Name: Enhancing Density Maps by removing the majority of particles in single particle cryyogenic electron microscopy final stacks(단일 입자 극저온 전자 현미경 최종 스택에서 대부분의 입자를 제거하여 밀도 맵 향상) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-10T14:35:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: 학습하세요 CryoSieve를 활용한 단일 입자 극저온 전자 현미경 데이터 처리 방법을. 불필요한 입자를 제거하여 고해상도 밀도 맵을 재구성하고 구조생물학 연구의 정확성을 향상시키는 이 계산 방법을 탐색하세요.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 연구는 Shenzhen Academy of Research and Translation(M.H.까지), Advanced Innovation Center for Structural Biology(M.H.까지), Beijing Frontier Research Center for Biological Structure(M.H.까지), National Key R&D Program of China(No.2021YFA1001300)(C.B.까지), National Natural Science Foundation of China(No.12271291)(C.B.까지)의 지원을 받았습니다. 및 중국 국립 자연 과학 재단 (No.12071244) (Z.S.).

1. 설치
<ol><li>GPU 가속 환경 확인 및 구성<ol><li>터미널을 열고 nvidia-smi 명령을 입력합니다. 명령이 GPU 카드에 대한 모든 정보를 성공적으로 표시하고 CUDA 버전이 10.2보다 높은지 확인합니다. conda -V 명령을 실행하여 Conda가 설치되어 있는지 확인합니다(보충 그림 1).</li>
	</ol></li>
	<li>가상 환경 구성<ol><li>conda create -n CRYOSIEVE_ENV python=3.8 cudatoolkit=10.2 cupy=10.0 pytorch=1.10 -c pytorch -c conda-forge 명령을 입력하여 가상 환경을 설정하고 CRYOSIEVE_ENV 원하는 환경 이름으로 바꿉니다. 환경이 성공적으로 구성될 때까지 몇 분 동안 기다립니다(보충 그림 2). 참고: 사용자는 필요에 따라 환경 이름을 유연하게 수정할 수 있습니다. 제공된 명령은 CUDA 10.2에만 해당됩니다. 다른 CUDA 버전이 필요한 경우 cudatoolkit의 버전 번호를 조정하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>CryoSieve 설치<ol><li>conda activate CRYOSIEVE_ENV 명령을 실행하여 환경을 활성화합니다. pip install cryosieve 또는 conda install -c mxhulab cryosieve를 실행하여 소프트웨어를 설치합니다(보충 그림 3). cryosieve -h를 입력하고 도움말 정보가 올바르게 표시되는지 확인합니다(보충 그림 4).</li>
	</ol></li>
</ol>2. 입자 체질
<ol><li>데이터 검색<ol><li>EMPIAR에서 EMPIAR-10097 최종 스택 데이터셋을 다운로드합니다( 재료 표 참조). Github에서 스타 파일, 마스크 파일(mask.mrc) 및 초기 모델(재추정 단계의 경우, initial.mrc)을 다운로드합니다( 재료 표 참조). 이러한 모든 파일을 폴더에 함께 배치합니다(보충 그림 5). 참고: https://github.com/mxhulab/cryosieve-demos 의 저장소는 Git 대용량 파일 저장소(Git LFS)를 사용합니다. Git LFS를 설치하는 것은 전체 리포지토리를 복제하는 데 필수적입니다. 또는 GitHub 링크를 통해 파일에 액세스하고 원시 파일 다운로드 버튼을 클릭하여 개별 파일을 다운로드합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>공정 입자 스크리빙<ol><li>터미널을 열고 cd FILEPATH 명령을 사용하여 데이터 세트가 있는 폴더로 이동합니다. conda activate CRYOSIEVE_ENV를 사용하여 Conda 환경을 활성화합니다.</li>
		<li>다음 명령을 입력하여 입자 선별 실험을 시작합니다: cryosieve --reconstruct_software relion_reconstruct --postprocess_software relion_postprocess --i T40_HA_130K-Equalized_run-data_CryoSPARC_refined.star --o output/ --mask mask.mrc --angpix 1.3099979 --num_iters 10 --frequency_start 40 --frequency_end 3 --retention_ratio 0.8 --sym C3 --num_gpus 1 --balance (보충 그림 5). 실행하는 동안 터미널은 각 반복에 대한 출력 로그를 표시합니다. 참고: 각 옵션에 대한 자세한 지침은 보충 파일 1에서 찾을 수 있습니다. 처리 시간 및 실행을 위한 최소 요구 사항은 보충 파일 2에 자세히 설명되어 있습니다. T40_HA_130K-Equalized_run-data_CryoSPARC_refined.star는 방향 추정 기술의 발전으로 인한 영향을 완화하기 위해 T40_HA_130K-Equalized_run-data.star(EMPIAR에서 다운로드)의 CryoSPARC에 의해 개선되었습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 최적의 반복 찾기
<ol><li>해상도 확인<ol><li>grep "+ FINAL RESOLUTION:" output/_postprocess*.txt 명령을 사용하여 10회 체질에 대한 해상도 결과를 인쇄합니다(그림 1). 7번째 반복에서 필터링된 입자 스택은 입자가 가장 적고 해상도가 가장 높기 때문에 최적의 결과를 제공할 수 있습니다. 참고: 폐기된 입자(15)에서 잔류된 입자(15)로의 의도하지 않은 정보 전달을 방지하고 입자 스택이 7번째 반복을 게시하는 것이 실제로 최적인지 확인하기 위해 사용자는 인근 반복에 대해 재추정 단계를 실행해야 합니다. 이 프로토콜에서는 반복 4, 5, 6, 7 및 8이 검증됩니다.</li>
	</ol></li>
	<li>체질된 입자 가져오기<ol><li>CryoSPARC 웹 인터페이스를 열고 다음 단계를 따르십시오. 작업 공간을 입력하고 패널 오른쪽 상단에 있는 빌더 버튼을 클릭합니다. 패널에서 Import Particle Stack 옵션을 선택하고 클릭합니다. 파티클 스택 가져오기 패널의 매개 변수 섹션에서 파티클 메타 경로를 완료된 결과의 출력 폴더에 있는 _iter{n}.star 파일로 지정하고 파티클 데이터 경로를 mrcs 파일이 저장된 폴더로 지정합니다. Queue Job 버튼을 클릭한 다음 Queue 버튼을 클릭하여 프로세스를 시작합니다. 재추정이 필요한 나머지 반복을 가져오는 데도 동일한 방법을 사용합니다(보충 그림 6A).</li>
	</ol></li>
	<li>초기 모델 가져오기<ol><li>패널의 오른쪽 상단에 있는 빌더 버튼을 클릭합니다. 패널에서 Import 3D Volumes 옵션을 선택하고 클릭합니다.</li>
