Name: 장 점막 면역 반응을 분석하기 위한 Immunocompetent Intestine-on-Chip 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-24T14:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: 배우세요 장 점막 면역 반응을 분석하기 위한 immunocompetent intestine-on-chip 모델 개발 방법을. 이 기술은 미생물 정착에 대한 면역 반응 연구와 감염성 질환 치료 표적 식별에 활용됩니다.

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이 연구는 V.D.W.와 A.S.M. 및 A.S.M. A.F. 및 A.S.M.에 대한 공동 연구 센터 PolyTarget 1278(프로젝트 번호 316213987)의 재정 지원을 받았으며, 독일의 Excellence Strategy - EXC 2051 - Project-ID 690 390713860에 따른 Cluster of Excellence "Balance of the Microverse"의 재정 지원을 인정합니다. 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경 ZEISS LSM980을 사용할 수 있도록 지원해 준 Astrid Tannert와 Jena Biophotonic and Imaging Laboratory(JBIL)에 감사드립니다. 그림 1C와 그림 2 는 Biorender.com 로 만들어졌습니다.

면역학적 통찰을 위한 향상된 Intestine-on-Chip 플랫폼

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<li>Raasch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidically+supported+biochip+design+for+culture+of+endothelial+cell+layers+with+improved+perfusion+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Microfluidically supported biochip design for culture of endothelial cell layers with improved perfusion conditions.</a> Biofabrication. 7 (1), 015013(2015).</li>
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<li>Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G., Minick, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+human+endothelial+cells+derived+from+umbilical+veins.+Identification+by+morphologic+and+immunologic+criteria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria.</a> J Clin Invest. 52 (11), 2745-2756 (1973).</li>
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<li>Shin, W., Hinojosa, C. D., Ingber, D. E., Kim, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+intestinal+morphogenesis+controlled+by+transepithelial+morphogen+gradient+and+flow-dependent+physical+cues+in+a+microengineered+gut-on-a-chip%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Human intestinal morphogenesis controlled by transepithelial morphogen gradient and flow-dependent physical cues in a microengineered gut-on-a-chip.</a> iScience. 15, 391-406 (2019).</li>
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</ol>

M.R.은 Dynamic42 GmbH의 CEO이며 회사의 지분을 보유하고 있습니다. A.S.M.은 Dynamic 42 GmbH의 과학 고문이며 회사의 지분을 보유하고 있습니다.

