Name: Differential Scanning Fluorescence를 통한 CD40 단백질-Umbelliferone 상호작용 검출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-01T14:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 30 s
Description: 학습하세요 Differential Scanning Fluorescence를 활용한 CD40 단백질-Umbelliferone 상호작용 검출 방법을. 최소한의 단백질 손실과 높은 데이터 정확도로 면역학 연구에 활용할 수 있습니다.

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우리는 티베트 의과대학 제14차 5개년 계획의 함축 건설 프로젝트(2022ZYYGH12), 티베트 의과대학 교육부 티베트 의학 및 기초 교육의 핵심 실험실 및 기본 교육의 2022년 공개 과목, 닝샤 의과대학 핵심 연구 개발 프로그램(2023BEG02012)에서 받은 재정적 지원에 대해 진심으로 감사를 표합니다. Chengdu University of Traditional Chinese Medicine (XKTD2022013)의 Xinglin Scholar Research Promotion Project.

화합물 용액, 단백질 용액 및 염료를 PBS 용액에 도입했습니다. 그 후, 샘플은 디지털 가열 진탕 건식 수조를 사용하여 점진적으로 가열하고, 복잡한 시스템 내에서 형광 강도의 변화를 측정하여 단백질의 열적 안정성을 평가했습니다. 자세한 단계는 아래에 설명되어 있으며 그림 1 은 프로토콜의 개요를 보여줍니다.
1. 솔루션 준비
<ol><li>0.1mg의 umbelliferone을 616.75μL의 DMSO 용액에 첨가하여 1mM umbelliferone 용액을 준비합니다( 재료 표 참조).</li>
	<li>0.1mg의 CD40 내지 500 μL의ddH2O용액을 첨가하여 200 μg/mL CD40 단백질 용액을 준비한다( 재료 표 참조).</li>
	<li>1μL의 5000x 주황색 염료를 9μL의 인산염 완충 식염수(PBS)에 첨가하여 500x 주황색 염료 용액을 준비합니다( 재료 표 참조). 참고: 얼음에 대해 위의 작업을 수행하고 피펫의 최소 범위는 0.1μL이므로 처음에 주황색 단백질 염료를 10배로 희석하여 후속 사용을 용이하게 합니다.</li>
</ol>2. 염료 성능 테스트
<ol><li>500x 주황색 염료를 PBS 용액에 넣고 희석하여 염료(PBS 비율이 1:500, 1:1000, 1:2000 및 1:4000)가 되도록 합니다. 알림: DMSO의 최종 농도가 2%(v/v)를 초과하지 않는지 확인하십시오.</li>
	<li>형광 마이크로플레이트 리더를 켜고 10분 동안 예열합니다.</li>
	<li>컴퓨터와 데이터 수집 소프트웨어를 순서대로 엽니다( 재료 표 참조).</li>
	<li>Instrument를 클릭하고 해당 형광 마이크로플레이트 모델을 선택한 다음 데이터 수집 소프트웨어에서 OK를 선택합니다. 참고: 형광 마이크로플레이트가 예열을 완료하고 패널에 온도를 표시할 때까지 기다렸다가 데이터 수집 소프트웨어를 열어 기기와 소프트웨어 간의 성공적인 연결을 확인하십시오.</li>
	<li> Acquisition Settings(획득 설정)를 클릭하고 데이터 수집 소프트웨어에서 Fluorescence(형광)를 선택합니다.</li>
	<li>파장 인터페이스에서 프로그램을 편집합니다: Lm1 = 470 nm, 570 nm를 선택한 다음 확인을 선택합니다. 참고: 주황색 염료는 300nm의 UV 광 또는 470nm의 가시광선으로 여기될 수 있으며 방출은 570nm에서 측정할 수 있습니다.</li>
	<li>다양한 농도의 주황색 염료(1:500, 1:1000, 1:2000 및 1:4000)와 PBS를 100μL/웰의 96웰 플레이트에 추가합니다. 참고: PBS에 첨가하기 전에 DMSO에 용액을 용해시키고 염료의 침전 경향으로 인해 완전히 용해되도록 준비 과정에서 2000 x g 에서 완전히 소용돌이치십시오.</li>
