비해 공기 공간이 없고 일관된 색상을 유지하는 것을 보여줍니다. 시료 튜브에서 눈에 띄는 탁도는 digesta의 용해에 기인합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66570/66570fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66570/66570fig03.jpg"> 그림 3: 혐기성 박테리아 보존의 순차적 단계. 1) 등장성 용액에서 24시간에서 48시간까지의 축삭 배양으로 바이오매스 수확. 2) 원심분리 및 상층액 제거 과정에 의한 세균 세포의 세척으로 남은 배지를 제거합니다. 3) 세탁 과정의 반복. 4) 배양 배지와 50% 글리세롤 용액에 펠릿을 용해시킨 후 -80°C에서 멸균 극저온에 보관합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66570/66570fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66570/66570fig04.jpg"> 그림 4: 속 수준에서 분리된 박테리아의 분류학적 분포. 누적 막대 차트는 5개의 서로 다른 배지 제형에서 분리된 박테리아의 다양성을 보여주며, 이 연구에서 다양한 배지 제형을 사용하는 것의 유익한 영향을 강조합니다. 매체 제형은 표 1에 나열되어 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66570/66570fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66570/66570fig05.jpg"> 그림 5: 최소 한천 매질의 혐기성 박테리아 군집. 39 °C에서 24시간 배양 후 최소한의 한천 매체에서 번성하는 혐기성 박테리아 군집. 군체의 개발은 다른 탄소원 중에서 주요 탄소원으로서 myo-inositol의 잠재적인 동화 가능성을 시사합니다. 두 개의 희석액이 제시되는데, (A) 10-1, 그들의 풍부함으로 인해 실제 열거를 능가하는 콜로니 수를 드러냅니다. 및 (B) 10-2, 구별 가능하고 계산 가능한 콜로니를 표시하여 선택적 분석을 용이하게 합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66570/66570fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2">미디어</td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
			<td>3</td>
			<td>4</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>펩톤 미디어</td>
			<td>다당류 매체</td>
			<td>짧은 지방산 매체</td>
			<td>탄수화물 미디어</td>
			<td>설파토 환원 박테리아(SRB) 매체</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">C의 출처</td>
			<td>포도당 0.2%</td>
			<td rowspan="2">가금류 사료 (2%)</td>
			<td rowspan="2">아세트산 0.17%, 이소발레르산 0.01%, 프로피온산 0.2%, 부티르산 0.2%</td>
			<td rowspan="2">포도당 5%</td>
			<td rowspan="2">Na-DL-락테이트, 아스코르브산</td>
		</tr><tr><td>전분 0.05%</td>
		</tr><tr><td>N의 출처</td>
			<td>대두에서 추출한 아미노산(1%)</td>
			<td>-</td>
			<td>트립톤 및 육류 추출물의 아미노산 (0.1%)</td>
			<td>대두 펩톤에서 추출한 아미노산 (0.1%), (NH4)3 구연산 (0.1%)</td>
			<td>NH4Cl (0.1의 %)</td>
		</tr><tr><td>미네랄 공급원</td>
			<td>케이2HPO4 (0.05%)</td>
			<td>-</td>
			<td>케이2HPO4 (0.05%)</td>
			<td>케이2HPO4 (0.05%)</td>
			<td>케이2HPO4 (0.05%)</td>
		</tr><tr><td>우뭇가사리</td>
			<td>1.50%</td>
			<td>1.50%</td>
			<td>1.50%</td>
			<td>1.50%</td>
			<td>1.50%</td>
		</tr><tr><td>보조인자 (멸균 후 추가)</td>
			<td>효모 추출물 (0.1의 %)</td>
			<td>-</td>
			<td>비타민 믹스 (0.01의 %)</td>
			<td>비타민 믹스 (0.01의 %)</td>
			<td>효모 추출물 (0.01%)</td>
		</tr><tr><td>억제제</td>
			<td>없음</td>
			<td>없음</td>
			<td>트윈 80 (1%)</td>
			<td>메나디온 (0.05%)</td>
			<td>-</td>
		</tr></tbody></table>표 1: 광범위한 박테리아 분리를 위한 배양 배지의 구성. 5개의 한천 매체의 구성, 각 매체는 탄소원, 질소원, 광물 공급원, 보조 인자 및 억제제의 통합의 변화에 따라 고유하게 제조됩니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>구성</td>
			<td>총계 (g/L)</td>
		</tr><tr><td>카제인 펩톤</td>
			<td>17</td>
		</tr><tr><td>대두 펩톤</td>
			<td>3</td>
		</tr><tr><td>소금</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>인산수소디칼륨</td>
			<td>2.5</td>
		</tr><tr><td>마이오-이노시톨</td>
			<td>2.5</td>
		</tr></tbody></table>표 2: 농축 매체 조성. 광범위한 박테리아의 성장을 지원하기 위해 복잡한 성분의 혼합물로 설계된 배지 제형. 각 성분의 수량은 g/L로 표시됩니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>구성</td>
			<td>최소 한천 매체 (g / mL) / L</td>
			<td>최소 육수 매체(g/mL)/ L</td>
		</tr><tr><td>L-시스틴</td>
			<td>0.5</td>
			<td>0.5</td>
		</tr><tr><td>소금</td>
			<td>0.3</td>
			<td>0.3</td>
		</tr><tr><td>소듐티오글리콜레이트</td>
			<td>0.5</td>
			<td>0.5</td>
		</tr><tr><td>소듐 수소 인산염 이수화물</td>
			<td>0.53</td>
			<td>0.53</td>
		</tr><tr><td>인산이수소칼륨</td>
			<td>0.41</td>
			<td>0.41</td>
		</tr><tr><td>염화 암모늄</td>
			<td>0.3</td>
			<td>0.3</td>
		</tr><tr><td>염화칼슘</td>
			<td>0.11</td>
			<td>0.11</td>
		</tr><tr><td>염화마그네슘</td>
			<td>0.1</td>
			<td>0.1</td>
		</tr><tr><td>트립톤</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr><tr><td>증권 시세 표시기</td>
			<td>0.00773</td>
			<td>0.00773</td>
		</tr><tr><td>미량 원소 용액 SL7</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>비타민 믹스</td>
			<td>0.2</td>
			<td>0.2</td>
		</tr><tr><td>마이오-이노시톨(20mM)</td>
			<td>3.6</td>
			<td>3.6</td>
		</tr><tr><td>우뭇가사리</td>
			<td>15</td>
			<td>--</td>
		</tr><tr><td>pH(1mM HCl 사용)</td>
			<td>6 ± 0.2</td>
			<td>6 ± 0.2</td>
		</tr></tbody></table>표 3: 최소 매체 조성. 이 매체는 미오-이노시톨을 주요 탄소원으로 하여 제조됩니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>초기 변성(Initial Denaturation)</td>
			<td>95 캜</td>
			<td>4 민</td>
			<td>1배</td>
		</tr><tr><td>변성</td>
			<td>95 캜</td>
			<td>30들</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>어 닐 링</td>
			<td>52 캜</td>
			<td>30들</td>
			<td>30배</td>
		</tr><tr><td>확장</td>
			<td>68 캜</td>
			<td>90 초</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>최종 확장</td>
			<td>68 캜</td>
			<td>10분</td>
			<td>1배</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>4 캜</td>
			<td>∞</td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>표 4: 16S rRNA 유전자 증폭을 위한 최적의 조건. 표적 유전자의 효율적인 증폭을 위해 thermocycler에 사용되는 이상적인 온도, 지속 시간 및 사이클링 매개변수.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>새로운 분류 체계 할당</td>
			<td>게놈 크기</td>
			<td>GC 함량</td>
			<td>장 부위</td>
			<td>16S 가입 </td>
		</tr><tr><td>갈리 모실락토바실러스 갈리</td>
			<td>1861581</td>
			<td>50.43</td>
			<td>멀떠구니</td>
			<td>OM760982</td>
		</tr><tr><td>리모실락토바실러스 아비움</td>
			<td>2158112</td>
			<td>48.49</td>
			<td>회장</td>
			<td>OM760983</td>
		</tr><tr><td>리모실락토바실러스 풀리(Limosilactobacillus pulli)</td>
			<td>1924125</td>
			<td>45.87</td>
			<td>회장</td>
			<td>OQ831033</td>
		</tr><tr><td>클로스트리듐 부타놀리프로벤스</td>
			<td>3507657</td>
			<td>28.34</td>
			<td>멀떠구니</td>
			<td>OQ831034</td>
		</tr><tr><td>Faecalispora anaeroviscerum</td>
			<td>2921858</td>
			<td>50.36</td>
			<td>회장</td>
			<td>OM760984</td>
		</tr><tr><td>리모실락토바실러스 내장(Limosilactobacillus viscerum)</td>
			<td>1993658</td>
			<td>44.9</td>
			<td>회장</td>
			<td>OM760986</td>
		</tr><tr><td>리길락토바실러스 호엔하이멘시스(Ligilactobacillus hohenheimensis)</td>
			<td>1381484</td>
			<td>50.47</td>
			<td>공장</td>
			<td>OM760988</td>
		</tr><tr><td>리모실락토바실러스 디피실리스(Limosilactobacillus difficilis)</td>
			<td>1998683</td>
			<td>47.38</td>
			<td>회장</td>
			<td>OQ832131</td>
		</tr></tbody></table>표 5. 새로운 박테리아 종의 분류학적 식별. 이 연구에서 닭의 위장관에서 분리 및 확인된 새로운 박테리아 종은 게놈 크기, GC 함량, 섹션 및 16S rRNA 유전자 가입과 함께 자세히 설명되어 있습니다. 이 테이블은25에서 수정되었습니다.