		<li>볼륨 데이터 경로를 initial.mrc 파일로 지정합니다. Queue Job 버튼을 클릭한 다음 Queue 버튼을 클릭하여 프로세스를 시작합니다(보충 그림 6B). 참고: 초기 모델은 ab initio reconstruction(보충 파일 3)을 통해서도 생성할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>균질 미세 조정(빌드 작업)<ol><li>패널의 오른쪽 상단에 있는 빌더 버튼을 클릭합니다. 패널에서 Homogeneous Refinement 옵션을 선택하고 클릭합니다. 참고: Non-Uniform Refinement도 적용할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>Homogeneous refinement (입자 가져오기)<ol><li>왼쪽의 기본 패널에서 5번째 반복(또는 원하는 반복)의 파티클 스택을 가져오기 위한 작업을 엽니다. 메인 패널의 오른쪽에서 가져온 파티클 모듈을 드래그하여 오른쪽에 있는 빌더의 파티클 스택(Particle stacks) 섹션에 놓습니다. 메인 패널의 오른쪽 상단에 있는 빨간색 X 를 클릭하여 Import Particle Stack 작업을 닫습니다.</li>
		<li>3D 볼륨을 가져오기 위한 작업을 엽니다. 메인 패널의 오른쪽에서 가져온 볼륨 모듈을 드래그하여 오른쪽에 있는 빌더의 초기 볼륨 섹션에 놓습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>Homogeneous refinement(매개변수 수정)<ol><li>매개 변수 폴드에서 대칭 옵션을 찾아 C3으로 설정합니다. Force re-do GS split 옵션을 찾아 비활성화합니다. Queue Job 버튼을 클릭한 다음 Queue 버튼을 클릭하여 Homogeneous Refinement를 시작합니다. 동일한 방법을 사용하여 나머지 반복에 대해 Homogeneous Refinement를 수행합니다(보충 그림 6C-D). 참고: Force re-do GS split 옵션은 매우 중요합니다. 이 옵션을 비활성화하면 CryoSPARC가 스타 파일에서 제공하는 골드 스탠다드 분할을 유지하여 과적합을 방지합니다. Force Re-do GS Split을 비활성화하는 자세한 이유는 보충 파일 4에서 확인할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>결과를 얻으려면 모든 작업 실행이 완료될 때까지 기다립니다. 결과를 바탕으로 6차 반복에서 필터링된 입자 스택이 실제 최적의 결과임을 확인했습니다. 참고: 얻은 결과가 이 프로토콜에 제공된 결과와 약간 무작위 편차가 있는 것은 정상입니다. 이러한 편차는 전체 결론에 영향을 미치지 않습니다.</li>
</ol>

CryoSieve Particle Selection을 통한 Cryo-EM Map 품질 향상

<ol><li>Bai, X. C., Fernandez, I. S., Mcmullan, G., Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+structures+to+near-atomic+resolution+from+thirty+thousand+cryo-em+particles%5BTitle%5D)+AND+%22elife%22%5BJournal%5D)">Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-em particles.</a> elife. 2, 00461(2013).</li>
<li>Campbell, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movies+of+ice-embedded+particles+enhance+resolution+in+electron+cryo-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Movies of ice-embedded particles enhance resolution in electron cryo-microscopy.</a> Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+counting+and+beam-induced+motion+correction+enable+near-atomic-resolution+single-particle+cryo-em%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-em.</a> Nat Meth. 10 (6), 584-590 (2013).</li>
<li>Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cis+tem%2C+user-friendly+software+for+single-particle+image+processing%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Cis tem, user-friendly software for single-particle image processing.</a> eLife. 7, e35383(2018).</li>
<li>Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relion%3A+Implementation+of+a+bayesian+approach+to+cryo-em+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Str+Biol%22%5BJournal%5D)">Relion: Implementation of a bayesian approach to cryo-em structure determination.</a> J Str Biol. 180 (3), 519-530 (2012).</li>
<li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryosparc%3A+Algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-em+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Cryosparc: Algorithms for rapid unsupervised cryo-em structure determination.</a> Nat Meth. 14 (3), 290-296 (2017).</li>
<li>Kühlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+resolution+revolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The resolution revolution.</a> Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).</li>
<li>Dubochet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy+of+vitrified+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Quart+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy of vitrified specimens.</a> Quart Rev Biophys. 21 (2), 129-228 (1988).</li>
<li>Wagner, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphire-cryolo+is+a+fast+and+accurate+fully+automated+particle+picker+for+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Comm+Biol%22%5BJournal%5D)">Sphire-cryolo is a fast and accurate fully automated particle picker for cryo-EM.</a> Comm Biol. 2 (1), 218(2019).</li>