제시된 프로토콜은 면역 능력이 있는 장-온-칩 모델을 생성하는 데 필요한 단계를 자세히 설명합니다. 면역형광 현미경 검사, 사이토카인 및 대사산물 분석, 유세포 분석, 단백질 및 유전자 분석, 투과성 측정과 같은 특정 기술과 가능한 판독 방법을 설명했습니다.
기술된 모델은 6,14 이전에 기술된 바와 같이 점액 분비, 흡수성, 장내분비 및 파네스 세포 유사 집단의 측면을 나타내는 장 상피 세포의 3D 층과 공동 배양된 일차 HUVEC, 단핵구 유래 대식세포 및 단핵구 유래 수지상 세포로 구성됩니다. 프로토콜 단계를 수행하는 동안 몇 가지 중요한 점을 염두에 두어야 합니다. 모든 단계에서 미세유체 시스템 내에서 기포 형성을 방지해야 합니다. 따라서 바이오칩 또는 튜빙을 다룰 때는 항상 피펫팅을 반대로(두 번째 스톱에서 부피를 차지하고 첫 번째 스톱까지만 분주)하십시오. 바이오칩 내 세포에 가해지는 고압 또는 전단력을 방지하려면 바이오칩에서 피펫팅할 때 항상 부드럽게 피펫팅하고 반대쪽 챔버를 닫은 상태로 유지하십시오(예: 상부 챔버에서 배지를 교환할 때 해당 플러그로 하부 챔버를 닫음). 바이오칩은 PET 멤브레인의 양면에 세포를 파종할 수 있습니다. 따라서 모델은 PET 멤브레인 아래에 장 융모와 같은 구조로 설정하거나 멤브레인에서 위쪽으로 자랄 수 있습니다. 연구 관심사에 따라, 세포의 하나 또는 다른 방향은 유동 매체에 부유하는 순환 세포의 중력 보조 세포 부착과 같은 물리적 상호 작용 측면에서 특정 이점을 갖습니다.
미세유체 매체 흐름으로 인해, 분극화된 장 세포는 크립트(crypt)와 같은 구조와 융모(villus)와 같은 구조를 닮은 3차원 조직을 형성하며, 이는 단단한 접합부와 유착 접합부(attherens junctions)의 조밀한 네트워크에 의해 깊은 정점 조직 장벽을 형성한다6. 또한 통합된 선천성 면역 세포는 장 장벽 기능을 증가시키고 기증자 특이적 면역 반응을 포함하여 다양한 자극에 대한 사이토카인 및 면역 세포 반응을 자세히 조사할 수 있습니다 3,6. 이 모델은 인간 장의 미생물 공생체(예: Lactobacillus rhamnosus6) 및 병원체(예: Candida albicans 6,8)를 연구하기 위한 생리학적으로 관련된 플랫폼을 제공합니다. 이 모델은 장내 미생물 구성 변화와 점막 면역 반응의 조절 메커니즘을 조사하는 데 활용되었다6. 이 연구에서 우리는 장 내강의 생리적 면역 내성을 재현하고 살아있는 미생물에 의한 항상성 집락화를 지원하는 방법을 보여주었습니다. 또한, 프로바이오틱스 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus)를 사용한 모델의 내강 면의 사전 집락화는 칸디다 알비칸스(Candida albicans)의 조직 침입을 줄이고 생체 내 상황과 유사하게 혈관 구획으로의 전위를 제한했습니다. 이 연구는 생리학적으로 관련된 체외 조건에서 장의 미생물 상호 작용, 면역 반응 및 병원성 메커니즘을 연구할 수 있는 모델의 잠재력을 입증했습니다.
그러나 이 칩 플랫폼은 인간의 장을 완전히 대표할 수 없는 암 유래 장 세포를 사용하고 1차 내피 및 면역 세포를 사용한다는 한계가 있습니다. 저산소 배양 조건은 인간 장의 생체 내 상황을 더 잘 반영하기 위해 관류 조건 하에서 저산소증 인큐베이터에서 모델을 배양하여 설정할 수 있습니다.
Kim et al.14,15에 의해 발표된 "gut-on-a-chip" 모델과 같은 다른 OoC 플랫폼과 비교하여, 제시된 조직 모델을 형성하는 초기 세포 수는 약 10배 더 높습니다. 예를 들어, 이를 통해 단일 실험 내에서 최대 3개의 면역형광 염색 패널을 동시에 분석할 수 있습니다. 세포 수가 많을수록 유세포 분석, 웨스턴 블롯 분석 및 사이토카인 프로파일링 및 젖산 탈수소효소(LDH) 측정과 같은 세포 배양 상층액이 필요한 기타 표준 기성 분석을 포함한 종말점 분석을 더욱 간소화할 수 있습니다. 단일 실험에서 여러 판독값을 얻을 수 있으므로 전체 비용과 실험 시간을 줄일 수 있습니다. 산업 인터페이스 및 풋프린트(칩의 미세한 슬라이드 형식, 루어 잠금 형식의 포트, 96웰 매트릭스에 정렬된 포트)를 특징으로 하는 표준화된 바이오칩 플랫폼 덕분에 광범위한 제조업체의 기성품 하드웨어 솔루션을 사용할 수 있습니다. 여기에는 또한 다양한 재료와 기공 크기의 많은 멤브레인이 포함됩니다. 공극 크기는 세포 성장과 조직 무결성16 및 세포 이동에 영향을 미칠 수 있습니다.
요약하면, 이 프로토콜은 인간 장 환경의 중요한 요소를 복제하는 상세하고 적응 가능한 intestine-on-chip 모델을 제시합니다. 특히 숙주 면역 반응 및 장 병태 생리학에 중점을 두고 장내 미생물군과 장 숙주 조직에 대한 광범위한 연구를 수행하기 위한 확장 가능하고 효과적인 플랫폼을 제공합니다. 따라서 이 모델은 전통적인 체외 모델과 인간 생물학 사이의 격차를 해소할 수 있어 장 생물학에 대한 심층 연구에 필수적인 도구가 됩니다.