	<li>96웰 플레이트를 기기의 검출 단계에 놓고, 데이터 수집 소프트웨어에서 읽기 버튼을 클릭하고, 각 염료 농도의 형광을 실온에서 매번 2분 간격으로 13회 측정합니다.</li>
	<li>각 결정 후 내보내기 버튼을 클릭하고, XML XLS TXT로 내보내기를 선택하고, 모든 플레이트를 선택한 다음, 출력 형식의 플레이트를 선택하고, 마지막으로 확인을 클릭하여 추가 분석을 위해 "XLS" 형식의 폴더에 데이터를 저장합니다. 참고: 이 단계는 실온에서 오렌지 염료의 자가형광에 대한 연속 측정의 영향을 결정하고 최적의 염색 농도를 식별하는 데 도움이 됩니다.</li>
	<li>디지털 가열 진탕 건욕을 켜고 가열 온도를 35°C, 가열 시간을 2분으로 설정합니다.</li>
	<li>1.5mL 미세 원심분리기 튜브에서 염료의 최적 희석 비율을 준비하고 디지털 가열 진탕 건욕에 2분 동안 넣습니다.</li>
	<li>PBS 용액과 35°C에서 가열된 염색 용액을 웰당 100μL의 부피로 96웰 플레이트에 추가합니다.</li>
	<li>96웰 플레이트를 기기의 검출 단계에 놓고 데이터 수집 소프트웨어에서 Read 버튼을 클릭합니다.</li>
	<li>가열 온도를 40°C로, 가열 시간을 2분으로 설정합니다.</li>
	<li>96웰 플레이트의 염료 용액을 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에 다시 피펫팅하고 기기에서 2분 동안 가열합니다.</li>
	<li>2.12-2.15 단계 및 2.9 단계의 작업을 반복하여 각각 35 °C, 40 °C, 45 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C, 70 °C, 75 °C, 80 °C, 85 °C, 90 °C 및 95 °C에서 염료 용액의 흡광도를 테스트합니다. 참고: 이 단계는 35 °C에서 95 °C까지의 구배에서 연속 가열 하에서 주황색 염료의 자가형광 안정성을 결정하는 데 도움이 됩니다. 급격한 온도 강하나 실험 오류로 이어질 수 있는 잘못된 액체를 추가하지 않도록 신속하게 작업하는 것이 중요합니다.</li>
</ol>3. 단백질의 온도 용융(Tm) 감지
<ol><li>CD40 단백질과 오렌지 염료를 PBS 용액과 결합하여 각각 5μg/mL, 10μg/mL, 15μg/mL, 20μg/mL 및 1:500의 최종 농도를 달성합니다.</li>
	<li>2.2-2.6단계 및 2.10-2.16단계에 설명된 작업을 반복하여 각각 35°C, 40°C, 45°C, 50°C, 55°C, 60°C, 65°C, 70°C, 75°C, 80°C, 85°C, 90°C 및 95°C의 온도에서 CD40 단백질 용액의 흡광도를 평가합니다.</li>
	<li>2.9단계를 반복하여 데이터를 저장 및 분석한 다음 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 Tm 값을 계산합니다( 재료 표 참조).</li>
	<li>CD40 단백질, 움벨리페론 및 오렌지 염료를 PBS 용액에 첨가하여 각각 5μg/mL, 10μg/mL, 15μg/mL, 20μg/mL, 10μM 및 1:500의 최종 농도를 얻습니다. 참고: 용액 준비 중 격렬한 와류는 PBS에서 염료, CD40 단백질 및 umbelliferone의 균일한 분포를 보장하는 데 필수적입니다.</li>
	<li>3.2-3.3 단계의 작업을 반복하여 각각 35 °C, 40 °C, 45 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C, 70 °C, 75 °C, 80 °C, 85 °C, 90 °C 및 95 °C의 온도에서 CD40-umbelliferone 복합체 용액의 흡광도를 측정합니다. 참고: 이 단계는 CD40 단백질 및 CD40-umbelliferone 복합체의 Tm 값을 결정하기 위해 수행되었으며, umbelliferone에 대한 최적의 CD40 단백질 결합 농도를 식별하는 것을 목표로 합니다.</li>
</ol>