<li>Bepler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive-unlabeled+convolutional+neural+networks+for+particle+picking+in+cryo-electron+micrographs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Positive-unlabeled convolutional neural networks for particle picking in cryo-electron micrographs.</a> Nat Meth. 16 (11), 1153-1160 (2019).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deeppicker%3A+A+deep+learning+approach+for+fully+automated+particle+picking+in+cryo-em%5BTitle%5D)+AND+%22J+Str+Biol%22%5BJournal%5D)">Deeppicker: A deep learning approach for fully automated particle picking in cryo-em.</a> J Str Biol. 195 (3), 325-336 (2016).</li>
<li>Heimowitz, A., Andén, J., Singer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apple+picker%3A+Automatic+particle+picking%2C+a+low-effort+cryo-em+framework%5BTitle%5D)+AND+%22J+Str+Biol%22%5BJournal%5D)">Apple picker: Automatic particle picking, a low-effort cryo-em framework.</a> J Str Biol. 204 (2), 215-227 (2018).</li>
<li>Glaeser, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+good+can+single-particle+cryo-em+become%3F+What+remains+before+it+approaches+its+physical+limits%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">How good can single-particle cryo-em become? What remains before it approaches its physical limits.</a> Ann Rev Biophys. 48, 45-61 (2019).</li>
<li>Diiorio, M. C., Kulczyk, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+single-particle+cryo-electron+microscopy+%28cryo-em%29+processing+workflow+with+cryosparc%2C+relion%2C+and+scipion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-em) processing workflow with cryosparc, relion, and scipion.</a> J Vis Exp. (179), e63387(2022).</li>
<li>Zhu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+minority+of+final+stacks+yields+superior+amplitude+in+single-particle+cryo-em%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">A minority of final stacks yields superior amplitude in single-particle cryo-em.</a> Nat Comm. 14 (1), 7822(2023).</li>
<li>Zhou, Y., Moscovich, A., Bendory, T., Bartesaghi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unsupervised+particle+sorting+for+high-resolution+single-particle+cryo-em%5BTitle%5D)+AND+%22Inv+Probl%22%5BJournal%5D)">Unsupervised particle sorting for high-resolution single-particle cryo-em.</a> Inv Probl. 36 (4), 044002(2020).</li>
<li>Méndez, J., Garduno, E., Carazo, J. M., Sorzano, C. O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+incorrectly+oriented+particles+in+cryo-em+single+particle+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Str+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of incorrectly oriented particles in cryo-em single particle analysis.</a> J Str Biol. 213 (3), 107771(2021).</li>
<li>Tan, Y. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addressing+preferred+specimen+orientation+in+single-particle+cryo-em+through+tilting%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Addressing preferred specimen orientation in single-particle cryo-em through tilting.</a> Nat Meth. 14 (8), 793-796 (2017).</li>
<li>Rosenthal, P. B., Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+determination+of+particle+orientation%2C+absolute+hand%2C+and+contrast+loss+in+single-particle+electron+cryomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Optimal determination of particle orientation, absolute hand, and contrast loss in single-particle electron cryomicroscopy.</a> J Mol Biol. 333 (4), 721-745 (2003).</li>
<li>Kaur, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+computational+methods+to+improve+the+interpretability+and+analysis+of+cryo-em+maps%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">Local computational methods to improve the interpretability and analysis of cryo-em maps.</a> Nat Comm. 12 (1), 1240(2021).</li>
<li>Stagg, S. M., Noble, A. J., Spilman, M., Chapman, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reslog+plots+as+an+empirical+metric+of+the+quality+of+cryo-em+reconstructions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Str+Biol%22%5BJournal%5D)">Reslog plots as an empirical metric of the quality of cryo-em reconstructions.</a> J Str Biol. 185 (3), 418-426 (2014).</li>