OoC(Organ-on-Chip) 시스템은 기존의 2D 세포 배양과 동물 모델 간의 격차를 해소할 수 있는 새로운 3D 세포 배양 기술입니다. OoC 플랫폼은 일반적으로 멤브레인 또는 하이드로겔과 같은 다양한 골격체에서 성장한 조직 특이적 세포를 포함하는 하나 이상의 구획으로 구성됩니다1. 이 모델은 하나 이상의 정의된 유기형 기능을 모방할 수 있습니다. 펌프는 세포 배양 배지의 지속적인 미세유체 관류를 가능하게 하여 세포 폐기물을 제거하고, 세포 분화 개선을 위한 영양 및 성장 인자를 공급하고, 필수적인 생체 내 조건을 재현할 수 있습니다. 면역 세포의 통합으로 OoC 시스템은 in vitro2에서 인간의 면역 반응을 모방할 수 있습니다. 현재까지 다양한 장기와 기능 단위가 제시되었습니다1. 이러한 시스템에는 약물 검사(drug testing)5,7 및 감염 연구(infection studies)6,8를 위해 촉진될 수 있는 혈관구조(vasculature)3, 폐4, 간(liver)2,5 및 장(intestine)6의 모델이 포함된다.
여기에서는 인간 상피 세포를 통합하는 인간 장 온 칩 모델을 제시하며, 내피 내벽 및 조직 상주 대식세포와 결합된 융모와 같은 및 크립트와 같은 구조의 유기체형 3D 지형을 형성합니다. 이 모델은 미세한 슬라이드 형태의 미세유체 관류 바이오칩에서 배양됩니다. 각 바이오칩은 두 개의 개별 미세유체 공동으로 구성됩니다. 각 캐비티는 다공성 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET) 멤브레인에 의해 상부 및 하부 챔버로 나뉩니다. 멤브레인 자체는 세포가 양쪽에서 자랄 수 있는 발판 역할도 합니다. 막의 기공은 세포 누화와 세포층 사이의 세포 이동을 가능하게 합니다. 각 챔버는 두 개의 암형 루어 잠금 장치 크기의 포트를 통해 접근할 수 있습니다. 선택적으로, 추가적인 미니 루어 잠금 장치 크기의 포트를 통해 상부 또는 하부 챔버에 접근할 수 있습니다(그림 1).
OoC 플랫폼은 단일 실험에서 얻을 수 있는 여러 판독값을 제공합니다. Intestine-on-Chip은 관류 3D 세포 배양, 유출물 분석 및 형광 현미경을 결합하여 세포 마커 발현, 대사 속도, 면역 반응, 미생물 집락 형성 및 감염, 장벽 기능 3,6,8을 평가하도록 맞춤화되었습니다. 이 모델에는 조직에 상주하는 면역 세포와 살아있는 미생물이 숙주 조직과 직접 접촉하는 것이 포함되는데, 이는 발표된 다른 모델에 비해 이점이 있다9. 또한, 상피세포는 3차원 구조로 자가조직화되어 살아있는 미생물군(living microbiota)과의 집락화에 생리학적으로 유의미한 인터페이스를 제공한다6.

