Name: 단일 땅콩(Arachis spp.)의 아플라톡신 및 스틸베노이드 파이토알렉신의 비파괴 SPE-UPLC 기반 정량화 씨앗 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-19T14:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: 배우세요 땅콩 씨앗에서 아플라톡신과 스틸베노이드 파이토알렉신을 SPE-UPLC로 비파괴 정량화하는 방법입니다. 이 기술은 Aspergillus에 내성이 있는 야생 Arachis 종을 선별하여 땅콩 품종 개량에 활용합니다.

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이 작업은 USDA-ARS CRIS 프로젝트 6044-42000-011-00D 및 CRIS 프로젝트 6044-21000-005-000-D의 재정 지원을 받았습니다. 미니칼럼 고정 랙을 만들어 준 Dan Todd에게 감사드립니다. 이 문서에서 상표명 또는 상업용 제품에 대한 언급은 특정 정보를 제공하기 위한 목적으로만 사용되며 미국 농무부(US Department of Agriculture)의 권장 또는 보증을 의미하지 않습니다.

1. 곰팡이 도전을 위한 씨앗 준비
<ol><li>아플라톡시겐 Aspergillus flavus NRRL 3357을 Potato Dextrose Agar (PDA)의 경사면에 30 ° C에서 6 일 동안 시험관에 배양합니다. Tween 20(증류수 1L에 Tween 100μL)을 사용하여 물 10mL로 시험관에서 곰팡이 포자를 채취하고 깔때기에 놓인 유리솜을 통해 여과한 다음 사용 설명서를 참조하여 혈구계로 포자를 계산합니다.</li>
	<li>포자 현탁액을 멸균수로 1,000 포자/μL 농도로 희석합니다. 혈구계로 농도를 확인합니다. 알림: 도전적인 실험 2시간 전에 포자 현탁액을 준비하십시오.</li>
	<li>땅콩 꼬투리를 부드럽게 깨고 껍질을 제거합니다. 씨앗의 부피가 비커 부피의 1/5을 초과하지 않도록 씨앗을 멸균 비커에 넣고 비커 부피의 약 70%에 0.05% 과산화수소 용액을 첨가한 다음 씨앗이 3시간 동안 물을 흡수하도록 합니다.</li>
	<li>씨앗에서 과산화수소 용액을 디캔팅하고 3% 에탄올-물 혼합물(v/v)의 약 80배를 비커에 추가하여 씨앗을 덮습니다. 1분 동안 그대로 둔 다음 동일한 양의 멸균 증류수로 씨앗을 2번 헹굽니다.</li>
	<li>에탄올로 멸균된 씨앗과 함께 비커에 3% 과산화수소를 5배 부피로 넣고 5분 동안 그대로 둔 다음 액체를 디캔팅하고 동일한 양의 멸균수로 씨앗을 두 번 헹굽니다(그림 2A).</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66574/66574fig2.jpg"> 그림 2: 아플라톡신 및 식물성 알렉신 분획의 접종, 배양 및 추출을 위한 땅콩 종자의 준비. (A) 3% 과산화수소로 흡수된 씨앗을 살균하는 단계; (B) 종자에서 고환(피부)을 제거하는 단계; (C) 배아축부를 절단하는 단계; 드릴 비트가 있는 반 자엽의 시추 캐비티; (F) 씨앗의 뚫린 부분을 한천에 놓는 단계; (G) 천공된 캐비티에 곰팡이 포자를 적용하는 단계. (H) 부화 후 씨앗이있는 페트리 접시; (I) 배양된 단일 종자(대조군 샘플의 사진)를 강화된 비드 튜브에 넣는 단계; (J) 측정된 양의 추출 용매를 첨가하는 단계; (K) 비드 파열기에서 샘플을 분쇄하는 단계; (L) 분쇄 슬러리의 원심 분리. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66574/66574fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<ol start="6"><li>멸균 종이 타월에 씨앗을 놓고 집게로 씨앗 고환을 제거한 다음 메스로 배아 축을 포함하는 씨앗의 약 1/3을 자릅니다(그림 2B, C).</li>
	<li>씨앗의 이 부분을 버리거나 성장 배지가 있는 시험관에서 식물을 키우는 데 사용하십시오(그림 1B,E).</li>
	<li>씨앗의 나머지 부분을 두 개의 자엽으로 나누어 페트리 접시에 넣고 씨앗 부분을 축축한 멸균 여과지로 덮고 탈수를 방지하기 위해 뚜껑을 교체하고 즉시 접종 단계를 진행합니다.</li>
	<li>도전적인 실험을 수행하기 전에 1.5% 멸균 한천 26mL를 물에 넣어 100 x 15mm 접시에 붓고 밤새 응고되도록 종자 배양 배지로 충분한 수의 페트리 접시를 준비합니다.</li>
	<li>남아 있는 각 자엽의 바깥쪽 중앙에 1.5-2mm 직경의 멸균 날카로운 드릴 비트로 씨앗을 수동으로 뚫어 2-2mm 깊이의 구멍을 만듭니다. 캐비티를 만드는 데 ~2-5초가 걸립니다(그림 2D,E).</li>
	<li>씨앗의 4-6 개의 "드릴"조각을 한천이있는 페트리 접시에 넣고 1,000 포자 / μL 현탁액 중 2 μL를 10 μL 피펫터로 각 반 자엽 조각의 드릴 구멍에 적용합니다. 포자 현탁액 대신 멸균수를 대조군 종자에 적용합니다(그림 2F,G).</li>
	<li>모든 페트리 접시를 뚜껑으로 덮고 빛 없이 30°C에서 72시간 동안 배양합니다.</li>
</ol>2. 아플라톡신 및 식물성 알렉신 분석을위한 배양 종자 조각의 샘플링 및 준비
<ol><li>집게로 한천에서 씨앗 조각을 제거하고 각각을 13개의 지르코늄 세라믹 비드(직경 2.8mm 12개 및 직경 6.5mm 1개)가 있는 라벨이 부착된 7mL 비드 바이알에 넣어 72시간 내에 종자 조각을 수집합니다(그림 2H,I). 참고: 이 시점에서 즉시 처리하지 않으면 바이알을 -80°C 냉동고에 넣고 추가 처리 전에 최대 2개월 동안 보관할 수 있습니다.</li>