<li>Vargas, J., Otón, J., Marabini, R., Carazo, J. M., Sorzano, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+alignment+reliability+in+single+particle+electron+cryomicroscopy%3A+A+general+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Particle alignment reliability in single particle electron cryomicroscopy: A general approach.</a> Sci Rep. 6 (1), 21626(2016).</li>
<li>Vargas, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+quality+assessment+and+sorting+for+automatic+and+semiautomatic+particle-picking+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Str+Biol%22%5BJournal%5D)">Particle quality assessment and sorting for automatic and semiautomatic particle-picking techniques.</a> J Str Biol. 183 (3), 342-353 (2013).</li>
<li>Vargas, J., Melero, R., Gomez-Blanco, J., Carazo, J. -M., Sorzano, C. O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+3d+alignment+quality%3A+Its+impact+on+soft-validation%2C+particle+pruning+and+homogeneity+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of 3d alignment quality: Its impact on soft-validation, particle pruning and homogeneity analysis.</a> Sci Rep. 7 (1), 6307(2017).</li>
<li>Carragher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+outcomes+when+optimizing+%27standard%27sample+preparation+for+single-particle+cryo-em%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Current outcomes when optimizing 'standard'sample preparation for single-particle cryo-em.</a> J Microsc. 276 (1), 39-45 (2019).</li>
<li>Drulyte, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+to+altering+particle+distributions+in+cryo-electron+microscopy+sample+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Sec+D%3A+Str+Biol%22%5BJournal%5D)">Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation.</a> Acta Crystallographica Sec D: Str Biol. 74 (6), 560-571 (2018).</li>
<li>Glaeser, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+good+can+cryo-em+become%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">How good can cryo-em become.</a> Nat Meth. 13 (1), 28-32 (2016).</li>
<li>Kim, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benchmarking+cryo-em+single+particle+analysis+workflow%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Benchmarking cryo-em single particle analysis workflow.</a> Front Mol Biosci. 5, 50(2018).</li>
<li>Weissenberger, G., Henderikx, R. J., Peters, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+invisible+hands+of+sample+preparation+for+cryo-em%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Understanding the invisible hands of sample preparation for cryo-em.</a> Nat Meth. 18 (5), 463-471 (2021).</li>
</ol>

다른 모든 저자는 상충되는 이해관계를 선언하지 않습니다.

Cryo-EM은 생물학적 분자의 구조를 규명하기 위한 중추적인 기술입니다. 이 과정에서는 현미경을 통한 데이터 수집 후 현미경 사진에서 입자를 추출한 후 여러 단계로 분류하여 최종 스택을 컴파일하는 것이 필수적입니다. 일반적인 과제는 손상되거나 바람직하지 않게 정렬된 입자가 우세하다는 것이며, 이는 고해상도 밀도 맵을 얻기 위해 반복적인 입자 선택의 필요성을 강조합니다. 따라서 입자 선택은 고품질 밀도 맵을 달성하기 위한 Cryo-EM SPA에서 중요한 단계입니다. 현존하는 입자 선택 기법은 통계적 비기울기 검증 알고리즘(22), z-점수 기반 접근법(23) 및 각도 정확도 추정 방법(24)을 포함한다.
CryoSieve는 이러한 맥락에서 최종 스택에서 상당한 수의 외부 입자를 제거하는 데 능숙한 유용한 도구로 부상합니다. 이러한 감소는 재구성의 계산 효율성을 향상시킬 뿐만 아니라 프로세스를 간소화합니다. 이는 입자 선택을 위한 포괄적인 제품군을 제공하며, 입자 폐기 정도와 그에 따른 분리능 개선은 초기 데이터 품질과 데이터 처리에 사용되는 방법론에 크게 좌우됩니다.
이 원고에서는 인플루엔자 헤마글루티닌 트리머(EMPIAR 항목: 10097)의 실제 사례 데이터 세트를 사용하여 입자 선별의 완전한 워크플로우를 제시했습니다. 여기에서 다루고 논의하는 단계는 입자 체질 및 포즈 재추정으로 요약할 수 있습니다. 최종 3D 재구성 볼륨은 3.62 Å의 해상도를 달성했으며, 알파 나선의 곁사슬은 게시된 밀도 맵에 비해 후처리 볼륨에서 더 선명했습니다.
CryoSieve는 GitHub(https://github.com/mxhulab/cryosieve)에서 사용할 수 있는 오픈 소스 방법입니다. 자세한 자습서는 홈페이지에서도 찾을 수 있습니다. 사용자는 자습서에 따라 설치하고 사용할 수 있습니다. 또한 cryosieve-csrefine 및 cryosieve-csrhbfactor의 두 가지 모듈이 제공됩니다. cryosieve-csrefine 모듈은 CryoSPARC(보충 파일 5) 내에서 다양한 작업의 순차적 실행을 자동화하도록 특별히 제작되었습니다. 이러한 작업에는 입자 스택 가져오기 및 ab initio, 균질 미세 조정 또는 불균일 미세 조정 작업 수행이 포함됩니다. 반면, cryosieve-csrhbfactor 모듈은 cryosieve-csrefine(보충 파일 6)의 기능을 활용하여 Rosenthal-Henderson B-factor의 측정을 자동화하도록 설계되었습니다.