<table><tbody><tr><td>96웰 플레이트 블랙, 투명 바닥</td><td>Thermo Fisher</td><td>10000631</td><td>소모품</td></tr><tr><td>아세트산</td><td>Roth</td><td>3738.4</td><td>화학 물질</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 AffiniPure, 당나귀, 안티 마우스 IgG (H + L)</td> <td>Jackson Immuno Research</td><td>715-545-150</td><td>2 차 항체 혈관 염색 및 상피 염색</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 AffiniPure, 당나귀, 안티 토끼 IgG (H + L)</td> <td>Jackson Immuno Research</td><td>711-605-152</td><td>2차 항체 상피 염색</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647, 당나귀, 항토끼 IgG (H+L)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Invitrogen</td><td>A31573</td><td>2차 항체 혈관 염색</td></tr><tr><td>Axiocam ERc5s camera</td><td>Zeiss</td><td>426540-9901-000</td><td>기술 장비</td></tr><tr><td>기초 매체 MV, 페놀 레드 프리</td><td>Promocell</td><td>C-22225</td><td>세포 배양 소모품</td></tr><tr><td>Biochip</td><td>Dynamic 42</td><td>BC002</td><td>미세유체 소모품</td></tr><tr><td>BSA fraction V</td><td>Gibco</td><td>15260-037</td><td>세포 배양 소모품</td></tr><tr><td>C2BBe1 (Caco-2의 클론)</td><td>ATCC</td><td>CRL-2102</td><td>상피 세포 출처</td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>시그마</td><td>C2432</td><td>화학</td></tr><tr><td>CO2 인큐베이터</td><td>Heracell</td><td>150i</td><td>기술 장비</td></tr><tr><td>인간 태반의 콜라겐 IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5533</td><td>세포 배양 소모품</td></tr><tr><td>커버슬립 (24 x 40 mm; #1.5)</td><td>Menzel-Gl&auml; ser</td><td>15747592</td><td>소모품</td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure, 당나귀, anti-goat IgG (H+L)</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>705-165-147</td><td>Secondary Antibody Vascular</td></tr><tr><td>Staining Cy3 AffiniPure, donkey, anti-rat IgG (H+L)</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>712-165-150</td><td>Secondary Antibody Epithelial Staining</td></tr><tr><td>Descosept PUR</td><td>Dr.Schuhmacher</td><td>00-323-100</td><td>Cell culture consumables</td></tr><tr><td>DMEM 고포도당</td><td>Gibco</td><td>41965-062</td><td>세포 배양 소모품</td></tr><tr><td>DMEM 고포도당(페놀이 없음 적색</td>) <td>Gibco</td><td>31053028</td><td>세포 배양 소모품</td></tr><tr><td>DPBS (-/-)</td><td>Gibco</td><td>14190-169</td><td>세포 배양 소모품</td></tr><tr><td>DPBS (+/+)</td><td>Gibco</td><td>14040-133</td><td>세포 배양 소모품</td></tr><tr><td>EDTA 용액</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td>세포 배양 소모품</td></tr><tr><td>내피 세포 성장 배지</td><td>Promocell</td><td>C-22020</td><td>세포 배양 소모품</td></tr><tr><td>내피 세포 성장 배지 보충제 믹스</td><td>Promocell</td><td>C-39225</td><td>세포 배양 소모품</td></tr><tr><td>에탄올 96%, 비변성</td><td>Nordbrand-Nordhausen</td><td>410</td><td>화학 물질</td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>invitrogen</td><td>10270106</td><td>세포 배양 소모품:</td></tr><tr><td>플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)-덱스트란(3-5 kDa)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>FD4-100MG</td><td>화학 물질</td></tr><tr><td>형광 장착 매체</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td>화학</td></tr><tr><td>물질 겐타마이신(10mg/mL)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1272</td><td>세포 배양 소모품</td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplement(100x)</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>세포 배양 소모품</td></tr><tr><td>Histopaque</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10771</td><td>세포 배양 소모품</td></tr><tr><td>Hoechst (bisBenzimid) H33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14533</td><td>상피 염색</td></tr><tr><td>Holotransferrin (5mg/mL) Transferrin, Holo, Human Plasma</td><td>Millipore</td><td>616397</td><td>세포 배양 소모품</td></tr><tr><td>Human recombinant GM-CSF</td><td>Peprotech</td><td>300-30</td><td>Cell culture consumables</td></tr><tr><td>Human 재조합 M-CSF</td><td>Peprotech</td><td>300-25</td><td>세포 배양 소모품</td></tr><tr><td>조명 장치</td><td>Zeiss</td><td>HXP 120 C</td><td>형광 현미경 설정</td></tr><tr><td>레이저 스캐닝 현미경</td><td>Zeiss</td><td>CLSM980</td><td>형광 현미경 설정</td></tr><tr><td>리도카인 염산염</td><td>시그마-알드리치</td><td>L5647</td><td>세포 배양 소모품</td></tr><tr><td>지질다당류(LPS)</td><td>시그마</td><td>L2630</td><td>세포 배양 소모품</td></tr><tr><td>Loftex 와이프</td><td>Loftex</td><td>1250115</td><td>소모품</td></tr><tr><td>낮은 부착 튜브(PS, 5mL)</td><td>Falcon</td><td>352052</td><td>소모품</td></tr><tr><td>상단 캡용 루어 어댑터(M)</td><td>Mo Bi Tec</td><td>M3003</td><td>미세유체 소모품</td></tr><tr><td>수 미니 루어 플러그, 4열, PP, 불투명</td><td>미세유체 칩샵</td><td>09-0556-0336-09</td><td>미세유체 소모품</td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution</td><td>Gibco</td><td>11140</td><td>세포 배양 소모품</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Roth</td><td>8388.2</td><td>화학 물질</td></tr><tr><td>현미경</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer 5</td><td>형광 현미경 설치</td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>Menzel</td><td>MZ-0002</td><td>소모품</td></tr><tr><td>Monoclonal, mouse, anti-human CD68 항체 ( KP1)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Invitrogen</td><td>14-0688-82</td><td>1차 항체 혈관 염색</td></tr><tr><td>단클론, 쥐, 항인간 E-Cadherin 항체(DECMA-1)</td><td>Sigma-Aldrich, Millipore</td><td>MABT26</td><td>1차 항체 상피 염색</td></tr><tr><td>Multiskan Go 플레이트 리더</td><td>Thermo Fisher</td><td>51119300</td><td>기술 장비</td></tr><tr><td>일반 당나귀 혈청</td><td>Biozol</td><td>LIN-END9010-10</td><td>화학 물질</td></tr><tr><td>광학 절단</td><td>Zeiss</td><td>ApoTome</td><td>형광 현미경 설정</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>세포 배양 소모품</td></tr><tr><td>플러그</td><td>Cole Parmer</td><td>GZ-45555-56</td><td>미세유체 소모품</td></tr><tr><td>다클론, 염소, 항인간 VE-Cadherin 항체</td><td>R& D Systems</td><td>AF938</td><td>1차 항체 혈관 염색</td></tr><tr><td>다클론, 토끼, 항인간 Von Willebrand 인자 항체</td><td>Dako</td><td>A0082</td><td>1차 항체 혈관 염색</td></tr><tr><td>다클론, 토끼, 항인간 ZO-1 항체</td><td>Thermo Fisher Scientific, Invitrogen</td><td>61-7300</td><td>1차 항체 상피 염색</td></tr><tr><td>전원 공급 장치 현미경</td><td>Zeiss</td><td>Eplax Vp232</td><td>형광 현미경 설정</td></tr><tr><td>Primovert 현미경</td><td>Zeiss</td><td>415510-1101-000</td><td>기술 장비</td></tr><tr><td>Reglo ICC 연동 펌프</td><td>Ismatec</td><td>ISM4412</td><td>기술 장비</td></tr><tr><td>SAHA (Vorinostat)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SML0061-25MG</td><td>화학</td></tr><tr><td>물질 Saponin</td><td>Fluka</td><td>47036</td><td>화학</td></tr><tr><td>물질 S-monovette, 7.5 mL Z-Gel</td><td>Sarstedt</td><td>01.1602</td><td>소모품</td></tr><tr><td>S-Monovette, 9.0 mL K3E</td><td>Sarstedt</td><td>02.1066.001</td><td>소모품</td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Gibco</td><td>11360-088</td><td>세포 배양 소모품</td></tr><tr><td>탱크 4.5 mL</td><td>ChipShop</td><td>10000079</td><td>Microfluidic consumables</td></tr><tr><td>Trypane blue stain 0.4%</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td>Cell culture consumables</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>11538876</td><td>세포 배양 소모품</td></tr><tr><td>Tubing</td><td>Dynamic 42</td><td>ST001</td><td>미세유체 소모품</td></tr><tr><td>핀셋(Pr&auml; zisionspinzette DUMONT abgewinkelt Inox08, 5/45, 0,06 mm)</td><td>Roth</td><td>K343.1</td><td>소모품</td></tr><tr><td>밀 배아 응글레티닌 (WGA)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Invitrogen</td><td>W32464</td><td>Epithelial Staining</td></tr><tr><td>X-VIVO 15</td><td>Lonza</td><td>BE02-060F</td><td>세포 배양 소모품, Hematopoietic cell medium</td></tr><tr><td>Zellkultur Multiwell Platten, 24 Well, sterile</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662 160</td><td>소모품</td></tr><tr><td>Zellkultur Multiwell Platten, 6 Well, sterile</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657 160</td><td>소모품</td></tr><tr><td>Zen Blue 소프트웨어</td><td>Zeiss</td><td>버전 3.7</td><td>현미경 소프트웨어</td></tr></tbody></table>

