Name: 항생제 내성을 연구하기 위한 모델로 Mycobacterial Biofilm 성장 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-12T13:40:00.000+00:00
Duration: 4 min 26 s
Description: 배우세요 Mycobacterium smegmatis를 이용한 펠리클 바이오필름 형성 프로토콜로 항생제 내성 연구를 수행하는 방법입니다. 이 단순화된 방법은 생리학적 관련성을 높여 효과적인 항균제 선별이 가능합니다.

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<meta charset="utf8"></head><body>Mycobacteria의 Pellicle Biofilms 개발 및 평가

<ol><li>Davey, M. E., O'toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+biofilms%3A+From+ecology+to+molecular+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Microbial biofilms: From ecology to molecular genetics.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 64 (4), 847-867 (2000).</li>
<li>Rumbaugh, K. P., Sauer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+dispersion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilm dispersion.</a> Nat Rev Microbiol. 18 (10), 571-586 (2020).</li>
<li>Davies, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+biofilm+resistance+to+antibacterial+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Understanding biofilm resistance to antibacterial agents.</a> Nat Rev Drug Discov. 2 (2), 114-122 (2003).</li>
<li>Hernández-Jiménez, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+vs.+planktonic+bacterial+mode+of+growth%3A+Which+do+human+macrophages+prefer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Biofilm vs. planktonic bacterial mode of growth: Which do human macrophages prefer.</a> Biochem Biophys Res Commun. 441 (4), 947-952 (2013).</li>
<li>Nadell, C. D., Drescher, K., Foster, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+structure%2C+cooperation+and+competition+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Spatial structure, cooperation and competition in biofilms.</a> Nat Rev Microbiol. 14 (9), 589-600 (2016).</li>
<li>Jo, J., Price-Whelan, A., Dietrich, L. E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradients+and+consequences+of+heterogeneity+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Gradients and consequences of heterogeneity in biofilms.</a> Nat Rev Microbiol. 20 (10), 593-607 (2022).</li>
<li>Keating, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis+modifies+cell+wall+carbohydrates+during+biofilm+growth+with+a+concomitant+reduction+in+complement+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Surf%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis modifies cell wall carbohydrates during biofilm growth with a concomitant reduction in complement activation.</a> Cell Surf. 7, 100065(2021).</li>
<li>Ojha, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+Mycobacterium+tuberculosis+biofilms+containing+free+mycolic+acids+and+harbouring+drug-tolerant+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Growth of Mycobacterium tuberculosis biofilms containing free mycolic acids and harbouring drug-tolerant bacteria.</a> Mol Microbiol. 69 (1), 164-174 (2008).</li>
<li>Dietrich, L. E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+community+morphogenesis+is+intimately+linked+to+the+intracellular+redox+state%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Bacterial community morphogenesis is intimately linked to the intracellular redox state.</a> J Bacteriol. 195 (7), 1371-1380 (2013).</li>
<li>Kulka, K., Hatfull, G., Ojha, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+Mycobacterium+tuberculosis+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Growth of Mycobacterium tuberculosis biofilms.</a> J Vis Exp. (60), e3820(2012).</li>
<li>Wiegand, I., Hilpert, K., Hancock, R. E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agar+and+broth+dilution+methods+to+determine+the+minimal+inhibitory+concentration+%28MIC%29+of+antimicrobial+substances%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances.</a> Nat Protoc. 3 (2), 163-175 (2008).</li>
<li>Anand, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyketide+quinones+are+alternate+intermediate+electron+carriers+during+mycobacterial+respiration+in+oxygen-deficient+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Polyketide quinones are alternate intermediate electron carriers during mycobacterial respiration in oxygen-deficient niches.</a> Mol Cell. 60 (4), 637-650 (2015).</li>