현재 이 방법의 적용은 단일 형태 시나리오로 제한되어 있습니다. 결과적으로, 입자가 여러 형태를 나타내는 경우에는 해당 기능이 제한됩니다. 사용자는 정제된 입자 선택에 사용하기 전에 먼저 3D 분류에 참여하여 서로 다른 형태의 입자를 분리하는 것이 좋습니다. 더욱이, 이 방법은 최종 스택에서 입자의 50% 이상을 걸러내는 데 능숙함을 보여주지만, 이러한 폐기된 입자의 기원과 재구성 품질에 대한 기여도가 미미한 근본적인 이유는 불분명합니다. 이러한 이해의 차이로 인해 이러한 제한 사항을 포괄적으로 다루고 잠재적으로 수정하기 위한 추가 연구가 필요합니다.
입자 분류 또는 입자 체질에는 세 가지 가능한 기존 방법이 있습니다. 우선, cisTEM4는 3D 미세 조정 후 각 단일 입자 이미지에 대한 점수를 보고할 수 있습니다. 사용자는 cisTEM 점수를 사용하여 입자를 분류하여 입자를 버릴 수 있습니다. 각도 그래프 일관성(AGC) 접근법(17)은 또한 잘못 정렬된 입자를 버리는 방법이다. 또한, 비정렬 분류(non-alignment classification)5는 3D 분류를 사용하여 입자를 버리는 전통적인 방법이다. 우리는 이러한 방법으로 유지되는 입자의 품질을 CryoSieve와 비교한 결과 CryoSieve의 유지 입자가 더 높은 품질을 가지고 있음을 발견했습니다15. 여기에 제시된 방법은 다른 방법보다 성능이 훨씬 뛰어나며 동일한 해상도에서 가장 적은 수의 입자를 달성합니다.
결과에서 입증된 바와 같이 Cryo-EM 최종 스택에 있는 대부분의 입자는 밀도 맵 재구성에 기여하지 않습니다. 즉, 이미지 획득 중에 수집된 모든 입자 중에서 선택된 소수, 즉 가장 미세한 부분 집합만이 실제로 최종 재구성에 기여합니다. 결과적으로, 수집된 입자의 총 수에 대한 이 최종 하위 집합의 비율은 시료 품질을 평가하기 위한 정량적 지표 역할을 할 수 있습니다. 이 비율이 높을수록 샘플 품질이 좋아집니다. 구조 생물학자가 Cryo-EM에 더 쉽게 접근할 수 있도록 하는 기술 발전에도 불구하고 시료 전처리는 여전히 워크플로우의 주요 병목 현상입니다. 따라서 과학자와 공학자들은 이 도전에 노력을 집중하고 있다25. 단일 입자 분석(SPA)에서 시료 전처리는 시료 최적화와 그리드 전처리의 두 가지 중요한 단계로 구성됩니다. 전자는 최적의 생화학적 상태를 유지하면서 표본을 정제하는 것과 관련이 있습니다. 후자는 그리드의 화학적 또는 플라즈마 처리, 시료 증착 및 유리화를 포함하여 현미경에서 분석하기 위해 시료를 준비하는 것을 수반합니다. 고분자 불안정성을 해결하기 위해 수많은 기술이 제안되었지만, 한 접근법이 다른 접근법에 비해 효능은 샘플의 특성에 따라 다릅니다25,26. 현재 그리드 준비 결과는 사용자의 전문 지식과 경험에 크게 영향을 받기 때문에 프로세스에 시간이 많이 걸리고 까다로울 수 있습니다27,28. 시료 및 그리드 준비에서 발생하는 수많은 변수는 연구자들이 현미경을 사용하여 분자 수준에서만 시료를 평가할 수 있기 때문에 인과 관계를 설정하는 데 어려움을 초래합니다. 그 결과, 서로 다른 시료 및 그리드 전처리 프로토콜의 비교를 통한 정량적 통계는 여전히 부족하며, 추세를 조사하고 시료 거동의 기본 메커니즘을 이해하기 위해 체계적인 접근이 필요하다29.

극저온 전자 현미경(Cryo-EM) 단일 입자 분석(SPA)은 생물학적 거대분자의 고해상도 3차원 밀도 맵을 결정하는 지배적인 방법이 되었습니다. 분해능 혁명7이라고 불리는 일련의 기술 혁신 1,2,3,4,5,6 덕분에 Cryo-EM은 전례 없는 속도로 최대 원자 분해능으로 생물학적 거대분자의 구조를 결정할 수 있습니다. 이 돌파구는 분자 통찰력의 새로운 시대가 시작되었음을 의미하며, X선 결정학을 제치고 지배적인 기술로서 오랜 생물학적 질문에 답합니다.