장 점막 면역 반응을 분석하기 위한 immunocompetent intestine-on-chip 모델

Immunocompetent Intestine-on-Chip Model for Analyzing Gut Mucosal Immune Responses

상피 3D 기관형 융모와 같은 및 크립트와 같은 구조를 재현하는 고급 intestine-on-chip 모델이 개발되었습니다. 면역 역량 모델에는 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC), Caco-2 장 상피 세포, 조직 거주 대식세포 및 수지상 세포가 포함되며, 이들은 인간 장 점막의 특성을 반영하여 조직 내에서 자체 조직화됩니다. 이 플랫폼의 독특한 측면은 순환하는 인간 1차 면역 세포를 통합하여 생리학적 관련성을 향상시키는 능력입니다. 이 모델은 박테리아 및 진균 집락 형성 및 감염에 대한 장 면역 체계의 반응을 조사하도록 설계되었습니다. 확대된 캐비티 크기로 인해 이 모델은 투과 분석, 사이토카인 방출 및 면역 세포 침투와 같은 다양한 기능적 판독을 제공하며 상피 세포층에 의해 형성된 3D 구조의 면역형광 측정과 호환됩니다. 이를 통해 세포 분화 및 기능에 대한 포괄적인 통찰력을 제공합니다. intestine-on-chip 플랫폼은 미세생리학적 관류 바이오칩 플랫폼 내에서 살아있는 미생물군의 대리모와 인간 숙주 조직 간의 복잡한 상호 작용을 규명할 수 있는 잠재력을 입증했습니다.