형광을 이용한 화합물 단백질 결합의 고감도 검출

<ol><li>Cairang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+on+the+standardization+of+clinical+application+of+Tibetan+medicine+%26%2334%3Bfive+roots%26%2334%5BTitle%5D)+AND+%22Guid+J+Trad+Chin+Med+Pharm%22%5BJournal%5D)">Study on the standardization of clinical application of Tibetan medicine &#34;five roots&#34.</a> Guid J Trad Chin Med Pharm. 28 (11), 133136(2022).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Xigui+extract+on+immunosuppressive+mice+induced+by+cyclophosphamide%5BTitle%5D)+AND+%22Chin+J+Hosp+Pharm%22%5BJournal%5D)">Effects of Xigui extract on immunosuppressive mice induced by cyclophosphamide.</a> Chin J Hosp Pharm. 37 (03), 244-247 (2017).</li>
<li>Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Vicatia+thibertica+de+boiss+on+immunologic+and+hematopoietic+function+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dali+Univ%22%5BJournal%5D)">Effects of Vicatia thibertica de boiss on immunologic and hematopoietic function of mice.</a> J Dali Univ. 2 (02), 6-10 (2017).</li>
<li>Dong, S., Zhang, X., Hu, Y., Gong, X., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+constituents%2C+quality+control+and+pharmacology+research+progress+of+Xigui%5BTitle%5D)+AND+%22Chin+J+Ethnomed+Ethnopharm%22%5BJournal%5D)">Chemical constituents, quality control and pharmacology research progress of Xigui.</a> Chin J Ethnomed Ethnopharm. 27 (13), 40-42 (2018).</li>
<li>Lu, Z., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+total+flavone+extract+from+Shuiqin+%28Oenanthe+Javanica%29+on+immune+function+of+immunosuppression+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Chin+J+Trad+Med+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">Effects of total flavone extract from Shuiqin (Oenanthe Javanica) on immune function of immunosuppression mice.</a> Chin J Trad Med Sci Technol. 23 (04), 423-425 (2016).</li>
<li>Vonderheide, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40+agonist+antibodies+in+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Med%22%5BJournal%5D)">CD40 agonist antibodies in cancer immunotherapy.</a> Annu Rev Med. 71, 47-58 (2020).</li>
<li>Grewal, I. S., Flavell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40+and+CD154+in+cell-mediated+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD40 and CD154 in cell-mediated immunity.</a> Annu Rev Immunol. 16, 111-135 (1998).</li>
<li>Long, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN%CE%B3+and+CCL2+cooperate+to+redirect+tumor-infiltrating+monocytes+to+degrade+fibrosis+and+enhance+chemotherapy+efficacy+in+pancreatic+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">IFNγ and CCL2 cooperate to redirect tumor-infiltrating monocytes to degrade fibrosis and enhance chemotherapy efficacy in pancreatic carcinoma.</a> Cancer Discov. 6 (4), 400-413 (2016).</li>
<li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+regulatory+B+cells+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Res%22%5BJournal%5D)">The roles of regulatory B cells in cancer.</a> J Immunol Res. 2014, 215471(2014).</li>
<li>Eliopoulos, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40+induces+apoptosis+in+carcinoma+cells+through+activation+of+cytotoxic+ligands+of+the+tumor+necrosis+factor+superfamily%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">CD40 induces apoptosis in carcinoma cells through activation of cytotoxic ligands of the tumor necrosis factor superfamily.</a> Mol Cell Biol. 20 (15), 5503-5515 (2000).</li>
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<li>Phiri, M. J., Mofokeng, J. P., Phiri, M. M., Mngomezulu, M., Tywabi-Ngeva, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical%2C+thermal+and+morphological+properties+of+polybutylene+succinate-waste+pineapple+leaf+fibres+composites%5BTitle%5D)+AND+%22Heliyon%22%5BJournal%5D)">Chemical, thermal and morphological properties of polybutylene succinate-waste pineapple leaf fibres composites.</a> Heliyon. 9 (11), 21238(2023).</li>
<li>Zhou, C., Yu, M., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparation+of+three+measuring+methods+for+thermodynamic+stability+of+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Test+Technol+Instruments%22%5BJournal%5D)">Comparation of three measuring methods for thermodynamic stability of protein.</a> Anal Test Technol Instruments. 27 (04), 252-259 (2021).</li>
<li>Hou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salidroside+intensifies+mitochondrial+function+of+CoCl2-damaged+HT22+cells+by+stimulating+PI3K-AKT-MAPK+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Phytomedicine%22%5BJournal%5D)">Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway.</a> Phytomedicine. 109, 154568(2023).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salidroside%2C+a+phenyl+ethanol+glycoside+from+Rhodiola+crenulata%2C+orchestrates+hypoxic+mitochondrial+dynamics+homeostasis+by+stimulating+Sirt1%2Fp53%2FDrp1+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ethnopharmacol%22%5BJournal%5D)">Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling.</a> J Ethnopharmacol. 293, 115278(2022).</li>
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</ol>

저자는 밝힐 것이 없습니다.