	<li>Phytoalexins와 아플라톡신은 동일한 종자 추출물에서 결정됩니다. 추출을 위해 시각적 종자 크기(소형, 중형 또는 대형)에 따라 정밀하게 측정된 메탄올-물 혼합물(90:10, v/v) 2 또는 4mL를 비드 바이알에 추가하고 45초 동안 5.5m/sec로 분쇄합니다. 분쇄된 씨앗이 있는 바이알을 원심분리기에 넣고 1,860× g 의 원심분리기에 3분 동안 넣습니다(그림 2J - L). 참고: 레스베라트롤, 아라키딘-1, 아라키딘-2, 아라키딘-3, 3′-이소펜타디에닐-3,5,4′-트리하이드록시스틸벤(IPD) 및 SB-1과 같은 중요한17,22 스틸베노이드 유도체가 측정됩니다(모두 트랜스 구성).</li>
	<li>아플라톡신 분석의 경우 도전적인 실험을 실행하기 전에 다음과 같이 충분한 수의 클린업 컬럼을 준비합니다. 90o 각도로 절단된 유리 막대를 사용하여 일치하는 폴리에틸렌 다공성(20μL) 프릿을 1.5mL 폴리프로필렌 기둥에 넣습니다. 마그네슘 실리카겔 50mg(100-200 메쉬)을 맞춤형 스쿱으로 컬럼에 넣고 유리 막대로 밀어 동일한 프릿으로 컬럼을 캡을 씌웁니다(그림 3A - E). 참고: 이 양의 마그네슘 실리카겔은 75μL의 부피를 차지하며 흡착층의 높이는 3mm입니다.</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66574/66574fig3.jpg"> 그림 3: 클린업 컬럼 및 필터 준비. (A,B) 다공성 프릿을 배럴에 넣는 단계; (C, D) 마그네슘 실리카겔로 배럴을 채우는 것; (E) 흡착제를 포장하고 상부 다공성 프릿을 배럴에 삽입하는 단계. (F) 파스퇴르 피펫 위에 직경 11.5mm 유리 섬유 원을 놓습니다. (지,H) 플라스틱 또는 나무 막대로 원의 중심을 파스퇴르 피펫 배럴의 바닥까지 밀어 넣고 유리 섬유를 단단히 압축합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66574/66574fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<ol start="4"><li>이 시점에서 그림 3F - H와 같이 일치하는 수의 맞춤형 필터를 준비합니다.</li>
	<li>아플라톡신 분석의 경우 상층액의 최대 0.5mL 분취액(2.2단계에서 설명한 대로 얻음)을 정밀하게 측정하고 이를 맞춤형 포장 미니컬럼으로 옮기고 추출물이 중력에 의해 4mL 유리 바이알로 배출되도록 합니다. 1.0mL의 메탄올-물(90:10, v/v) 혼합물을 컬럼으로 옮겨 중력에 의해 불순물을 씻어내고 동일한 4mL 바이알에 넣습니다(그림 4A).</li>
</ol><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66574/66574fig4.jpg"> 그림 4: 종자 추출물의 정제 및 UPLC 분석을 위한 준비. (A) 채워진 컬럼이 있는 랙. (B) 세척 컬럼에서 용출된 정제된 추출물과 함께 6개의 4mL 바이알에서N2 가스로 증발하는 용매. (C) 4mL 바이알에 주입 용매(MeOH-H2O 9:1, v/v)를 첨가하기 전과 후에 얼음과 함께 거품 용기(1 및 2)에 바이알과 필터를 영하의 온도로 가져옵니다. (D) 4mL 바이알에서 400μL 자동시료주입기 바이알로 냉각된 추출물을 여과합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66574/66574fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<ol start="6"><li>결합된 엘루에이트는 버립니다. 1.2mL 아세톤-아세토니트릴-물-88% 포름산(65:31:3.5:0.5, v/v) 혼합물이 있는 깨끗한 4mL 유리 바이알에 중력에 의해 아플라톡신 분획을 용리합니다(그림 4A).</li>
	<li>또는 2.0mL의 아세토 니트릴 - 물 -88 % 포름산 (96 : 3.5 : 0.5, v / v) 혼합물로 컬럼에서 아플라톡신을 용출하고 최대 2 μL의 용리액의 부분 표본을 초고성능 액체 크로마토 그래피 (UPLC) 시스템에 직접 주입합니다 (N2 로 용매를 증발시키지 않음). 참고 :이 경우 아플라톡신에 대한 정량 한계가 최대 10 배 낮을 것으로 예상됩니다. 대부분의 경우에서 도전적인 종자의 아플라톡신 농도가 종종 높기 때문에 감도의 이러한 하락이 허용됩니다.</li>
	<li>45°C에서 가열된 블록에서N2 의 흐름으로 바이알로부터 용매를 제거한다. 바이알의 뚜껑을 닫고 다음 단계에서 추가되는 용매의 증발을 최소화하기 위해 30-45초 동안 분쇄된 얼음이 담긴 용기에 넣습니다. 맞춤형 필터를 일회용 시험관에 넣고 튜브를 다른 용기의 얼음에 삽입하여 여과 시 용매의 증발을 최소화합니다(그림 4B, C).</li>
	<li>용매를 증발시킨 후 건조 잔류물을 정밀하게 측정된 0.25-1.0mL의 메탄올-물 혼합물(90:10, v/v)에 용해시키고 1-2초 동안 소용돌이에 넣습니다. 정제된 추출물이 담긴 바이알을 UPLC 자동시료주입기에 넣고 0.1 - 3.0 μL를 UPLC 시스템에 주입합니다(그림 5A,B). 알림: 와류 후 용액에 일부 부유 입자가 있는 것으로 의심되는 경우 냉각된 필터를 통해 용액을 여과합니다(그림 4D).</li>