이러한 대표적인 결과는 intestine-on-chip 모델의 뚜렷한 조직층을 보여줍니다. 이들은 프로토콜 섹션 11에 설명된 대로 면역형광 염색됩니다. 이미지는 epifluorescence 또는 confocal fluorescence microscope를 사용하여 z-stack으로 촬영하고 직교 투영으로 처리했습니다. 현미경 설정 및 소프트웨어에 대한 자세한 내용은 Table of Materials 를 참조하십시오. 그림 5 는 HUVEC과 대식세포로 구성된 장벽 형성 내피 단층인 혈관층을 보여줍니다. 내피 세포에 대한 VE-Cadherin 및 von Willebrand 인자와 대식세포에 대한 CD68과 같은 대표적인 세포 마커가 염색됩니다. C2BBe1 세포로 구성된 3차원 상피층은 그림 6 과 그림 7에 나와 있습니다. 조직 무결성은 E-Cadherin 및 ZO-1의 염색으로 확인됩니다. 모든 예상 조직 마커 및 조직 분극에 대한 자세한 분석은 Maurer et al.6에서 확인할 수 있습니다. 그림 8 은 장 융모와 같은 구조의 3차원 파생물이 결여된 예시적인 이미지를 보여줍니다. 일반적인 3차원 세포층(그림 6)과 비교했을 때, 염색된 핵의 수는 크게 줄어들었고 세포는 단층으로만 존재합니다. 이 특정 표현형은 세포 증식을 억제하는 세포 배양 배지에 히스톤 탈아세틸화효소 억제제를 첨가하여 생성되었습니다. 장벽 투과성은 FITC-dextran을 사용한 투과 분석으로 평가됩니다. 기회주의적 병원성 C. albicans에 감염되면 투과성이 증가했으며, 이는 그림 9A에서 볼 수 있습니다. 감염으로 인해 사이토카인 IL-1β, IL-6, IL-8 및 IL-10이 혈관 배지 상층액으로 방출되는 속도가 증가합니다(그림 9B)8.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66603/66603fig05.jpg"> 그림 5: intestine-on-chip의 고정된 혈관 쪽. 관류 5일 후 혈관 장벽의 대표적인 면역형광 이미지. 조직을 메탄올로 고정시켰다. 형광 현미경으로 1μm 절편의 z-stack을 촬영하고 이 z-stack의 직교 최대 투영을 표시합니다. (A) 핵 내의 DNA를 DAPI로 염색하였다. (B) 완전히 분화된 단핵구 유래 대식세포는 CD68을 발현하며 혈관 조직 전체에 퍼져 있습니다. (C) HUVEC은 VE-Cadherin과 같은 부착 접합부의 형성에 의해 조직 무결성을 보여주는 합류층을 생성합니다. 또한 (D) von Willebrand 요인은 HUVEC에 의해 많이 표현됩니다. 마지막으로 (E) 모든 마커가 오버레이에 표시됩니다. 스케일 바 = 100 μm. 약어: DAPI = 4',6-디아미디노-2-페닐린돌; HUVECs = 인간 제대 정맥 내피 세포. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66603/66603fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66603/66603fig06.jpg"> 그림 6: intestine-on-chip의 고정된 상피 쪽. 접합 단백질 E-Cadherin 및 ZO-1을 발현하는 관류 5일 후 편광 상피 세포층의 대표적인 면역형광 이미지. 조직을 메탄올로 고정시켰다. 1μm 절편의 z-stack을 형광 현미경으로 촬영했습니다. 이 Z 스택의 직교 최대 투영이 표시됩니다. (A) 핵 내의 DNA를 DAPI로 염색하였다. 단단한 상피 장벽은 E-Cadherin으로 염색된 (B) 부착 접합부와 ZO-1로 염색된 (C) 정점 접합부의 형성에 의해 개발됩니다. Tight junctions and adherens junctions는 (D) 오버레이 이미지에서 볼 수 있듯이 정점 세포막에서 co-localize합니다. 스케일 바 = 100 μm. 약어: DAPI = 4',6-디아미디노-2-페닐린돌. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66603/66603fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66603/66603fig07.jpg"> 그림 7: 융모와 같은 돌출부가 있는 intestine-on-chip의 고정된 상피 쪽. 6일간의 관류 후 3차원 상피 세포층의 대표적인 면역형광 이미지. 조직은 Carnoy의 고정제로 고정되었습니다. 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경으로 1μm 섹션의 z-stack을 촬영하고 (A) 이 z-stack의 직교 최대 투영을 표시합니다. 핵 내의 DNA는 Hoechst로 염색되었습니다. 또한, 조직은 인간의 점액을 염색하는 렉틴인 밀 배아 응집체로 염색되었습니다. (B) 상피의 융모와 같은 및 크립트와 같은 구조의 3차원 성장은 z-스택의 x 및 y 섹션에서 감지될 수 있습니다. 스케일 바 = 50 μm. 약어: WGA = 밀 배아 응집체. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66603/66603fig07large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66603/66603fig08.jpg"> 그림 8: 융모와 같은 돌출부가 없는 intestine-on-chip의 고정된 상피 쪽. 히스톤 탈아세틸화효소 억제제인 수베로일라닐리드 하이드록사믹산(SAHA)으로 처리하여 세포 증식을 방지한 상피세포층의 대표적인 면역형광 이미지. 조직을 메탄올로 고정시켰다. 1μm 절편의 z-stack을 형광 현미경으로 촬영했습니다. 이 Z 스택의 직교 최대 투영이 표시됩니다. (A) 핵 내의 DNA를 DAPI로 염색하였다. (B)에서 접착 접합부는 E-Cadherin으로 염색되고 (C)에서는 단단한 접합부가 ZO-1로 염색됩니다. Tight junctions 및 adherens junctions는 오버레이 이미지(D)에서 볼 수 있듯이 함께 국소화됩니다. 스케일 바 = 100 μm. 약어: DAPI = 4',6-디아미디노-2-페닐린돌. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66603/66603fig08large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66603/66603fig09.jpg"> 그림 9: 통합 선천성 면역 세포의 병원체 의존성 면역 반응: 이 수치는 Kaden et al.8에서 수정되었습니다. C. albicans SC5314에 감염되지 않은(-) 또는 감염된(+) intestine-on-chip 모델은 FITC-Dextran(3-5kDa) 및 (B) 사이토카인 분비에 대한 (A) 투과성에 대해 분석되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66603/66603fig09large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>용액/매체</td>
			<td colspan="2">구성</td>
		</tr><tr><td>콜라겐 스톡 솔루션</td>
			<td colspan="2">0.5mM 아세트산에 0.5mg/mL 콜라겐 IV</td>
		</tr><tr><td>이소 버퍼</td>
			<td colspan="2">PBS -/-, 1mg/mL 소 혈청 알부민 분획 V, 2mM EDTA</td>
		</tr><tr><td>단핵구 분화 배지</td>
			<td colspan="2">조혈 세포 배지 + 10% 인간 자가 혈청 + 10ng/mL 재조합 대식세포 집락 자극 인자(M-CSF) + 10ng/mL 재조합 과립구 대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF)</td>
		</tr><tr><td>트립신 해리 시약</td>
			<td colspan="2">PBS에서 0.25% 트립신 + 1mM EDTA -/-</td>
		</tr><tr><td>단핵구 분리 시약</td>
			<td colspan="2">PBS에서 4mg/mL 리도카인 + 5mM EDTA -/-</td>
		</tr><tr><td>EC 컨디셔닝 매체</td>
			<td colspan="2">EC-미디엄 +10% 인간 자가 혈청 +10ng/mL M-CSF + 10ng/mL GM-CSF</td>
		</tr><tr><td>C2-중간</td>
			<td colspan="2">DMEM 고포도당(4.5g/L) + 10% FBS + 1% GlutaMax + 1% MEM 비필수 아미노산 용액 + 1mM 피루브산 나트륨 + 10μg/mL 인간 홀로-트랜스페린</td>
		</tr><tr><td>플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)-덱스트란의 원액</td>
			<td colspan="2">페놀 레드가 없는 예열된 C2-배지에서 1mg/mL</td>
		</tr><tr><td>차단 및 투과성 솔루션</td>
			<td colspan="2">3% 일반 당나귀 혈청(NDS) + PBS의 0.1% 사포닌 +/+</td>
		</tr><tr><td>염색 용액</td>
			<td colspan="2">0.3% 일반 당나귀 혈청(NDS) + PBS의 0.1% 사포닌 +/+</td>
		</tr><tr><td>세척액</td>
			<td colspan="2">PBS의 사포닌 0.1% +/+</td>
		</tr><tr><td>카르노이의 고정제</td>
			<td colspan="2">60% 에탄올, 30% 클로로포름, 10% 빙초산</td>
		</tr></tbody></table>표 1: 이 프로토콜에 사용된 솔루션의 목록 및 구성. 약어: PBS -/- = 마그네슘과 칼슘이 없는 Dulbecco의 인산염 완충 식염수.