열 이동 분석 또는 열 형광 분석으로도 알려진 DSF는 느리고 프로그래밍된 온도 상승 동안 테스트 샘플 또는 염료의 형광 신호 변화를 모니터링하여 샘플에서 단백질의 열 변성 과정을 감지하는 데 사용되는 기술입니다. Pantoliano14에 의해 처음 확립된 DSF는 고처리량 방법 역할을 합니다. 주요 절차에는 컴퓨터로 제어되는 가열판의 온도를 높이고, 장파장 자외선 램프를 사용하여 여기광을 방출하고, 전하 결합 장치 위상 형성 카메라를 통해 형광 염료가 단백질에 결합할 때 발생하는 형광 신호 강도의 변화를 캡처하는 것이 포함됩니다.
단백질의 상위 수준 구조를 특성화하는 중요한 지표인 Tm 값은 온도 상승 시 단백질 약물의 변성의 절반에 해당하는 온도를 나타냅니다. Tm 값이 높을수록 단백질 변성에 대한 온도 요구 사항이 더 크다는 것을 의미하며, 이는 단백질 구조가 더 안정적임을 나타냅니다. Tm 값을 검출하기 위해 현재 인정된 방법은 1960년대에 시작된 시차 주사 열량계(DSC)입니다15. DSC는 테스트 대상 물체와 기준 물체에 전달되는 전력의 차이를 프로그래밍된 온도 제어 하에서 온도의 함수로 측정하여 흡수 및 방출되는 열의 양을 얻습니다. 이는 열 안정성 분석16,17을 위한 황금 표준입니다.
DSF는 DSC에 비해 세 가지 장점으로 인해 널리 사용되고 있습니다: (1) 시료 소비량 감소: DSC는 일반적으로 400 μL의 시료량이 필요한 반면 DSF는 20-25 μL만 필요합니다. (2) 더 넓은 농도 범위: DSC는 일반적으로 상당한 변성 피크를 얻기 위해 0.2-2 mg/mL의 단백질 농도가 필요한 반면, DSF는 0.005-200 mg/mL 범위의 시료를 분석할 수 있습니다. (3) 더 높은 시료 처리량: DSC는 한 번에 하나의 시료만 분석할 수 있는 반면 DSF는 최대 96개 이상의 시료를 동시에 스캔할 수있습니다 18. 이러한 장점으로 인해 DSF는 단백질 안정성, 단백질 구조 및 구조, 단백질-리간드 상호 작용, 단백질 안정제, 억제제, 보조 인자 등의 효과 연구에 널리 활용되고 있습니다.
DSF 및 DSC 외에도 여러 가지 다른 분자 상호 작용 기술이 존재합니다. 표면 플라즈몬 공명(SPR)은 두 매체의 계면에서 발생하는 광학 현상이며 광자 또는 전자에 의해 유도될 수 있습니다. 이는 빛이 광학적으로 밀도가 높은 매체에서 광학적으로 희박한 매체로 방출될 때 전체 반사를 포함합니다. 표면 플라즈몬 공명이 발생하는 각도는 SPR 각도로 알려져 있습니다. SPR 바이오센서는 SPR 각도의 변화를 활용하여 실시간으로 분자 간 상호 작용을 모니터링합니다19,20. MicroScale thermophoresis(MST)는 결합으로 인한 생체 분자의 크기, 전하 및 수화 층의 변화를 감지하여 생체 분자 상호 작용을 분석하는 기술입니다. 레이저가 켜지기 전, 켜는 동안, 그리고 켜진 후에 샘플 내부의 적외선 레이저에 의해 조사된 영역의 형광 변화를 기록하여 상대적으로 빠른 측정을 가능하게 합니다21. BLI(Bio-layer interferometry)는 간섭계 스펙트럼의 변위 변화를 추적하여 센서 표면 반응을 측정합니다. BLI 실험에서는 한 분자를 수중 센서 표면에 고정시켜 결합할 수 있는 다른 분자를 감지합니다. 결합 상호작용은 간섭 변위를 유도하고, 이 변위 변화의 실시간 모니터링은 결합 곡선(22)을 산출한다. 등온 적정 열량측정법(ITC)은 생체 분자 결합 중에 방출되거나 흡수되는 열을 직접 측정하여 생체 분자 상호 작용을 정량화합니다. 분자 상호 작용에 대한 포괄적인 열역학 정보를 제공합니다23. 이러한 분자 상호 작용 기술과 비교할 때 DSF는 기기, 소모품 및 작동 기술에 대한 요구 사항이 낮습니다. 대부분의 실험실에서 화합물과 단백질 간의 상호 작용을 효율적으로 감지할 수 있습니다.