</ol><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66574/66574fig5.jpg"> 그림 5: 정제된 추출물의 UPLC 분석 과정 및 결과. (A) 정제된 시료 추출물이 있는 랙을 UPLC 자동 시료 주입기에 넣습니다. (B) 기기 분석 수행, 데이터 수집 및 결과 해석. (C) 4 가지 주요 아플라톡신의 UPLC; 관심있는 주요 피크, 아플라톡신 B1 및 B2 는 각각 0.04 및 0.004 ng를 나타냅니다. (D) 아플라톡신 B1 및 B2의 UPLC; 피크 2는 2pg 수준(8μL 플로우 셀 포함)에서 아플라톡신 B1 을 나타냅니다. (E) 야생 아라키스 종의 현지 땅콩 밭에서 수확한 종자의 정제된 추출물의 UPLC. (F) 염기성 산화알루미늄 미니컬럼으로 정제한 도전적인 땅콩 종자 추출물의 UPLC. (G) Florisil 컬럼으로 정제된 도전받은 땅콩 종자 추출물의 UPLC; 블루 크로마토그램은 1mL의 메탄올-물(90:10 V/V) 혼합물로 컬럼에서 세척된 불순물을 표시합니다. 검은 색 크로마토 그램은 아플라톡신 M1 및 B1의 피크를 보여줍니다. 아플라톡신 B1 의 수준은 48 ng / g입니다. (H) 도전적인 종자에서 땅콩 스틸베노이드의 전형적인 크로마토그램; 약어: IPD = 3′-이소펜타디에닐-3,5,4′-트리하이드록시스틸벤. 참고: 종자 추출물의 모든 스틸베노이드는 트랜스 구성입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66574/66574fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 
<ol start="10"><li>파이토알렉신 분석을 위해 각 비드 바이알에서 200μL의 상층액을 위의 파스퇴르 피펫 필터로 옮깁니다. 압축 질소 탱크의 N2 가스를 사용하여 400 μL UPLC 자동 시료 주입기 바이알로 여과를 촉진하고 PTFE 격막이 있는 일치하는 캡으로 바이알을 캡합니다(그림 4D).</li>
</ol>3. 아플라톡신 분석
<ol><li>종자 추출물에서 아플라톡신의 분리를 위해, 자동 시료 주입기, 4 차 펌프, 형광 검출기, UPLC BEH C18 3.0 mm x 100 mm, 일치하는 precolumn이있는 1.7 μm 컬럼 및 원래 길이의 25 %로 절단 된 표준 니트 PTFE 코일 0.25 내경이있는 포스트 컬럼 광화학 반응기 (PHRED)가 장착 된 UPLC 시스템을 사용하십시오. 참고: 저자가 사용하는 UPLC 기기 및 관련 장비는 재료 표에 나열되어 있습니다.</li>
	<li>물 (A), 메탄올 (B) 및 아세토 니트릴 (C)을 다음 그래디언트에서 사용하십시오 : 초기 조건, 62.7 % A, 24 % B, 13.3 % C, 3.75 분 내에 30 % A, 45 % B, 25 % C로 선형 변경, 3.751 분 동안 0 % A, 64.4 % B, 35.6 % C로 변경, 3.249 분 동안 등용매를 유지 한 다음 0.01 분 내에 초기 조건으로 변경하고 다음 주입 전에 2.499 분 동안 등용매를 유지했습니다. 유속을 0.45mL/분으로 설정하고 실행 시간을 9.5분으로 설정합니다. 시스템 컬럼 히터에서 컬럼을 40°C로 유지합니다. 362 nm와 440 nm를 여기 및 방출 파장으로 각각 아플라톡신 B1, B2, G1, G2 및 M1 정량화에 사용하십시오. 주요 아플라톡신의 구조는 그림 6A에 나와 있습니다. 참고 : 실험 조건에서, 아플라톡신 B1 및 B2 만 A. flavus NRRL 3357에 의해 생성 될 것으로 예상됩니다. A. parasiticus 균주가 종자 도전에 사용되는 경우, 아플라톡신 B1, B2, G1 및 G2 의 생산이 예상됩니다.</li>
	<li>소프트웨어 사용자 설명서에 설명 된대로 해당 정품 표준 (교정 곡선)의 피크 영역을 참조하여 아플라톡신의 농도를 결정하십시오. 참고 : UPLC 절차는 형광 검출기의 고감도 설정에서 기준선 노이즈를 나타내기 때문에 아플라톡신에 대한 검출 한계 (LOD) 및 정량 한계 (LOQ)는 LOD의 경우 3 : 1, LOQ의 경우 10 : 1의 널리 사용되는 신호 대 잡음 비율을 사용하여 평가됩니다. 섹션 2 및 3에 설명 된 땅콩 종자 분석을위한 일상적인 실험 설정에서 아플라톡신 G1 및 B1 에 대한 정량 한계는 아플라톡신 G2 및 B2 에 대해 각각 0.8 및 0.08 ng / g보다 작거나 같을 것으로 예상됩니다.</li>
</ol>4. 스틸베노이드 파이토알렉신 분석
<ol><li>스틸베노이드를 분리하기 위해 물(A), 메탄올(B) 및 88% 포름산(C)을 다음 그래디언트에서 사용하십시오: 초기 조건, 53% A, 42% B, 5% C, 2.0분 내에 35% A, 60% B, 5% C로 선형 변경, 4분 동안 등용매 유지, 0.5분 동안 0% A, 95% B, 5% C로 변경, 2.5분 동안 등용매 유지, 그런 다음 0.1 분 내에 초기 조건으로 변경하고 다음 주입 전에 2.9 분 동안 등용매를 유지했습니다. 유속을 0.5mL/분으로 설정하고 실행 시간을 12.0분으로 설정합니다.</li>
	<li>소프트웨어 사용자 설명서에 설명된 대로 해당 실제 표준물질(보정 곡선)의 피크 면적 및/또는 게시된 몰 소멸 계수를 참조하여 스틸베노이드의 농도를 결정합니다. 주요 스틸벤 유래 피토알렉신의 구조는 그림 6B에 나와 있습니다. 참고: 파이토알렉신의 분리는 동일한 시스템을 사용하여 이루어지지만 형광 검출기와 PHRED 반응기 없이 이루어집니다. 대신, 다이오드 어레이 검출기는 땅콩 스틸베노이드의 검출 및 정량화에 사용됩니다. 주요 스틸베노이드 파이토알렉신에 대한 정량 한계(LOQ)는 스틸베노이드 농도가 동일한 추출물에서 아플라톡신의 농도를 몇 자릿수만큼 초과하기 때문에 실질적인 의미가 없습니다. 배양 3일 후, 스틸베노이드는 신뢰성 있게 정량화됩니다.</li>
</ol>