당사의 상세 프로토콜은 3D 구조와 다양한 세포 유형으로 인간의 장 점막을 시뮬레이션하는 고급 intestine-on-chip 모델의 생성 및 사용을 간략하게 설명하여 미생물 집락화에 대한 면역 반응 및 세포 기능에 대한 심층 분석을 가능하게 합니다.

장 점막 면역 반응을 분석하기 위한 Immunocompetent Intestine-on-Chip 모델

An advanced intestine-on-chip model recreating epithelial 3D organotypic villus-like and crypt-like structures has been developed. The immunocompetent ...

우리의 연구는 면역력이 있는 장기 칩 플랫폼의 개발 및 사용에 중점을 둡니다. 이러한 생리학적으로 관련성 있고 인간화된 체외 모델을 생성함으로써 복잡한 숙주-병원체 상호 작용을 연구할 수 있습니다. 우리가 만드는 지식은 전염병 치료를 위한 분자 표적을 조작하고 식별하는 데 사용할 수 있습니다.한 가지 주요 과제는 항상성 조건에서 숙주 조직과 함께 생체 내에서 살아있는 미생물군을 유지하는 것입니다. 여기에는 crypt 및 villus 구조의 organotypic 3D 지형과 미생물 집락화를 복제하는 것이 포함됩니다. Intestine-on-chip 플랫폼은 흐름을 사용하여 유기형 구조를 형성하고 박테리아의 과잉 증식을 방지함으로써 이 문제를 해결합니다.이를 통해 안정적인 배양 조건을 보장할 수 있습니다. 사용 가능한 다른 intestine-on-chip 플랫폼과 비교하여, 당사의 모델은 1차 조직에 상주하는 면역 세포를 포함하기 때문에 병원체에 대한 인간의 면역 반응에 대한 자세한 연구를 가능하게 합니다. 또한 모델 크기를 통해 하나의 단일 실험에서 여러 판독이 가능하여 전체 비용과 실험 횟수를 줄일 수 있습니다.본 연구실은 유도만능줄기세포를 이용하여 개인 맞춤형 의료를 가능하게 하는 자가 시스템을 개발하는 데 주력하고 있습니다.

immunocompetent-intestine-on-chip-model-for-analyzing-gut-mucosal

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

우리는 인간의 장 - 온 - 어 - 칩 microphysiological 시스템을 사용하여 확장 된 기간 동안 체외 프로토콜 공동 문화 장내 마이크로 바이 옴과 장 융모에 대해 설명합니다.