<li>Growth Curves: Generating Growth Curves Using Colony Forming Units and Optical Density Measurements. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.jove.com/v/10511/growth-curves-cfu-and-optical-density-measurements">https://www.jove.com/v/10511/growth-curves-cfu-and-optical-density-measurements</a> (2019).</li>
<li>Høiby, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+personal+history+of+research+on+microbial+biofilms+and+biofilm+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Pathog+Dis%22%5BJournal%5D)">A personal history of research on microbial biofilms and biofilm infections.</a> Pathog Dis. 70 (3), 205-211 (2014).</li>
<li>Rajewska, M., Maciąg, T., Jafra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+source+and+surface+type+influence+the+early-stage+biofilm+formation+by+rhizosphere+bacterium+Pseudomonas+donghuensis+P482%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Carbon source and surface type influence the early-stage biofilm formation by rhizosphere bacterium Pseudomonas donghuensis P482.</a> bioRxiv. , (2023).</li>
<li>O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtiter+dish+biofilm+formation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+exp%22%5BJournal%5D)">Microtiter dish biofilm formation assay.</a> J Vis exp. (47), e2437(2011).</li>
<li>Chakraborty, P., Bajeli, S., Kaushal, D., Radotra, B. D., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+in+the+lung+contributes+to+virulence+and+drug+tolerance+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation in the lung contributes to virulence and drug tolerance of Mycobacterium tuberculosis.</a> Nat Comm. 12 (1), 1606(2021).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0.2 & 마이크로; M PVDF 주사기 필터</td><td>Axiva</td><td>SFNY04 R</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 팁</td><td>Genetix</td><td>GXM-611000 C</td><td></td></tr><tr><td>10 &micro; L 팁</td><td>Genetix</td><td>GXM-6110 C</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; L 팁</td><td>Genetix</td><td>GXM-61200C</td><td></td></tr><tr><td>6웰 폴리프로필렌 플레이트</td><td>Tarsons</td><td>980010</td><td></td></tr><tr><td>호박색 튜브</td><td>Tarsons</td><td>546051</td><td></td></tr><tr><td>오토클레이브</td><td>Hospharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>생물안전 캐비닛 A II</td><td>MSET</td><td></td><td></td></tr><tr><td>블로팅 페이</td>퍼 <td>적합한 공급업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Citric acid</td><td>Sigma</td><td>251275</td><td></td></tr><tr><td>Cuvettes</td><td>Bio-Rad</td><td>2239955</td><td></td></tr><tr><td>Ferric ammonium citrate</td><td>Sigma</td><td>F5879</td><td></td></tr><tr><td>Gel 문서화 시스템</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass Beads</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>49139</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>시그마</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>접종 루프</td><td>Genaxy</td><td>HS81121C</td><td></td></tr><tr><td>L-Aspargine</td><td>시그마</td><td>A0884</td><td></td></tr><tr><td>LB-한천</td><td>Himedia</td><td>M1151</td><td></td></tr><tr><td>LB-media</td><td>Himedia</td><td>M575</td><td></td></tr><tr><td>M. smegmatis mc2155 cryo-stock</td><td>ATCC</td><td>700084</td><td></td></tr><tr><td>황산 마그네슘</td><td>시그마</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 피펫</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>파라 필름</td><td>타손</td><td></td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>Tarsons</td><td>460020</td><td></td></tr><tr><td>pH 측정기</td><td>Labman Scientific Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>플레이트 리더</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>폴리 프로필렌 시험관</td><td>Genaxy</td><td>GEN-14100-PS</td><td></td></tr><tr><td>인산칼륨 일염기성</td><td>시그마</td><td>P5379</td><td></td></tr><tr><td>리팜피신</td><td>MedchemExpress</td><td>HY-B0272</td><td></td></tr><tr><td>혈청학 피펫</td><td>SPL Life Sciences</td><td>95210</td><td></td></tr><tr><td>셰이커 인큐베이터</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>주걱</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>분광 광도계</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>정적 인큐베이터</td><td>CARON</td><td></td><td></td></tr><tr><td>멸균 10 mL 주사기</td><td>Becton Dickinson</td><td>309642</td><td></td></tr><tr><td>멸균 50 mL 주사기</td><td>Becton Dickinson</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>Tween-80</td><td>Sigma</td><td>P1754</td><td></td></tr><tr><td>계량 저울</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>황산 아연</td><td>Sigma</td><td>Z0251</td><td></td></tr></tbody></table>