아플라톡신 축적에 대한 저항성을 위한 야생 땅콩 종의 평가

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저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

이전의 경험28을 바탕으로, 우리는 아스페르길루스에 내성이 있는 종을 식별하고 이 기회주의적 곰팡이에 대한 유전적 저항성의 새로운 원천을 결정하고 특성화하기 위해 야생 아라키스 생식질 수집을 탐색하는 데 적합한 간단하고 저렴하며 환경 친화적인 화학 절차를 개발했습니다. 이 방법은 고체상 추출(SPE) 기술에 의한 종자 추출물 정제와 초고성능 액체 크로마토그래피(UPLC)에 의한 아플라톡신 정량을 기반으로 하며 충분히 높은 회수율, 정밀도 및 정확도가 특징입니다. 제안된 "Florisil" 방법은 아플라톡신을 강력하고 선택적으로 유지하기 위해 Florisil(마그네슘 실리카겔)의 고유한 특성을 기반으로 하는 단일 미니컬럼 세척 절차의 수정입니다(28). 원래 방법에서와 같이 종자 샘플은 MeOH-H2O 혼합물로 추출되었지만 발표 된 80 : 20 (v / v)과 비교하여 90 : 10 (v / v)의 다른 비율로 추출되었습니다. 이 변화는 동일한 아플라톡신 회수율로 클린업 컬럼을 통한 용매의 유속을 최대 2.5 배까지 증가시켰다. 이 90 : 10 (v / v) 메탄올 - 물 혼합물은 아플라톡신 B1, B2, G1 및 G2 표준물질의 거의 100 % 회수를 제공했으며, 기판 1g에서 아플라톡신 농도의 5-50 ng에 해당하는 스파이크 수준에서 용매를 추출하는 데 추가되었으며, 스파이크 된 땅콩 종자 샘플에서 충분히 높은 회수율을 제공했습니다 (표 1).
아플라톡신은 아세톤30, 아세톤-메탄올31,32 및 아세톤-물 혼합물 33,34,35,36의 대량으로만 Florisil 흡착제에서 용출 될 수 있음이 밝혀졌습니다. 현재 연구 과정에서, 우리는 산성화 된 아세토 니트릴이 Florisil에서 아플라톡신을 용출하는 능력에서 아세톤과 유사하게 행동한다는 것을 발견했습니다. 우리가 아는 한, 아세토니트릴의 이러한 특성은 문헌에 보고되지 않았습니다. 이 특성이 발견됨에 따라 용매 증발 단계를 생략하고 정제된 추출물을 UPLC 시스템에 직접 주입할 수 있어 준비 시간이 크게 단축됩니다. 아세토니트릴을 아세톤(아세톤-아세토니트릴-물-88% 포름산(65:31:3.5:0.5, v/v))과 혼합한 경우에도 정제된 용리액에서 물을 부드럽고 완전하며 빠르게 제거하여 용매 증발 시간을 크게 단축했습니다. 아세토니트릴의 존재로 인해 단일 용매인 메탄올-물(90:10, v/v) 혼합물을 사용하여 메탄올 및 클로로포름-메탄올 혼합물의 두 가지 추가 세척 용매가 필요한 게시된 방법과 비교하여 Florisil 컬럼에서 불순물을 효과적으로 제거할 수 있었습니다. 28의
평균적으로, 아플라톡신 B1 표준 회수율은 아플라톡신의 용출을 위해 1.2 mL를 사용할 때 ~ 98 %이었다. 50mg의 Florisil 함량은 1.2mL의 용출 용매가 미니 컬럼을 배럴 상단까지 채우는 동시에 만족스러운 회수율을 제공하도록 선택되었습니다(표 1). 이 접근 방식은 컬럼 배럴을 한 번만 채우면 되므로 정리 절차를 가속화합니다. 이 프로젝트의 초기 단계에서는 입자 크기가 상대적으로 큰 100-200 메쉬의 상업용 Florisil 분획이 흡착제의 3mm 층만 있는 작은 컬럼에 적합한지 여부가 명확하지 않았습니다. 따라서 우리는 미국 표준 테스트 체 120-140, 140-170, 170-200, 200-270, 270-400 및 >400 메쉬를 사용하여 상용 100-200 메쉬 제품에서 얻은 다양한 Florisil 분획을 탐색했습니다. 이러한 모든 분획은 재현 가능하고 만족스러운 회수율과 거의 일치하는 결과를 제공했습니다. 더 작은 입자 크기 분획은 UV 빛의 밑에 란에 있는 더 좁은 아플라톡신 밴드를 보여주었지만, 그 분획은 상업적인 100-200 메시 제품에 어떤 면에서도 우량하지 않았다. 또한 100-200 메시 분획은 전체 절차에서 가장 짧은 용리 시간(8-12분)을 보여주었습니다.
그래디언트 UPLC 용매 전달은 아플라톡신의 만족스러운 분리뿐만 아니라 컬럼에서 비극성 불순물을 완전히 제거할 수 있게 했습니다(그림 5G). 이 접근 방식은 완벽한 컬럼 작동과 수백 개의 샘플 분석에서 재현 가능한 결과를 이끌어 냈습니다. Florisil 컬럼에서 용출 된 아플라톡신의 정체는 앞서 설명한 바와 같이 확인되었다. 28 여기에 사용 된 3mm 직경의 분석용 UPLC 컬럼은 동일한 화학 물질의 2.1mm 직경 컬럼에 비해 더 높은 농도에서 아플라톡신 B1, B2, G1 및 G2 의 더 높은 선택성과 더 안정적인 분리를 보여주었습니다. 또한 3mm 컬럼의 수명(1,200회 주입 이상)은 2.1mm 컬럼(최대 800회 주입)보다 훨씬 높았습니다. 3mm 컬럼은 더 높은 이동상 속도(40% 이상)가 필요했지만, 이러한 단점은 위의 컬럼의 장점보다 성능이 뛰어났습니다.
Florisil 미니컬럼은 Aspergillus 대사산물로 심하게 오염된 땅콩 종자 추출물의 정제에 효과적이었습니다(그림 5G). 이러한 씨앗에는 또한 곰팡이 침입에 대한 반응으로 씨앗에 의해 생성 된 높은 수준의 스틸베노이드 식물 알렉신이 포함되어 있습니다. 이러한 모든 불순물은 최대 106 배22까지 씨앗의 아플라톡신 농도를 초과 할 수 있으며, 이는 이러한 씨앗을 아플라톡신 분석을위한 도전적인 물체로 만듭니다. 그림 5G 는 아플라톡신 머무름 시간 내에 크로마토 그램에서 간섭 피크가 없음을 보여주며, 이는 테스트 된 모든 수준에서 아플라톡신 검출 및 정량화를 손상시키지 않았습니다 (표 1). 표 1에서 볼 수 있듯이, 방법의 정확도와 정밀도는 1.0-50.0 ng / g의 테스트 범위 내에서 충분히 높았으며, 이는 아플라톡신 검출을위한 가장 중요한 범위이기도합니다. 다양한 야생 땅콩 유전자형에 대한 다양한 수준의 회수율은 균일했으며 5가지 다른 추출에 대한 표준 편차는 본질적으로 낮았습니다.
이 방법은 또한 땅콩, 면화, 옥수수 및 쌀 종자에 대해 테스트되었으며, 총 아플라톡신의 10,000 ng / g 이상에서 0에서 매우 높은 수준으로 자연적으로 오염되었습니다. 옥수수, 목화씨 및 쌀에서 아플라톡신 B1, B2, G1 및 G2 의 회수율은 5 ng / g 수준에서 각각 76.1 %에서 93.7 %, 77.1 %에서 86.6 %, 90.5 %에서 96.2 %까지 다양했습니다. 쌀에서 아플라톡신의 가장 높은 회수율은 용리액의 "순도", 즉 사실상 불순물의 부족을 동반했습니다. 또한, 쌀은 평균 19mg/종자를 테스트한 가장 작은 단일 대상을 나타냈습니다.
Florisil 컬럼을 사용한 단일 땅콩 종자에 대한 총 준비 시간(껍질 벗기기, 계량, 추출, 원심분리 및 정제 포함)은 20분을 초과하지 않았습니다. Florisil 미니컬럼의 비용은 상업용 클린업 컬럼보다 >10배 저렴합니다. 추가적인 절감은 발표된 절차28에 비해 더 적은 양의 흡착제, 용매 및 질소 가스를 사용함으로써 파생됩니다. 미니컬럼은 작동하는 데 펌핑 또는 진공 장치가 필요하지 않으며 보관 수명이 무제한입니다.
아플라톡신에 대한 저항성을 위해 식물 생식질을 탐색하는 것은 마이코톡신 축적이 정규 분포를 따르지 않기 때문에 매우 어렵습니다37,38; 이 현상을 극복하기 위해 단일 종자에서 많은 수의 아플라톡신 분석이 필요합니다. 아플라톡신 함량 외에도 정량적 식물성 알렉신 조성에 대한 정보는 단일 종자 (그림 1A)에서 얻을 수 있고 특정 식물 (그림 1E)로 추적 할 수있는 많은 정보에 비추어 매우 가치가 있습니다. 이 방법은 재래종, 고급 육종 계통 및 엘리트 땅콩 품종을 포함한 수백 개의 가입을 선별하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 이 방법은 땅콩 사전 육종 및 육종 연구 프로그램에 사용하기 위해 제안되며 곰팡이 저항성에 대한 땅콩 유전자의 특성화에 도움이 될 수 있습니다.