Cryo-EM SPA는 생물학적 거대분자의 결정화가 필요하지 않다는 점에서 X선 결정학과 다릅니다. 대신, 표적 생물학적 거대분자를 포함하는 용액은 유리체 얼음에서 빠르게 동결됩니다. 그런 다음 전자빔으로 이미지화하여 일련의 현미경 사진을 생성하며, 결정화의 필요성을 우회합니다8. 그 후, 입자 선택 알고리즘을 사용하여 이러한 현미경 사진 4,9,10,11,12에서 개별 원시 입자를 추출합니다. Cryo-EM은 결정화에 의존하지 않기 때문에 추출된 입자가 주로 손상되거나 원치 않는 구조적 상태에 있는 것은 당연하며, 고분해능 밀도 맵을 얻기 위해 여러 차례의 입자 선택이 필요합니다. 따라서 Cryo-EM SPA 이미지 처리에서 입자 선택은 고해상도 밀도 맵을 얻는 데 매우 중요합니다13.
Cryo-EM SPA에서 표준 입자 선택 방법에는 2차원(2D) 및 3차원(3D) 분류14가 포함됩니다. 2D 분류는 입자를 사전 정의된 수의 그룹으로 분류하여 각 등급에 대한 평균 이미지와 예상 2D 해상도를 생성합니다. 그런 다음 연구원은 이러한 클래스를 육안으로 검사하여 저해상도 그룹에서 입자를 제거하고 나머지 입자를 더 높은 해상도를 얻기 위한 재구성에 사용할 수 있습니다. 미세 조정 알고리즘을 사용하여 입자 포즈가 설정되면 연구원들은 입자를 여러 클래스로 클러스터링하는 3D 분류를 진행합니다. 이를 통해 각 등급에 대해 재구성된 밀도 맵을 육안으로 검사할 수 있으며, 원치 않는 형태와 같은 원치 않는 입자를 제외할 수 있습니다. 여러 차례의 분류를 거친 후, 상대적으로 고품질의 입자로 구성된 최종 스택이 얻어집니다. 이러한 최종 스택은 원자 또는 거의 원자 해상도 밀도 맵을 생성하는 데 중요한 역할을 합니다.
Zhu와 그녀의 동료들은 이러한 최종 스택15에서 추가 입자 선택이 수행될 수 있음을 입증했습니다. 입자 선택을 위한 혁신적인 반복 방법인 CryoSieve15를 적용하여 입자 수를 크게 줄여 최종 밀도 맵의 품질을 향상시킬 수 있습니다. NCC(Normalized Cross-Correlation) 방법16, AGC(Angular Graph Consistency) 방법17 및 Non-alignment Classification5과 같은 다른 입자 분류 기준 및 소프트웨어가 현재 이 분야에서 사용되고 있지만, 이 방법은 효율성 측면에서 이러한 알고리즘을 능가하는 것으로 나타났습니다.
이 연구에서는 전체 프로세스에 대한 자세한 가이드를 제시합니다. 사례 연구로, 이 새로운 방법을 최종 스택에 130,000개의 입자를 포함하는 인플루엔자 헤마글루티닌 삼량체(EMPIAR 항목: 10097)18의 데이터 세트에 적용했습니다. 우리의 절차는 이 데이터 세트의 최종 스택에서 입자의 약 73.8%를 성공적으로 제거하여 재구성된 밀도 맵의 해상도를 4.11 Å에서 3.62 Å로 개선했습니다. 인플루엔자 헤마글루티닌 트라이머 외에도 여러 데이터 세트의 결과가 이전 간행물15에 제시되어 생체 분자의 다양한 해상도와 분자량을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>CryoSPARC</td><td>Structura Biotechnology Inc., 캐나다</td><td></td> 토론토 <td>CryoSPARC(Cryo-EM Single Particle Ab-Initio Reconstruction and Classification)는 단일 입자 초저온 전자 현미경(Cryo-EM) 데이터의 완전한 처리를 위한 최첨단 HPC 소프트웨어 솔루션입니다. CryoSPARC는 멤브레인 단백질, 바이러스, 복합체, 유연한 분자, 작은 입자, 위상 플레이트 데이터 및 음성 염색 데이터의 cryo-EM 구조를 해결하는 데 유용합니다.</td></tr><tr><td>EMPIAR-10097 데이터 세트</td><td></td><td>https://ftp.ebi.ac.uk/empiar/world_availability/10097/data/Particle-Stack/T40_HA_130K-Equalized-Particle-Stack.mrcs</td><td>이 데이터 세트는 40도 기울어진 수집 전략을 사용하여 수집된 매우 선호되는 방향을 특징으로 하는 인플루엔자 헤마글루티닌 삼량체의 단일 입자 cryo-EM 데이터로 구성됩니다.</td></tr><tr><td>initial.mrc</td><td></td><td>https://github.com/mxhulab/cryosieve-demos/tree/master/EMPIAR-10097</td><td></td></tr><tr><td>mask.mrc</td><td></td><td>https://github.com/mxhulab/cryosieve-demos/tree/master/EMPIAR-10097</td><td></td></tr><tr><td>RELION</td><td></td><td>4.0-beta-2</td><td>RELION(REgularised LIkelihood OptimisatioN)은 초저온 전자 현미경(cryo-EM) 데이터 처리, 특히 거대분자 정제를 위한 오픈 소스 소프트웨어입니다 구조. 