항생제 내성을 연구하기 위한 모델로 mycobacterial biofilm 성장

Growing Mycobacterial Biofilm as a Model to Study Antimicrobial Resistance

생물막 펠리클은 3일째부터 육안으로 볼 수 있습니다. 생물막은 2% 포도당 없이 Sauton의 매체에서 자라지만, 첨가되었을 때 망상에서 개선이 관찰되었습니다. 우리는 4일 동안 성장한 1.5mL의 Sauton's 배지(2% 포도당 보충)와 함께 24웰 플레이트의 각 웰에서 10.48mg ± 3.13mg(n = 4)의 생물막 건조 중량을 얻었습니다. 그림 2에서 생물막 발달은 3일째부터 6일째까지 볼 수 있었습니다. 3일째에 약간의 망상으로 필름을 형성하기 시작하고 5일째가 되면 완전히 성숙합니다. 6일째부터 생물막이 분해되기 시작합니다. 리팜피신(64μg/mL)의 MIC90은 생물막의 CFU를 25% 감소± 12%(n=3)만 감소시켰습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66607/66607fig01.jpg"> 그림 1 : Sauton의 매체에서 4 일 배양 후 M. smegmatis의 생물막. (1) 포도당없이 2 % 접종물을 접종합니다. (2) 포도당을 사용하지 않고 4% 접종물을 접종한다. (3) 2% 포도당으로 2% 접종물을 접종한다. (4) 2 % 포도당으로 4 % 접종을한다. (5) 및 (6)은 미디어 컨트롤입니다. 여기서 샘플은 표준 6웰 플레이트에 있습니다. 사진은 확대 없이 캡처됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66607/66607fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66607/66607fig02.jpg"> 그림 2: 접종 후 3일째부터 6일째까지의 M. smegmatis 생물막 형태. 여기서 샘플은 표준 24웰 플레이트에 있습니다. 사진은 확대 없이 캡처됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66607/66607fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>S. 아니.</td>
			<td colspan="3">구성 요소</td>
			<td colspan="2">작동 농도 (w/v)</td>
			<td colspan="2">스톡 용액 농도</td>
			<td colspan="2">스톡 용액의 부피/무게</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td colspan="3">인산이수소칼륨</td>
			<td colspan="2">0.05%</td>
			<td colspan="2">2.50%</td>
			<td colspan="2">20mL</td>
		</tr><tr><td>2</td>
			<td colspan="3">황산 마그네슘</td>
			<td colspan="2">0.05%</td>
			<td colspan="2">2.50%</td>
			<td colspan="2">20mL</td>
		</tr><tr><td>3</td>
			<td colspan="3">구연산 제2철암모늄</td>
			<td colspan="2">0.01%</td>
			<td colspan="2">5%</td>
			<td colspan="2">1mL</td>
		</tr><tr><td>4</td>
			<td colspan="3">글리세롤</td>
			<td colspan="2">6%</td>
			<td colspan="2">100%</td>
			<td colspan="2">60mL</td>
		</tr><tr><td>5</td>
			<td colspan="3">L- 아스파라긴</td>
			<td colspan="2">0.40%</td>
			<td colspan="2">해당 없음</td>
			<td colspan="2">4 지</td>
		</tr><tr><td>6</td>
			<td colspan="3">구연산</td>
			<td colspan="2">0.20%</td>
			<td colspan="2">해당 없음</td>
			<td colspan="2">2 지</td>
		</tr></tbody></table>표 1: Sauton의 미디어 준비를 위한 구성 요소.

항생제 내성을 연구하기 위한 모델로 Mycobacterial Biofilm 성장

Many bacteria thrive in intricate natural communities, exhibiting key attributes of multicellularity such as communication, cooperation, and competition. ...

growing-mycobacterial-biofilm-as-model-to-study-antimicrobial

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

본 논문은 성장의 다른 방법을...

공동 문화 모델 녹농균 Biofilms는 라이브 인간 에어웨이 세포에 들어라

특정 조건에서 배양해 때 결핵은 Mycobacterium 마약 허용 biofilms를 형성합니다. 여기 culturing M.하는 방법을 설명 결핵 biofilms 및 약물 관용 persisters의 주파수를 결정. 이러한 프로토콜은 M.의 약물 내성의 메커니즘에 대한 연구를 위해 도움이 될 것입니다 결핵.