땅콩(Arachis hypogaea L.)은 세계의 주요 식량 작물 중 하나입니다. 100개국 이상에서 재배되고 있으며 총 생산량은 4,500만 톤을 초과합니다1. 땅콩, 옥수수, 목화씨와 같은 농산물은 종종 아플라톡신을 생산하는 토양 태생 곰팡이인 아스페르길루스(Aspergillus) 종에 의해 침입받는다2. 이러한 상품은 환경 조건이 고온과 가뭄으로 특징 지어질 때 수확 전 아플라톡신 오염에 특히 취약합니다. 아플라톡신은 알려진 가장 강력한 발암 물질 중 하나입니다3. 그들은 전 세계 농산물의 4분의 1을 오염시키며4 세계 인구의 약 절반이 아플라톡신에 만성적으로 노출되고 있다5. 그들의 높은 발암성 및 독성 때문에, 음식에 있는 아플라톡신의 존재는 세계의 대부분의 국가에서 가장 낮게 실질적으로 수락가능한 한계에 통제된다6.
유럽 연합 (EU)은 아플라톡신 B1의 경우 최대 2ng / g, 총 아플라톡신 (B1, B2, G1 및 G2)의 경우 최대 수준을 법제화했습니다7. 이러한 낮은 한도는 아플라톡신으로 오염된 상품을 가공하는 농업과 식품 산업에 상당한 압력을 가합니다. 오염 된 땅콩의 아플라톡신 모니터링 및 재 처리는 아플라톡신이 먹이 사슬에 들어가는 것을 방지하기 위해 수동적이고 비용이 많이 드는 전략으로 간주 될 수 있습니다. 그런 이유로 땅콩 공업의 모든 중요한 부분은 수시로 진균성 질병에 한정된 저항을 보여주는 현재 땅콩 품종의 아플라톡신 오염 때문에 거창한 이윤 손실을 경험합니다. 아플라톡신 문제를 해결하기 위한 전향적 인 접근법은 유전자 내성, 즉 저항성 야생 땅콩 종에서 엘리트 품종으로의 유전 정보 전달을 통해 곰팡이 저항성 땅콩 품종을 얻는 것입니다. 최근 몇 년 동안(8,9), 야생 땅콩 종은 재배된 땅콩의 좁은 유전적 기반이 더 이상 땅콩 식물(10,11)에 필요한 수준의 저항성 특성을 제공할 수 없기 때문에 유전병 저항성의 원인으로 상당한 고려를 받았습니다. 야생 땅콩 종으로부터의 성공적인 침입을 위해서는 수천 개의 작고 희소한 단일 종자에 대한 분석이 필요하다(그림 1A) 12.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66574/66574fig1.jpg"> 그림 1: 단일 종자 분석 순서도. (A) 다양한 시장형 땅콩 품종과 야생 아라키스 품종의 크기 비교. (1) 버지니아; (2) 주자; (3) 스페인어; (4) 야생 아라키스 종. (B) 야생 아라키스 종(플레이트 A, 종자 4)은 세 부분으로 절단, (5) 배아 축이 있는 절반 종자; 씨앗의 이 부분은 식물(E)을 키우는 데 사용됩니다. (C) 부품 (6) 및 (7)은 드릴 비트로 뚫고 (D) 곰팡이 포자를 접종합니다. 30 ° C에서 72 시간 동안 배양 한 후 종자 부분 중 하나 인 (6) 또는 (7)은 아플라톡신 및 식물 알렉신 분석에 사용되고 다른 하나는 RNA / 전사체 시퀀싱에 사용됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66574/66574fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
곰팡이 병원균에 대한 땅콩 저항성은 식물성 알렉신 13,14,15,16,17과 밀접한 관련이 있습니다. 땅콩 파이토알렉신은 외인성 자극, 특히 곰팡이 침입에 노출된 후 식물 조직에 생합성되고 축적되는 항균성 스틸베노이드로 대표됩니다 16,17,18. 곰팡이 침입 부위에 충분한 농도의 파이토알렉신이 빠르게 축적되는 것은 곰팡이 성장을 억제하며 식물 방어에 중요합니다 19,20,21. 병원체는 phytoalexins가 억제 농도16,22로 축적되면 성장을 멈춥니다. 땅콩의 아플라톡시겐 균류에 대한 방어 화합물로서의 스틸베노이드의 역할은 현장 실험13에서 30년 전에 평가되었습니다. 이러한 실험은 땅콩 스틸베노이드가 수확 전 아플라톡신 오염에서 중요한 저항 요소라는 가설을 명확하게 뒷받침했습니다. 이러한 증거는 스틸벤이 현장에서 손상된 땅콩에서 자연적으로 생성된다는 사실에 근거합니다. 스틸벤은 아플라톡시겐 균류에 대해 상당한 생물학적 활성을 보여줍니다. 그리고 씨앗의 아플라톡신 오염은 땅콩이 가뭄으로 인한 종자 탈수로 인해 식물성 알렉신 합성 능력을 잃었을 때만 감지되었습니다. 또 다른 현장 실험에서는 식물성 알렉신 생산과 농업적으로 중요한 땅콩 질병에 대한 땅콩 유전자형 저항성 사이의 연관성을 확인했다17.
곰팡이 침입에 대한 땅콩 저항성의 자연적인 phytoalexin 기반 메커니즘에 대한 더 나은 이해는 아플라톡신 오염15,17의 통제를위한 유망한 전략입니다.따라서, 아플라톡신 분석 외에도, phytoalexins에 대해 동일한 씨앗을 정량적으로 분석하는 것이 중요합니다. 이러한 저항성 메커니즘은 완전히 연구되고 이해되지 않았지만, 새로운 곰팡이 저항성 품종을 위해 땅콩 식물을 육종하고 유전자 변형하는 데 매우 중요하다23. 다른 상품에서 아플라톡신 결정을위한 다양한 분석 절차가 존재함에도 불구하고, 특히 전통적인 방법이 분석 및 비용 효율적인 요구 사항을 충족시키지 못하는 경우 특정 연구를위한 간단한 방법에 대한 필요성이 여전히 있습니다. 땅콩 산업, 농업 및 개인 실험실에서 사용하는 대부분의 최신 청소 방법은 항체 기반24 및 면역 분석25,26,27 장치입니다. 이 제품은 선택적이고 민감하지만 일반적인 흡착제로 채워진 미니컬럼보다 훨씬 비쌉니다. 또한 이러한 방법 중 어느 것도 몇 밀리그램 무게의 샘플 분석을 위해 설계되지 않았습니다. 마그네슘 실리카겔(Florisil)로 충전된 미니컬럼28의 분석적 사용에 대한 이전 연구를 바탕으로, 당사는 현재 및 장래의 사전 육종 및 육종 프로그램의 요구에 맞게 이 절차를 수정했습니다.
이 작업의 목적은 단일 땅콩 종자에서 아플라톡신과 식물성 알렉신의 정량적 측정을 위한 비파괴, 중간 처리량, 환경 친화적인 방법을 개발하는 것이었습니다. 이러한 방법이 개발되어 왔습니다. 발표 된 방법에 비해 장점은 더 높은 감도, 단일 종자 추출물에서 아플라톡신 및 피토 알렉신을 분석 할 수있는 능력, 샘플을 계량 할 필요가 없으며 소모품의 부피가 작기 때문에 비용이 저렴하다는 것입니다. 적분법의 흐름도는 그림 1에 나와 있습니다. 유전자 분석 및 기타 단계는이 텍스트에 언급되어 있으며 제안 된 방법의 중요성과 전체 절차와 어떻게 통합되는지를 보여주기 위해 그림에 설명되어 있습니다.