DSF 기술의 작동 절차는 비교적 간단합니다. 처음에는 백질 샘플, 반응 완충액, 형광 염료 및 후보 리간드가 반응 시스템으로 결합됩니다. 그런 다음 이 시스템은 형광 측정을 위한 가열 및 검출 조건이 설정되는 형광 PCR 기기로 전송됩니다(24,25). DSF에 가장 일반적으로 사용되는 단백질 염료는 현재 주황색 염료이며, 검출 기기는 일반적으로 형광 정량 PCR 기기(26)이다. 그러나 오렌지 염료의 여기 파장은 470nm이고 방출 파장은 570nm이기 때문에 시중에 나와 있는 모든 형광 정량 PCR 기기가 완벽하게 일치하는 것은 아닙니다. 따라서 이 연구는 단백질-리간드 상호 작용을 탐색하기 위한 새로운 검출 장비로 형광 마이크로플레이트 리더를 채택합니다.
이 접근법은 형광 정량 PCR 기기를 사용하는 DSF에 비해 두 가지 주요 이점을 제공합니다. 첫째, 형광 효소 마커의 파장 범위를 사용자 정의할 수 있어 염료의 파장 범위와 더 호환되고 보다 정확한 형광 검출을 보장할 수 있습니다. 둘째, 형광 정량 PCR 기기의 프로그램은 한 번 시작하면 중단할 수 없어 가열 공정 중 문제를 해결하기가 어렵습니다. 대조적으로, 형광 마이크로플레이트 리더는 검출 프로세스 전반에 걸쳐 시스템 비율과 검출 조건을 반복적으로 수정하여 간섭을 제거할 수 있습니다. 그러나 DSF용 형광 마이크로플레이트 리더를 사용하면 특정 단점이 있는데, 특히 기존 DSF는 일반적으로 20-25μL의 시료를 사용하는 반면 일반적으로 50-200 μL에 이르는 상대적으로 많은 양의 시료가 필요하다는 단점이 있습니다.
이 기사에서는 5-20 μg/mL 농도 범위 내에서 CD40 단백질과 umbelliferone을 사용하여 Tm을 검출하기 위해 형광 마이크로플레이트 리더를 기반으로 한 DSF의 검증을 수행했습니다. 그 결과 이 방법의 높은 특이성과 정확성이 입증되어 Tm 검출에 대한 적합성을 확인했습니다. 이후 서로 다른 시료 농도에서 Tm 검출 결과를 비교한 결과, 농도가 증가함에 따라 CD40 단백질의 Tm 값이 감소하는 추세가 나타났으며, 이는 Tm 검출에 대한 잠재적 농도 효과를 시사합니다(그림 3). 또한, 이 연구는 추가 전과 비교하여 시스템에 umbelliferone을 추가한 후 CD40 단백질의 Tm 값이 증가한 것을 감지했습니다. 이것은 umbelliferone가 CD40 단백질에 묶는 기능을 소유한다는 것을 나타내, 그들의 조합에 CD40 단백질의 열 안정성에 있는 증진으로 이끌어 내기로.
프로토콜의 중요한 단계는 2.7 단계에서 2.16 단계로 확인되었으며, 이 단계를 성공적으로 완료하면 단백질 형광의 후속 검출에 직접적인 영향을 미칩니다. 요약하면, 이 연구는 CD40 단백질과 umbelliferone을 예로 들어 DSF 기술 원리를 기반으로 하는 새로운 DSF 검출 방법을 확립했습니다. 이 방법은 형광 마이크로플레이트 리더를 사용하여 단백질과 리간드 사이의 결합력을 효과적으로 분석했습니다. 또한 이 기술은 단백질 안정성 분석 및 단백질 구조 연구로 확장될 수 있으며, 세포 신호 전달 경로 연구 및 질병 발병 기전 탐구에 DSF 기술의 적용을 심화할 수 있습니다.