의 성장 결핵은 Mycobacterium Biofilms

이 프로토콜은 96웰 마이크로티터 플레이트를 사용하여 체외에서 생물막을 형성할 수 있는 세균균에 대한 플랑크토닉 과 생물막 내성을 직접 비교할 수 있게 한다. 플랑크토닉 또는 생물막 박테리아는 선택의 항균제의 직렬 희석에 노출된다. 생존력은 한천 판의 성장에 의해 분석됩니다.

플랑크토닉 세포(MBC-P) 및 생물막세포(MBC-B)의 항균제 의 최소 박혈 농도 확립

이 프로토콜은 슬라이드 챔버 모델을 사용하여 숙주 인자에 노출된 후 생물막 발달의 시각화를 설명합니다. 이 모델을 사용하면 컴퓨터 소프트웨어 프로그램을 사용하여 생물막 매개변수를 분석할 뿐만 아니라 생물막 개발을 직접 시각화할 수 있습니다.

챔버의 coverglass 모델을 사용하여 바이오 필름 개발에 객담의 효과를 시각화

녹농균 생물막 구조에 대한 항균 유도 변화는 낭포성 섬유증 및 만성 폐 감염 환자로부터 배양한 임상 분리물 간에 다릅니다. 컨포칼 현미경 검사 후 COMSTAT 소프트웨어를 사용하여 항감염제의 효능을 평가하기 위해 개별 분리체에 대한 생물막 구조(예: 표면적, 두께, 바이오매스)의 변화를 정량화할 수 있습니다.

COMSTAT 소프트웨어를 사용하여 체외 생물막 아키텍처에 대한 항균제의 효과 정량화

이 워크플로우는 낭포성 섬유증을 가진 개별의 폐에 있는 세균성 생물막의 확립된 ex vivo 모형을 사용하여 항생제 감수성 시험을 능력을 발휘하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이 모델의 사용은 MBEC의 임상 타당성을 향상시킬 수 (최소한의 생물 막 박멸 농도) 에세이.

낭포성 섬유증 폐에 있는 슈도모나스 아에루기노사 및 황색포도상구균 생물막의 Ex vivo 모형에 있는 항생제 효능 시험

이 프로토콜은 고처리량 96웰 고정 뚜껑 정적 생물막 스크리닝을 위해 자체 조립된 딥 웰 PCR 플레이트 장치를 사용하여 생물막 성장 및 바이오매스 측정을 수행하는 방법론을 제시합니다.

PCR-플레이트 딥웰 마이크로플레이트 장치를 이용한 더 큰 박테리아 바이오필름 바이오매스의 생성

이 프로토콜은 박테리아 종간 상호 작용의 영향을 탐구하는 데 사용할 수 있는 낭포성 섬유증(CF) 폐 관련 4종 다미생물 생물막 모델을 설명합니다.

커뮤니티 표현형을 조사하기 위한 낭포성 섬유증 관련 다미생물 생물막 성장

이 방법론을 통해 연구 및 임상 실험실에서 항균성 감수성 테스트를 위해 낭포성 섬유증에서 다미생물 생물막 모델을 구축할 수 있습니다. 이 모델은 다양한 출력에 걸쳐 정확하고 신뢰할 수 있는 결과를 제공합니다.

낭포성 섬유증에서 항균제를 테스트하기 위한 다미생물 집락 생물막 모델 개발

이 연구는 낭포성 섬유증 폐 환경을 반영하는 녹농균 유전자 발현을 평가하기 위해 응집체 다미생물 생물막 모델을 개발하고 RNA 추출 프로토콜을 최적화하기 위한 프레임워크를 설명합니다. 응용 분야에는 항균 효과 평가 및 낭포성 섬유증과 관련된 조건에서 항생제 대안 연구가 포함됩니다.

감염 관련 유전자 발현을 연구하기 위한 낭포성 섬유증 응집체 생물막 모델

배우세요 Mycobacterium smegmatis를 이용한 펠리클 바이오필름 형성 프로토콜로 항생제 내성 연구를 수행하는 방법입니다. 이 단순화된 방법은 생리학적 관련성을 높여 효과적인 항균제 선별이 가능합니다.

항생제 내성을 연구하기 위한 모델로 Mycobacterial Biofilm 성장

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