<table><tbody><tr><td>아세톤, Optima</td><td>Fisher Scientific</td><td>A929-4</td><td></td></tr><tr><td>아세토니트릴, Optima</td><td>Fisher Scientific</td><td>A996-4</td><td></td></tr><tr><td>Acquity BEH C18 2.1 x 5mm Van-Guard 프리 컬럼</td><td>Waters Corporation</td><td>186003975</td><td></td></tr><tr><td>Acquity BEH C18 3 x 100mm 컬럼</td><td>Waters Corporation</td><td>186004661</td><td></td></tr><tr><td>Acquity BEH C18 2.1 x 100mm 컬럼</td><td>Waters Corporation</td><td></td><td></td>186002352</tr><tr><td>아플라톡신 B1, B2, G1 및 G2</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>A9441-1VL</td><td>5 &micro를 얻기 위해 5 mL의 메탄올에 상업용 바이알의 내용물을 용해; 아플라톡신 B1 및 G1 및 1.5 &마이크로를 위한 g/mL; B2 및 G2</td></tr><tr><td>아플라톡신 B1 (1mg)</td> <td>시그마 - 알드리치</td><td>A6636-1MG</td><td></td></tr><tr><td>아플라톡신 B2 (1mg)</td> <td>시그마 - 알드리치</td><td>A9887-1MG</td><td></td></tr><tr><td>아플라톡신 G1 (1mg)</td> <td>시그마 - 알드리치</td><td>A0138-1MG</td><td></td></tr><tr><td>아플라톡신 G2 (1mg)</td> <td>시그마 - 알드리치</td><td>A0263-1MG</td><td></td></tr><tr><td>아플라톡신 M1 (10 &마이크로; g)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CRM46319</td><td></td></tr><tr><td>Agar, 과립 (2kg)</td><td>Becton Dickinson</td><td>BD214510</td><td></td></tr><tr><td>알루미나 옥사이드 기본 (60-325 mesh)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A941-500</td><td></td></tr><tr><td>기초 매체</td><td>Murashige and Skoog</td><td>M5519</td><td></td></tr><tr><td>Bead Ruptor 24&nbsp;</td><td>Omni International</td><td>19-042E</td><td></td></tr><tr><td>비커(1000mL)</td><td>코닝(파이렉스)</td><td>10001L</td><td></td></tr><tr><td>비커(250mL)</td><td>코닝(파이렉스)</td><td>1000250</td><td></td></tr><tr><td>비커(400mL)</td><td>코닝(파이렉스)</td><td>1000400</td><td></td></tr><tr><td>비커(600mL)</td><td>코닝(파이렉스)</td><td>1000600</td><td></td></tr><tr><td>블레이드, 메스</td><td>깃털</td><td>#10</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 (LSE Compact)</td><td>코닝</td><td>모델: 6755</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기, 마이크로</td><td>코닝</td><td>모델: 6770</td><td></td></tr><tr><td>세라믹 비드 (2.8 mm)</td><td>Omni International</td><td>19-646</td><td></td></tr><tr><td>세라믹 비드 (6.5 mm)</td><td>Omni International</td><td>19-682</td><td></td></tr><tr><td>Chromeleon 7 시리즈 소프트웨어</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>드릴 비트</td><td>Kyocera</td><td>07896</td><td>1.6mm</td></tr><tr><td>드릴 비트</td><td>Kyocera</td><td>07357</td><td>2.0mm</td></tr><tr><td>드릴 비트</td><td>Kyocera</td><td>07985</td><td>2.34mm</td></tr><tr><td>에탄올(200프루프)</td><td>Decon Labs</td><td>2805M</td><td></td></tr><tr><td>증발기, 질소</td><td>조직 애니메이션</td><td>11106</td><td>6위치</td></tr><tr><td>Excel, Microsoft</td><td></td><td>Microsoft Office 365</td><td></td></tr><tr><td>여과지(#4)</td><td>Cytiva Whatman</td><td>1004-090</td><td></td></tr><tr><td>여과지 절단기, 스테인리스 스틸 (ID 11.5mm)</td><td>알 수 없음</td><td></td><td></td></tr><tr><td>여과지, 유리 섬유</td><td>Cytiva Whatman</td><td>934-AH</td><td></td></tr><tr><td>플라스크 (2800mL)</td><td>코닝 (파이렉스)</td> <td>44202XL</td><td></td></tr><tr><td>Florisil (100-200 mesh)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>F101-500</td><td></td></tr><tr><td>집게</td><td>Integra Lifescience ( Miltex)</td><td>PM-0300</td><td></td></tr><tr><td>포름산 (88%, ACS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A118P-500</td><td></td></tr><tr><td>냉동고 (-80oC)</td><td>Fisher Scientific</td><td>TSX70086D</td><td></td></tr><tr><td>퍼널 (15 x 80mm)</td><td>DWK Life Sciences (Kimax)</td><td>2902060</td><td></td></tr><tr><td>Gelzan (중간)</td><td>Caisson Labs&nbsp;</td><td>G024</td><td></td></tr><tr><td>유리 막대 (맞춤형)</td> <td>맞춤 제작</td><td></td><td></td></tr><tr><td>유리 울</td><td>Corning (Pyrex)</td><td>3950</td><td></td></tr><tr><td>핸들, 메스&nbsp;</td><td>Feather</td><td>#7</td><td></td></tr><tr><td>혈구계</td><td>Hausser Scientific</td><td>3100</td><td></td></tr><tr><td>과산화수소</td><td>Fisher Scientific</td><td>H325-4</td><td>30%, 인증 ACS</td></tr><tr><td>얼음 양동이, 뚜껑이 있는 원형</td><td>Corning</td><td>432122</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Percival</td><td>136VL</td><td></td></tr><tr><td>Kimtech SCIENCE 브랜드 Kimwipes</td><td>Kimtech</td><td>34120</td><td>8.2" x 4.39"</td></tr><tr><td>Kimtech SCIENCE 브랜드 Kimwipes</td><td>Kimtech</td><td>34256</td><td>16.4" x 14.43"</td></tr><tr><td>랩 코트</td><td>Cenmed</td><td>B113660SBXL</td><td></td></tr><tr><td>메탄올, Optima</td><td>Fisher Scientific</td><td>A454-4</td><td></td></tr><tr><td>미니 컬럼 랙(맞춤형)</td><td>맞춤형</td><td></td><td></td></tr><tr><td>믹서, 터치(맥시 믹스 II)</td><td>Thermolyne</td><td>37600(모델 231)</td><td></td></tr><tr><td>니트릴 장갑&nbsp;</td><td>Microflex</td><td>XC310M</td><td></td></tr><tr><td>질소 가스, 압축(초고순도)</td><td>Jones 용접</td><td></td><td></td></tr><tr><td>종이 타월</td><td>Georgia-Pacific</td><td>20023(D400)</td><td></td></tr><tr><td>pH 측정기</td><td>Fisher Scientific(Accumet)</td><td>13-636-AB15</td><td></td></tr><tr><td>pH/ATC 전극</td><td>Fisher Scientific(Accumet)</td><td>13-620-111</td><td></td></tr><tr><td>PhCR 광화학 반응기</td><td>Waters (Vicam)</td><td>600001222</td><td></td></tr><tr><td>피펫, 파스퇴르</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20D</td><td>9"</td></tr><tr><td>피펫터 (1 mL) (참고 2)</td><td>Eppendorf</td><td>4924000088</td><td></td></tr><tr><td>피펫터 (10 &mu; L) (참조)</td><td>Eppendorf</td><td>022470051D</td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁: 10 &mu; L, 200 &뮤; L, 1 mL</td><td>Eppendorf</td><td>F144054M</td><td></td></tr><tr><td>피펫터(200 &마이크로; L)(에르고핏)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-146-679</td><td></td></tr><tr><td>플레이트, 페트리 (100x15mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>감자 포도당 한천 (500g)</td><td>Becton Dickinson&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td>BD213400</tr><tr><td>강화 비드 튜브(2mL)</td><td>Omni International</td><td>19-660</td><td></td></tr><tr><td>강화 비드 튜브(7mL)</td><td>Omni International</td><td>19-651</td><td></td></tr><tr><td>리피펫터, 디스펜제트 III(10mL)</td><td>Brandtech</td><td>4701141</td><td></td></tr><tr><td>Resveratrol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R5010-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Scoop(맞춤형)</td><td>맞춤 제작</td><td></td><td></td></tr><tr><td>나사뚜껑 용기 (250 mL)&nbsp;</td><td>코닝 (Pyrex)</td><td>1395250</td><td></td></tr><tr><td>실리카겔, 구형(200-400 mesh)&nbsp;</td><td>Supelco</td><td>97727-U</td><td>100 g</td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-500</td><td></td></tr><tr><td>SPE 추출물 클린 1.5-mL 폴리프로필렌 컬럼&nbsp;</td><td>American Chromotography Supplies</td><td>SP-5122382</td><td></td></tr><tr><td>SPE 추출물 클린 PP 프릿 (1.5mL 미니 컬럼 용)</td><td>American Chromotography Supplies</td><td>SP-3119414</td><td></td></tr><tr><td>분광 광도계, UV 가시</td><td>광선 Fisher Scientific</td><td>14-385-351 (Genesys 50)</td><td></td></tr><tr><td>시험관</td><td>Corning (Pyrex)</td><td>982516X</td><td>16x125mm</td></tr><tr><td>시험관 (일회용) (16x125mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-961-31</td><td></td></tr><tr><td>시험관 (일회용)(150x250mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-961-34</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Vanquish DAD 검출기 (UPLC)</td><td>Thermo Scientific</td><td>VF-D11-A-01</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Vanquish Fluourescense 검출기 (UPLC)</td><td>Thermo Scientific</td><td>VF-D51-A</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Vanquish quaternary pump F (UPLC)</td><td>Thermo Scientific</td><td>VF-P20-A</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Vanquish Split Sampler FT (UPLC)</td><td>Thermo Scientific</td><td>VF-A10-A-02</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20 (폴리소르베이트 20) (효소 등급)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>바이알 캡(4mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C4015-75A</td><td></td></tr><tr><td>바이알 캡(자동시료주입기)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C4010-60A</td><td></td></tr><tr><td>바이알 및 캡(16 mL)</td><td>Thermo Scientific</td><td>B7800-4</td><td></td></tr><tr><td>바이알, 유리 (4mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C4015-1</td><td></td></tr><tr><td>바이알, 폴리프로필렌 (오토샘플러) (400mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C4010-11</td><td></td></tr><tr><td>물, Optima&nbsp;</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>W6-4</td><td></td></tr></tbody></table>