The gastrointestinal tract (GIT) of chicken is a complex ecosystem harboring trillions of microbes that play a pivotal role in the host&#39;s physiology, ...

strategies-to-enhance-cultivation-anaerobic-bacteria-from

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

클로 스트 리듐 디피는 엄격한 혐기성 미생물과 항생제 관련 설사 (AAD)를 일으키는 원인이되는 병원성 세균입니다. 여기서, 분리 배양 및 C를 유지하기위한 방법 어울리지 않는 식물 세포 및 포자가 설명되어 있습니다. 이 기술은 최적의 C에 대한 적절한 조건을 보장하기 위해 정기적 인 유지 보수를 필요로하는 혐기성 챔버를 필요로 남과 어울리지 재배.

배양 및 유지<em&gt; 클로 스트 리듐 디피</em&gt; 혐기성 환경에서

박테리오신은 다양한 생태 학적 틈새에서 미생물 다양성을 정의하는 데 중요한 역할을한다고 여겨집니다. 여기서 우리는 박테리오신이 동물 모델에서 장내 미생물 구성에 어떻게 영향을 미치는지 평가하는 효율적인 절차를 설명합니다.

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여기서 우리는 상업용 육계 라인 인 Ross PM3의 알에서 세균이없는 병아리를 생성하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 다른 가금류 종으로부터 세균이없는 동물의 생성에 적합 할 수 있습니다.

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