비카티아 티베티카(Vicatia thibetica ) H. Boissieu는 티베트 의학에서 일반적으로 사용되며, 5가지 기본 성분(Polygonatum sibiricum Delar. ex Redoute, Asparagus cochinchinensis (Lour.) Merr, Vicatia thibetica H. Boissieu, Oxybaphus himalaicus Edgew. 및 Gymnadenia conopsea (L.) R. Br.) 1. 주로 윈난성 북서부, 쓰촨성 서부, 티베트 및 기타 지역과 같은 중국 남서부에 분포하며 말린 뿌리는 Angelica1의 현지 대체품 역할을합니다. 향기로 유명한 뿌리는 종종 스튜 조미료로 사용되며, 티베트 셀러리라고 불리는 잎은 맛있는 요리에 기여합니다. 따라서 Vicatia thibetica 는 독특한 약용 식물뿐만 아니라 티베트의 식품 공급원으로도 중요합니다.
국내외 연구에 따르면 Vicatia thibetica는 혈액 보충 및 기(힘 또는 에너지) 활력을 주는 특성을 가지고 있어 월경 조절에 도움이 됩니다. 두근거림항진과 혈액 결핍으로 인한 불규칙한 월경통의 증상을 해결하기 위해 사용되며, 신체 면역의 항산화 조절과 같은 약리학적 효과를 나타낸다2. 비카티아 티베티카(Vicatia thibetica)의 알코올 추출물은 사이클로포스파마이드(cyclophosphamide)에 의해 유발된 면역력이 저하된 쥐의 체질량과 장기 지수를 회복하는 능력을 입증했습니다. 또한 혈청 내 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제의 활성을 증가시키고 말론디알데히드의 함량을 감소시켜 항산화 능력의 향상과 지질 과산화 2,3에 대한 균형 효과를 시사합니다. 동시에 혈액 세포와 헤모글로빈의 수를 증가시켜 신체의 조혈 기능을 객관적으로 반영할 뿐만 아니라 면역 체계에 중요한 역할을 합니다 2,3.
침상 결정과 쓴 맛이 특징인 Umbelliferone은 분자량이 작고 휘발성이며 증기로 증류할 수 있습니다. 그것은 쉽게 승화하고 물에 대한 용해도가 낮고 유기물에 대한 용해도가 높습니다. Vicatia thibetica의 주요 화학 성분 중 하나인 umbelliferone은 하이드로코르티손 유도 면역억제 마우스 모델 4,5에서 세포 면역, 체액성 면역 및 비특이적 면역에 대한 면역조절 효과를 나타냅니다.
종양괴사인자 수용체 슈퍼패밀리(tumor necrosis factor receptor superfamily)의 구성원인 세포 표면 분자 CD40은 면역 세포에서 널리 발현됩니다6. CD40L이라고도 하는 상동 리간드인 CD154는 활성화된 T 림프구에 의해 발현되는 II형 막관통 단백질입니다. CD40 활성화는 수지상세포(DC)와 단핵구의 표면에서 공동 자극 분자의 발현을 상향 조절할 수 있는 능력을 가지고 있습니다. 이 과정은 주요 조직적합성 복합체(MHC) 분자의 항원 제시 기능을 촉진하고 CD8+ T 세포를 더욱 활성화시킨다7.