단일 땅콩(arachis spp.)의 아플라톡신 및 스틸베노이드 파이토알렉신의 비파괴 spe-uplc 기반 정량화 씨앗

Non-destructive SPE-UPLC-based Quantification of Aflatoxins and Stilbenoid Phytoalexins in Single Peanut (Arachis spp.) Seeds

아플라톡신은 일부 곰팡이 종, 특히 Aspergillus flavus의 발암성이 높은 2 차 대사 산물입니다. 아플라톡신은 종종 땅콩을 포함하여 경제적으로 중요한 농산물을 오염시켜 인간과 동물의 건강에 높은 위험을 초래합니다. 좁은 유전 적 기반으로 인해 땅콩 품종은 곰팡이 병원균에 대한 저항성이 제한적입니다. 따라서 아스페르길루스 에 대한 내성을 가진 수많은 야생 땅콩 종은 과학자들에 의해 질병 저항성의 원인으로 상당한 고려를 받았습니다.
아플라톡신에 대한 내성을 위해 식물 생식질을 탐구하는 것은 아플라톡신 축적이 정규 분포를 따르지 않기 때문에 어렵습니다., 이는 수천 개의 단일 땅콩 씨앗의 분석의 필요성을 지시합니다. 충분히 수분을 공급한 땅콩(Arachis spp.) 씨앗은 아스페르길루스 종에 감염될 때 방어적인 파이토알렉신으로 간주되는 생물학적으로 활성화된 스틸벤(스틸베노이드)을 생산할 수 있습니다. 땅콩 스틸벤은 곰팡이 발달과 아플라톡신 생성을 억제합니다. 따라서 아스페르길루스 침입에 대한 종자 저항성/감수성의 특성을 설명하기 위해 땅콩 스틸베노이드에 대한 동일한 종자를 분석하는 것이 중요합니다. 발표 된 방법 중 어느 것도 아플라톡신 및 / 또는 스틸벤 피토 알렉신에 대한 단일 종자 분석을 제공하지 않습니다.
우리는 환경 친화적이고, 저렴한 소모품을 사용하며, 민감하고 선택적인 방법에 대한 요구를 충족시키려고 노력했습니다. 또한 이 방법은 종자의 절반만 사용하고 배아 축을 포함하는 나머지 절반은 그대로 두기 때문에 비파괴적입니다. 이러한 기술은 아플라톡신 및 스틸베노이드 분석에 사용된 동일한 종자에서 땅콩 식물의 발아 및 성장을 완전히 성숙시킬 수 있습니다. 이 방법의 통합 부분인 Aspergillus로 씨앗을 수동으로 도전하는 것은 방법의 다른 단계에 비해 더 많은 시간과 노력이 필요한 제한 단계입니다. 이 방법은 아스페르길루스에 내성이 있는 종을 식별하고 이 곰팡이 병원체에 대한 유전적 내성의 새로운 원인을 결정하고 특성화하기 위해 야생 아라키스 생식질을 탐색하는 데 사용되었습니다.

종자에서 아플라톡신 정량 분석을위한 개발 된 방법은 아플라톡신 축적에 대한 저항성을 위해 야생 땅콩 종을 평가하는 전체 절차의 핵심입니다. 맞춤형 미니컬럼 및 필터는 대량의 용매, 비싸고 불필요한 0.22 또는 0.45 μm 상용 필터 및 펌핑 장치가 없기 때문에 상당한 비용 절감을 제공하고 전체 절차를 단순화합니다. 아플라톡신 분석 방법은 표 1에서 볼 수 있듯이 지상 종자에서 아플라톡신의 1.0-50.0 ng / g의 테스트 범위 내에서 높은 회수율, 정확도 및 정밀도를 제공합니다. 심하게 오염된 샘플을 선형 테스트 값으로 희석했습니다. 그림 5C 는 5 분 용출 시간 내에 4 가지 주요 아플라톡신, B1, B2, G1 및 G2 의 기준선 분리를 보여주며, 이는 땅콩 종자의 곰팡이 도전이 UPLC 분석이 아닌 절차의 제한 단계이기 때문에 허용됩니다.
제안 된 방법은 아플라톡신 B1 (그림 5D)에 대해 2 pg의 정량 한계로 충분히 민감합니다. 추출물의 높은 순수성은 사나운 Arachis 종을 가진 분야에서 수확된 씨의, 순화한 추출물의 UPLC (그림 5E)에서 보인 것과 같이 아플라톡신의 명확한 양화를 허용합니다. 이전에 발표된 미니컬럼 방법(29)은 제안된 방법(그림 5G)에 비해 곰팡이 문제가 있는 땅콩 종자(그림 5F)에 대해 만족스러운 순도를 달성할 수 없습니다. 그림 5F에서 아플라톡신 B2 , G1 및 G2 는 간섭 불순물의 고농도의 존재로 인해 신뢰성 있게 검출 및 정량화 할 수 없다는 것이 명백하며, 그 중 다수는 아플라톡신 후에 용출 된 스틸베노이드 식물 알렉신 및 곰팡이 대사 산물입니다. 대조적으로, 그림 5G는 아플라톡신 분획에서 불순물을 제거하는 마그네슘 실리카겔 컬럼의 높은 효율성을 보여줍니다. 블루 크로마토그램은 1mL의 메탄올-물(90:10) 혼합물로 컬럼에서 세척된 간섭 불순물을 표시합니다. 블랙 크로마토 그램은 아플라톡신 M1 및 B1 의 가려지지 않은 피크를 보여줍니다. 이 크로마토그램은 도전적인 야생종 종자의 추출물을 나타냅니다. 아플라톡신 B1의 수준은 48ng / g입니다.
땅콩 phytoalexins의 정량 분석은 동일한 종자에서 아플라톡신의 분석에 귀중한 추가이며, 이는 들판의 자연 종자 또는 곰팡이 도전 종자 일 수 있습니다. 그림 5H는 도전적인 종자에서 추출한 땅콩 방어 스틸베노이드의 전형적인 크로마토그램을 보여줍니다. 화합물의 분리는 아플라톡신 분석에 사용되는 것과 동일한 분석 컬럼을 사용하여 이루어집니다. 컬럼과 선택한 크로마토그래피 조건은 피크를 만족스럽게 분리하여 스틸베노이드의 신뢰할 수 있는 정량화를 가능하게 합니다. 도전적인 종자에서 아플라톡신-파이토알렉신 관계의 평가는 이 프레젠테이션의 범위를 벗어나며 이 방법은 몇 년 동안 저자의 실험실에서 사용되어 유용하다는 것이 입증된 잠재적인 연구 도구로 여기에서 제안됩니다.

<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66574/66574fig6.jpg"> 그림 6 : 주요 아플라톡신과 스틸벤 유래 땅콩 phytoalexins의 구조. (A) 주요 아플라톡신의 구조 : 1, B1; 2, 나2; 3, 지1; 4, 지2. (B) 주요 스틸벤 유래 땅콩 파이토알렉신의 구조: 6, 레스베라트롤; 7, 아라키딘-1; 8, 아라키딘-2; 9, 아라키딘-3; 10, IPD (3 ′- 이소 펜타 디에닐 -3,5,4 ′- 트리 히드 록시 스틸벤); 11, SB-1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66574/66574fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2">스파이크 레벨A (ng/g)</td>
			<td colspan="4">아플라톡신</td>
		</tr><tr><td>나1</td>
			<td>나2</td>
			<td>지1</td>
			<td>지2</td>
		</tr><tr><td>50</td>
			<td>85.87 (0.97)</td>
			<td>82.33 (0.67)</td>
			<td>86.63 (2.89)</td>
			<td>84.01 (0.86)</td>
		</tr><tr><td>5</td>
			<td>91.43 (2.76)</td>
			<td>87.32 (0.47)</td>
			<td>88.08 (2.08)</td>
			<td>87.73 (0.77)</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>81.21 (3.16)</td>
			<td>85.33 (1.98)</td>
			<td>81.76 (4.66)</td>
			<td>88.46 (3.24)</td>
		</tr></tbody></table>표 1 : Florisil 컬럼과 아플라톡신 분획 용출 혼합물 1.2mL를 사용하여 땅콩 종자에서 아플라톡신을 회수합니다. [평균(SD), %; n = 5]. 조지아 06G 땅콩 품종의 아플라톡신 무료 지상 샘플 (50g)은 50, 5 또는 1 ng / g 수준에서 아플라톡신 원액을 가진 마이크로 주사기의 도움으로 균등하게 스파이크 되었다, 그리고 16 시간 동안 실온에서 방치했다. 스파이크 수준은 아플라톡신 B1 및 G1에 대해 주어진다; 아플라톡신 B2 및 G2 의 경우 0.33의 곱셈 계수를 사용해야합니다.