베이지안 접근 방식을 활용하여 신호와 노이즈를 분리하는 데 탁월하여 고해상도 구조 결정을 가능하게 합니다. RELION은 단일 입자 분석, 단층 촬영 및 하위 단층 촬영 평균을 지원하며 효과와 사용자 친화적 인 인터페이스로 인해 구조 생물학에서 널리 사용되었습니다.</td></tr><tr><td>T40_HA_130K-Equalized_run-data_CryoSPARC_refined.star</td><td></td><td>https://github.com/mxhulab/cryosieve-demos/tree/master/EMPIAR-10097</td><td>EMPIAR-10097의 최종 입자 스택에 대한 메타데이터 파일</td></tr></tbody></table>

enhancing density maps by removing the majority of particles in single particle cryyogenic electron microscopy final stacks(단일 입자 극저온 전자 현미경 최종 스택에서 대부분의 입자를 제거하여 밀도 맵 향상)

Enhancing Density Maps by Removing the Majority of Particles in Single Particle Cryogenic Electron Microscopy Final Stacks

지난 10년 동안 극저온 전자 현미경(Cryo-EM) 단일 입자 분석(SPA) 분야의 기술 및 방법론의 발전으로 생물학적 거대분자의 고해상도 구조 검사 능력이 크게 향상되었습니다. 이러한 발전은 분자 통찰력의 새로운 시대를 열었으며, 지배적인 방법인 X선 결정학을 대체하고 생물학의 오랜 질문에 대한 답을 제공했습니다. Cryo-EM은 X선 결정학의 중요한 한계인 결정화에 의존하지 않기 때문에 다양한 품질의 입자를 캡처합니다. 결과적으로, 선택된 입자의 품질이 재구성된 밀도 맵의 해상도에 직접적인 영향을 미치기 때문에 입자의 선택이 매우 중요합니다. CryoSieve라고 하는 입자 선택을 위한 혁신적인 반복 접근 방식은 최종 스택의 입자 수를 효과적으로 줄여 재구성된 밀도 맵의 품질을 크게 향상시킵니다. 실험적 증거에 따르면 이 방법은 최종 스택에서 대부분의 입자를 제거할 수 있어 밀도 맵의 품질이 눈에 띄게 향상됩니다. 이 문서에서는 이 접근 방식의 자세한 워크플로를 간략하게 설명하고 실제 데이터 세트에 적용하는 방법을 소개합니다.

이 프로토콜에서는 이 프로세스의 효능을 입증하기 위해 인플루엔자 헤마글루티닌 삼량체 데이터 세트(EMPIAR 항목: 10097)를 활용했습니다. 샘플의 선호 방향으로 인해 데이터 수집을 위해서는 40°로 기울여야했습니다. 단백질은 C3 대칭성을 나타내며 분자량은 150kDa입니다.
최종 입자 스택을 처리하기 위해 앞에서 설명한 프로토콜을 구현했습니다. 각 반복에서 입자의 20%를 점진적으로 제거하여 머무름 비율이 80.0%, 64.0%, 51.2% 등의 결과를 얻었습니다. 그림 1과 그림 2에서 볼 수 있듯이, 잔류 입자의 분리능은 처음에는 개선되었지만 결국에는 감소했습니다. 반복 중에서 6번째 반복은 가장 적은 입자를 포함하면서도 가장 높은 해상도를 달성하는 가장 최적의 하위 집합으로 식별되었습니다. 당사의 알고리즘은 원래 스택의 26.2%만 포함하는 입자 하위 집합을 성공적으로 식별하여 그림 2와 같이 4.19 Å에서 3.62 Å(CryoSPARC로 재추정)로 분리능이 개선되었습니다. 또한 CryoSieve를 사용하기 전과 후의 밀도 맵을 그림 3에서 비교했습니다. 이 방법 전후에 재구성된 밀도 맵의 FSC(Model-to-map Fourier Shell Correlation) 곡선 및 하프맵 FSC 곡선도 표시됩니다(그림 3A-B). 얻어진 원시 밀도 맵과 날카로운 밀도 맵도 등가 윤곽 수준이 적용된 상태로 비교되었습니다(그림 3C). 날카로운 밀도 맵의 측쇄를 비교하여, 재구성된 밀도 맵의 향상을 보여주었습니다. 추정된 Rosenthal-Henderson B-factor는 입자 품질19의 기준에도 채택되었습니다. 최종 스택에서 대부분의 입자를 제거한 후 Rosenthal-Henderson B 계수는 226.9 Å2에서 146.2 Å2 로 증가했습니다(그림 3D). 국소 분해능, 국소 B-인자20 및 ResLog21도 비교에 사용되었으며, 이는 CryoSieve가 실제로 밀도 맵과 입자의 품질을 모두 향상시킨다는 것을 나타냅니다(그림 4). 