에 Microengineered 인간의 장내 융모와 생활 마이크로 바이 옴의 공동 문화 창자 - 온 - 어 - 칩 미세 유체 장치

생검 유래 장 오가노이드 및 장기 온 칩 기술은 미세 생리학 플랫폼으로 결합되어 영역 별 장 기능을 재구성합니다.

인간 오가노이드와 장기 온 칩 기술을 결합하여 장 영역별 기능 모델링

neuroHuMiX는 근접 및 대표 공동 배양 조건에서 박테리아, 상피 및 신경 세포의 상호 작용을 연구하기 위한 고급 gut-on-a-chip 모델입니다. 이 모델을 통해 장내 마이크로바이옴과 신경계 사이의 통신의 기초가 되는 분자 메커니즘을 밝힐 수 있습니다.

장내 마이크로바이옴-신경계 축을 연구하기 위한 gut-on-a-chip 모델

여기서는 기본 3차원(3D) 장 세포주 모델 시스템과 고정 장 등가물의 광학 현미경 평가를 위한 파라핀 임베딩 프로토콜을 구성하는 방법을 설명합니다. 선택한 단백질의 염색을 통해 단일 실험에서 여러 시각적 파라미터를 분석하여 전임상 약물 스크리닝 연구에 사용할 수 있습니다.

면역 성분이 있는 기본 3차원(3D) 장 모델 시스템

개의 장 오가노이드와 Gut-on-a-Chip 미세유체 시스템의 통합은 인간 장 질환에 대한 관련 번역 모델을 제공합니다. 제시된 프로토콜은 장의 3D 형태 형성 및 동적 체외 모델링을 가능하게 하여 One Health를 통해 개와 인간의 장 질환에 대한 효과적인 치료법 개발을 지원합니다.

염증성 장 질환 환자에서 유래한 장 오가노이드를 사용한 개 장내 칩의 3차원 형태 형성

Lung-on-chip 모델은 공기-액체 계면과 내피 세포 관류를 모방하여 폐 생리학 연구에 중요한 혈류 및 영양소 교환을 시뮬레이션함으로써 기존 2D 배양을 능가합니다. 이는 폐 연구의 관련성을 높여 호흡기 감염에 대한 이해와 치료를 촉진할 수 있는 역동적이고 생리학적으로 정확한 환경을 제공합니다.

폐포 점막 면역 반응을 연구하기 위한 면역 유능한 폐포-온-칩 모델

에 대한 면역 적격 마우스에 묽은 난소암의 Orthotopic 모델 생체내에</em종양 면역 응답> 종양 이미징 및 모니터링

리스테리아 monocytogenes는 생쥐에서 세균을 세포에 면역 반응과 유전 자화율을 연구를위한 모델 생물이다. 이 방법은 박테리아 부하를 측정하고 리스테리아 감염으로 인한 면역 세포의 변화를 결정하는 외과 분석을위한 생쥐의 간 및 비장의 단일 셀 suspensions를 생성하는 하나 있습니다.

감염된 마우스에 세균 하중과 면역 응답 측정 리스테리아 monocytogenes</em

인간 호흡기 세포융합 바이러스(HRSV)는 어린 유아에게 심각한 세기관지염을 유발할 수 있습니다. 중증 HRSV 질환의 발병 기전 중 일부는 숙주 면역 반응에 의해 발생합니다. HRSV를 이용한 일차 인간 면역 세포의 자극은 염증 경로 및 감염의 활성화를 연구하기 위한 빠르고 재현 가능한 모델 시스템을 제공합니다.

인간 호흡기 세포융합 바이러스 감염에 대한 인간 말초 혈액 단핵 세포의 면역 반응을 연구하기 위한 체외 모델

인간 동시 감염은 체외에서 복제하기 어렵습니다. 그러나 인간 말라리아 기생충은 HIV에 자연적으로 감염된 갓 분리된 인간 말초 혈액 단핵 세포와 마찬가지로 체외에서 쉽게 배양할 수 있습니다. 이는 HIV 동시 감염의 맥락에서 말라리아 기생충에 대한 조기 면역 반응을 연구하기 위한 훌륭한 모델을 제공합니다.

<em&gt; 체외</em&gt; HIV 공동 감염의 맥락에서 말라리아에 면역 반응을 측정하기위한 모델

배우세요 장 점막 면역 반응을 분석하기 위한 immunocompetent intestine-on-chip 모델 개발 방법을. 이 기술은 미생물 정착에 대한 면역 반응 연구와 감염성 질환 치료 표적 식별에 활용됩니다.

장 점막 면역 반응을 분석하기 위한 Immunocompetent Intestine-on-Chip 모델

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