우리는 초고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 단일 땅콩 종자에서 아플라톡신과 스틸베노이드 피토알렉신의 정량화를 위한 중간 처리량 방법을 보여줍니다. 이 방법은 aflatoxigenic Aspergillus 종에 의해 도전 된 야생 아라 키스 종의 분석을 위해 특별히 개발되었습니다.

단일 땅콩(Arachis spp.)의 아플라톡신 및 스틸베노이드 파이토알렉신의 비파괴 SPE-UPLC 기반 정량화 씨앗

Aflatoxins are highly carcinogenic secondary metabolites of some fungal species, particularly Aspergillus flavus. Aflatoxins often contaminate ...

연구 범위는 야생 아라키스 생식질의 탐사를 위해 수천 개의 땅콩 씨앗에서 아플라톡신 및 방어적 피토알렉신의 정량화 방법을 개발하고, 아스페르길루스에 내성이 있는 종을 식별하고, 이 곰팡이 병원체에 대한 유전적 저항성의 새로운 원천을 결정하고 특성화하는 것이었습니다. 우리 연구 그룹은 아플라톡신을 축적하지 않는 땅콩 생식질을 식별하는 가장 유망한 접근 방식은 전사체학, 유전체학, 식물 알렉신 및 마이코톡신 프로필을 포함하여 각 개별 종자에 대한 전체적인 분석을 수행하는 것임을 발견했습니다. 당사는 야생 및 재배 땅콩 종자 분석을 위한 프로토콜을 개발했으며, 이는 화학 프로파일링에 단일 종자의 1/4을 사용하고, 땅콩 종자 샘플에서 식물성 알렉신의 효과적인 종자 챌린지, 추출 및 정확한 정량화를 위한 고처리량 분석법을 개발하는 것을 의미합니다.우리는 수많은 땅콩 phytoalexins를 발견하고 아플라톡신 분석을 위한 효율적이고 저렴한 방법을 개발했으며, 아플라톡신 축적이 감소하거나 전혀 없는 땅콩 생식질을 선별하기 위해 개발했습니다. 이 방법에는 유전형 분석 및 종자 생존력 측정이 포함됩니다.

non-destructive-spe-uplc-based-quantification-aflatoxins-stilbenoid

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

종자 - 감염 곰팡이에 의한 시리얼 작물의 참화 더 나은 식물 병원체 상호 작용을 이해하기 위해 많은 연구 노력을하라는 메시지가있다. 실험실 환경에서 씨앗 - 곰팡이 상호 작용을 연구하기 위해, 우리는 곰팡이 복제, 바이오 매스, 그리고 커널 bioassays를 사용하여 진균 독소 오염의 부량위한 강력한 방법을 개발했다.

커널 Bioassays를 사용하여 곰팡이 콜로니, Sporogenesis 및 Mycotoxins 생산의 부량

우리는 균류 아스 퍼질러 flavus를 아플라톡신에 합성 유전자 사일런 위해 RNA 간섭 신호를 포함하는 땅콩 종자 아플라톡신 및 유전자 발현 분석을위한 방법을 보여준다. 식물에서 곰팡이 독소의 RNAi를 매개 제어는 이전에보고되지 않았습니다.

땅콩에서 아플라톡신의 RNAi를 매개 제어 : 방법은 땅콩에 곰팡이 독소 생산 및 형질 전환 유전자 발현을 분석 /<em&gt; 아스 페르 길 루스</em&gt; Pathosystem

여기 선물이 분석 Aspergillus flavus 성장과 아플 라 톡 신 생산 옥수수 커널에서 항진균 단백질을 표현 하는 프로토콜.  우리는 감염 및 실시간으로 성숙한 커널에 곰 팡이의 확산을 모니터링 GFP 표현 A. flavus 긴장을 사용 하 여. 분석 결과 신속 하 고 신뢰할 수 있는, 재현.

Aspergillus flavus 성장 및 유전자 변형 옥수수 표현 Lablab purpureus L.에서에서 α-아 밀라 아 제 억제제에서 아플 라 톡 신 생산의 억제

우리는 고순도 RNA 분리에 억제 효과가 있는 다량의 오일, 단백질 및 폴리페놀이 포함된 식물 종자에서 RNA를 분리하는 방법을 확립하는 데 성공했습니다. 우리의 방법은 종자에서 낮은 수준의 전사체를 가진 유전자의 발현을 모니터링하는 데 적합합니다.

양 사체 (Transcriptome) 분석에있는 사용을위한 씨앗에서 매우 정제 된 RNA의 분리를위한 효율적인 방법

여기서 우리는 긴 길이의 정전 기적 반발력 친수성 상호 작용 크로마토 그래피 탠덤 질량 분석법 (LERLIC-MS / MS)에있어서의 단계적인 프로토콜을 제시한다. 이 산탄 총 단백질 체학에 의한 글루타민과 아스파라긴 탈 아미드 화 이소 형의 첫 번째 시간 정량화 및 특성화를 위해 할 수있는 새로운 방법입니다.

산탄 프로테오믹스 자세하게 특성화 LERLIC-MS / MS 및 글루타민 정량 아스파라긴 탈 아미드

여기에 우리가 직접 스파이크에 추가에 따라 다른 샘플에서 이동 RNA의 상대적 수준 또는 다른 짧은 RNA를 비교 하는 방법 뿐만 아니라 순화 된 대장균 RNA에서 레벨을 충전 하는 전송 RNA를 측정 하는 방법 제시 셀 참조 유전자 표현입니다.

풍부 하 고 대장균 에서 전송 RNAs의 레벨 충전의 정량화

교정 하는 DNA 중 합 효소와 DNA 수리 분석 결과 대 한 비 표시, 라디오 동위-방법 고해상도 TOF MALDI 질량 분석 및 단일 뉴클레오티드 확장 전략을 사용 하 여 개발 되었다. 분석 결과 매우 특정, 간단 하, 빠른, 고 교정에 대 한 수행 하 여 복구 패치 9-뉴클레오티드 보다 짧은 입증 했다.

교정 및 DNA 복구 분석 결과 단일 뉴클레오티드 확장 및 TOF MALDI 질량 분석 분석을 사용 하 여

체 외 화학 물질의 hypopigmentation 활동을 평가 하기 위한 세 가지 실험 방법 설명: 1) 셀룰러 tyrosinase 활동과 2) 멜 라 닌 콘텐츠, 및 3) 멜 라 닌 세포의 멜 라 닌 얼룩 및 이미지 분석에 의해 측정의 정량화.

생체 외에서 Hypopigmentation 활동의 정량화

여기, 선물이 단일 분자 수준에서 복잡 한 단백질 견본에서 각 단백질 종에 대 한 라벨 동질성을 평가 하는 프로토콜.

단일 분자 수준에서 동질성을 라벨의 프로테옴 와이드 정량화

정량적 멀티플렉스 면역침전(QMI)은 두 샘플 간의 표적 단백질-단백질 상호 작용의 풍부성에 대한 민감한 검출을 위해 유세포분석기를 사용합니다. QMI는 소량의 생체 물질을 사용하여 수행될 수 있고, 유전자 조작 태그를 필요로 하지 않으며, 이전에 정의된 단백질 상호작용 네트워크에 적응될 수 있다.

멀티플렉스 동시 면역 침전을 이용한 단백질 상호 작용 네트워크 역학의 정량화

배우세요 땅콩 씨앗에서 아플라톡신과 스틸베노이드 파이토알렉신을 SPE-UPLC로 비파괴 정량화하는 방법입니다. 이 기술은 Aspergillus에 내성이 있는 야생 Arachis 종을 선별하여 땅콩 품종 개량에 활용합니다.

단일 땅콩(Arachis spp.)의 아플라톡신 및 스틸베노이드 파이토알렉신의 비파괴 SPE-UPLC 기반 정량화 씨앗

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