대식세포는 종양 미세환경의 형성과 조절에 중요한 역할을 하며, CD40 활성화는 대식세포에 의한 종양 미세환경의 리모델링을 향상시킬 수 있다8. CD40 신호 활성화는 B 세포의 증식과 활성화에 큰 영향을 미칩니다. B 세포는 CD40에 의해 활성화될 때 효과적인 항원 제시 세포로 기능할 수 있습니다. 이들은 항원을 제시하고, effector T cell 활성을 생성하며, 이에 따라 항종양 효과에 기여한다9. 또한, 종양 세포에서 CD40 활성화는 세포사멸을 유도하고 종양 성장을 억제할 수 있다10. CD40은 주로 Lyn, Fyn, Syk 등을 포함한 비수용체 티로신 단백질 키나아제의 활성을 조절하여 신호를 전달합니다. 또한 Bcl-xL, Cdk4 및 Cdk6 단백질을 자극하고, Rel/NF-kB 전사 인자를 활성화하고, CG-2 및 PI3K10을 인산화하는 능력이 있습니다.
DSF(Differential Scanning Fluorescence) 방법은 완충액 조성, 온도 및 저분자 리간드와 같은 다양한 환경 조건이 단백질 구조의 열적 안정성에 미치는 영향을 평가하는 데 널리 사용됩니다. DSF에 일반적으로 사용되는 염료는 주황색, 환경에 민감한 소수성 염료입니다. 정상적인 조건에서는 단백질 구조가 접혀 내부적으로 소수성 세그먼트가 숨겨집니다. 온도가 상승함에 따라 단백질의 소수성 영역이 더 많이 노출되어 자연 단백질 구조가 점진적으로 파괴됩니다. 염료는 이 노출된 단백질 부분에 선택적으로 결합하여 형광을 증폭합니다. 그런 다음 형광 신호 검출(11)의 변화를 모니터링하여 Tm 값을 계산합니다. 어느 정도까지, Tm 값의 변화는 돌연변이, 완충액의 변화 또는 리간드 결합으로 인한 단백질 안정성의 변화를 측정할 수 있습니다. 또한, 단백질 접힘 과정(protein folding process) 동안의 구조적 변화를 나타낼 수 있다12. 이 접근법은 정확한 데이터, 넓은 온도 범위, 높은 감도 및 최소한의 단백질 샘플 손실을 제공합니다13.
이 연구에서는 형광 정량 중합효소 연쇄 반응(PCR) 장치 대신 형광 마이크로플레이트 리더를 사용하여 형광 측정을 수행했습니다. 이러한 수정을 통해 형광 정량 PCR 기기가 없는 실험실에서 DSF를 검출할 수 있으므로 분석법이 덜 복잡해지고 기기 설정에 필요한 단계가 줄어들어 실험 프로세스가 간소화됩니다. 그러나 이 방법에는 몇 가지 단점이 있습니다. 복잡성은 줄어들지만 절차는 더 번거로워집니다. 다양한 온도에서 수동 형광 검출이 필요하며, 시스템에서 형광을 자동적이고 지속적으로 수집할 수 없습니다. 따라서 이 연구는 DSF 기술을 활용하여 CD40 단백질과 움벨리페론 사이의 상호 작용을 탐구하여 티베트 의학의 분자 메커니즘에 대한 새로운 통찰력을 제공했습니다.

<table><tbody><tr><td>CD40 단백질</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-P75408</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td><td>PYG0040</td><td></td></tr><tr><td>FlexStation 3 다기능 마이크로플레이트 리더</td><td>Shanghai Meigu Molecular Instruments Co., LTD</td><td>FlexStation 3</td><td></td></tr><tr><td>OriginPro 8 소프트웨어</td><td>OriginLab Corporation</td><td>v8.0724(B724)</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수( 1x)</td><td>Gibco</td><td>8120485</td><td></td></tr><tr><td>SoftMax Pro 7.1</td><td>Shanghai Meigu Molecular Instruments Co., LTD</td><td>SoftMax Pro 7.1</td><td></td></tr><tr><td>SSYPRO 오렌지 염료</td><td>Sigma</td><td>S5942</td><td></td></tr><tr><td>Umbelliferone</td><td>Shanghai Yuanye Biotechnology Co.</td><td>B21854</td><td></td></tr></tbody></table>

differential scanning fluorescence를 통한 cd40 단백질-umbelliferone 상호작용 검출

Detection of CD40 Protein-Umbelliferone Interaction via Differential Scanning Fluorescence

서로 다른 분자 간의 상호 작용에 대한 조사는 질병 발병 기전을 이해하고 약물 표적을 스크리닝하는 데 중요한 측면입니다. 티베트 의학 Vicatia thibetica의 활성 성분인 Umbelliferone은 메커니즘을 알 수 없는 면역 조절 효과를 나타냅니다. CD40 단백질은 면역 반응의 핵심 표적입니다. 따라서 본 연구는 시차주사형광기술의 원리를 이용하여 형광효소마커를 이용하여 CD40 단백질과 움벨리페론의 상호작용을 분석한다. 초기에 단백질 형광 오렌지 염료의 안정성을 실험적으로 검증하고 1:500의 최적 희석 비율을 결정했습니다. 그 결과, CD40 단백질의 온도 용융(Tm) 값이 농도가 증가함에 따라 감소하는 경향이 있음을 관찰했습니다. 흥미롭게도, CD40 단백질과 umbelliferone 사이의 상호 작용은 CD40 단백질의 열 안정성을 향상시키는 것으로 밝혀졌습니다. 이 연구는 형광 마이크로플레이트와 형광 염료를 사용하여 저분자 화합물 및 단백질의 결합 잠재력을 감지하려는 최초의 시도입니다. 이 기술은 높은 감도와 정확성이 특징이며 단백질 안정성, 단백질 구조 및 단백질-리간드 상호 작용 분야에서 유망한 발전을 약속하여 추가 연구 및 탐색을 용이하게 합니다.

주황색 염료는 실온 및 고온 모두에서 Ex = 470 nm 및 Em = 570 nm에서 안정적인 형광 여기를 일관되게 나타냈습니다. 1:500의 최적 희석 비율이 결정되었습니다(그림 2A,B). CD40 단백질의 농도가 15μg/mL 미만일 때는 Tm 값을 검출하기가 어려웠습니다(그림 3A,B). 그러나 15μg/mL의 농도에서는 51.82°C의 안정적인 Tm 값이 검출되었으며, CD40 단백질 농도가 증가함에 따라 45.79°C로 감소했습니다(그림 3C,D).

그림 3에서 묘사된 바와 같이, umbelliferone에 결합하는 CD40 단백질이 CD40 단백질의 Tm 가치에 영향을 미친다는 것은 명백하다. 구체적으로, 15 μg/mL 및 20 μg/mL 농도의 CD40 단백질과 10 μM umbelliferone의 Tm 값은 각각 62.08 °C 및 65.27 °C로 증가했습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66610/66610fig1.jpg"> 그림 1: 프로토콜 개요. 형광 마이크로플레이트 리더를 사용하여 DSF 원리에 따라 CD40 단백질의 umbelliferone에 대한 결합 용량을 기록하는 과정의 순서도. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66610/66610fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66610/66610fig2.jpg"> 그림 2: 오렌지 염료 희석 비율 스크리닝 및 안정성 테스트. (A) 실온에서 희석 비율이 다른 염료의 형광 안정성. (B) 35-95 °C에서 1:500의 희석 비율을 가진 염료의 형광 안정성. 오차 막대는 평균 ± SEM, n = 4를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66610/66610fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66610/66610fig3.jpg"> 그림 3: DSF 원리에 따라 형광 마이크로플레이트 리더를 사용하여 CD40 단백질과 umbelliferone의 결합 용량을 기록한 결과 플롯. (A-D) 각각 5 μg/mL, 10 μg/mL, 15 μg/mL, 20 μg/mL CD40 단백질 및 CD40 + 10 μM umbelliferone의 Tm 프로필. 오차 막대는 평균 ± SEM, n = 4를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66610/66610fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 프로토콜은 화합물과 단백질 분자 간의 결합을 검출하는 고유한 방법을 설명하며, 단백질 샘플 손실을 최소화하고 데이터 정확도가 높다는 이점을 제공합니다.

Differential Scanning Fluorescence를 통한 CD40 단백질-Umbelliferone 상호작용 검출

The investigation of interactions between different molecules is a crucial aspect of understanding disease pathogenesis and screening for drug targets. ...

당사의 프로토콜은 특수 장비 없이 사용할 수 있도록 함으로써 상당한 이점을 제공합니다. 기존의 형광 정량 PCR 방법과 달리 실험 과정을 단순화하여 더 적은 단계를 필요로하고 전반적인 복잡성을 줄여 더 안전하고 쉽게 수행 할 수 있습니다. 이 실험을 위해서는 작업자가 실험 절차와 형광 마이크로플레이트 리더에 매우 익숙해야 하며 용액 가열 및 형광 검출 중에 너무 많은 시간을 낭비하지 않아야 합니다.우리는 umbelliferone이 CD14 단백질에 결합하여 면역 효과를 일으키는 분자 메커니즘에 초점을 맞출 것입니다.

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Differential Scanning Fluorescence를 통한 CD40 단백질-Umbelliferone 상호작용 검출

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