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66617/66617fig01.jpg"> 그림 1: 각 반복의 해결 방법. 보고된 해결 방법은 빨간색 상자로 강조 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66617/66617fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66617/66617fig02.jpg"> 그림 2: 각 반복의 해결 방법. 동종 미세 조정 작업으로 식별된 해상도는 빨간색 상자로 강조 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66617/66617fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66617/66617fig03.jpg"> 그림 3: 밀도 맵. (A) CryoSieve 사용 전과 후의 재구성된 밀도 맵의 모델-지도 FSC 곡선 비교. y축은 FSC를 나타내고 x축은 분해능을 나타냅니다. 빨간색 점선은 FSC의 임계값 0.5를 표시합니다. 수직 점선은 임계값 0.5 아래에서 얻은 밀도 맵의 해상도를 보여줍니다. (B) 하프맵 FSC 곡선은 CryoSplay를 통해 CryoShive를 사용하기 전과 후에 재구성된 밀도 맵에서 얻었습니다. y축은 FSC를 나타내고 x축은 분해능을 나타냅니다. (C) 원시 밀도 맵과 날카로운 밀도 맵은 CryoSieve 잔류 입자와 최종 스택의 전체 입자 세트 모두에 대해 표시되었습니다. 0.65의 등가 윤곽 수준이 원시 밀도 맵에 적용되었습니다. 0.84의 등가 윤곽 수준이 날카로운 밀도 맵에 적용되었습니다. 선명한 밀도 맵은 CryoSPARC에서 직접 얻었습니다. 날카로운 밀도 맵은 자동 후처리되었으며, 첫 번째 FSC 가중치가 적용되었습니다(CryoSPARC에서 제공한 FSC 기반). 그런 다음 자동 결정된 B-인자(최종 스택의 모든 입자에 대해 232.0 Å2 , CryoSieve의 경우 160.8 Å2 )를 사용하여 B-인자를 날카롭게 했습니다. 날카로운 밀도 맵의 측쇄를 비교하여 참조를 위해 원자 모델을 통합했습니다. 빨간색 화살표는 개선된 영역을 강조 표시합니다. (D) 추정된 Rosenthal-Henderson B 계수는 CryoSieve-retained 입자와 최종 스택의 전체 입자 세트 모두에 대해 표시되었습니다. y축은 사용된 입자의 수를 나타내고 x축은 해상도의 제곱의 역수를 나타냅니다. 위에서 아래로 이동할 때 각 점은 이전 점 입자의 절반을 나타냅니다. 결의안은 정제에 의해 결정되었습니다. B-요인은 피팅 곡선에 표시된 것처럼 측정된 점의 최소 제곱 근사치를 사용하여 결정되었습니다. 추정된 Rosenthal 및 Henderson의 B-인자는 범례에 표시되어 있습니다: 주황색은 CryoSieve에 의해 유지되는 입자를 나타내고, 파란색은 최종 스택의 모든 입자를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66617/66617fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66617/66617fig04.jpg"> 그림 4: 밀도 맵의 다양한 메트릭 비교. (A) CryoSpar에서 얻은 CryoSieve 사용 전과 후의 로컬 해상도 맵 비교. 로컬 해상도 범위는 7 Å(빨간색)에서 3.5 Å(파란색) 사이입니다. (B) [20-3.5] Å의 해상도 범위를 사용하여 LocBFactor로 얻은 로컬 B 인자 맵으로 채색된 CryoSieve를 사용하기 전과 후의 밀도 맵 비교. (C), CryoSpar로 얻은 CryoSieve 사용 전후의 ResLog 플롯 비교. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66617/66617fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
추가 그림 1: nvidia-smi 및 conda -V 명령을 사용하여 사전 요구 사항을 확인합니다. 사전 요구 사항이 충족되면 nvidia-smi 명령을 입력하면 GPU 드라이버 버전, CUDA 버전 및 GPU 카드의 상태가 표시됩니다. 마찬가지로 conda -V 명령을 입력하면 설치된 Conda 버전이 올바르게 표시되어야 합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66617/Supplementary_Figure_1.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 2: 새로운 GPU 가속 환경을 만드는 프로세스. Conda 환경을 만드는 데 사용되는 명령에 의해 생성된 출력이 화면에 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66617/Supplementary_Figure_2.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 3: GPU 가속 환경에서의 CryoSieve 설치. 새로 생성된 Conda 환경을 활성화한 후 화면에 Pip를 사용하여 CryoSieve를 설치하는 명령을 실행한 결과 출력이 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66617/Supplementary_Figure_3.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 4: 도움말 정보. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66617/Supplementary_Figure_4.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 5: 실행 중인 프로세스. 명령줄을 통해 CryoSieve를 실행하면 화면에 실행 중인 프로세스에 대한 정보가 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66617/Supplementary_Figure_5.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 6: CryoSPARC의 작업 구성. (A) 파티클 스택을 가져옵니다. (B) 3D 볼륨을 가져옵니다. (씨-디) 균질한 정교화. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66617/Supplementary_Figure_6.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 1: CryoSieve의 옵션. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66617/supplementary_1.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 2: Cryosieve를 실행하기 위한 처리 시간 및 최소 요구 사항. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66617/supplementary_2.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 3: CryoSPARC에 의한 초기 모델 생성. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66617/supplementary_3.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 4: 강제 재실행 GS 분할을 비활성화하는 이유. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66617/supplementary_4.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 5: cryosieve-csrefine의 옵션. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66617/supplementary_5.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 6: cryosieve-csrhbfactor의 옵션. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66617/supplementary_6.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Cryo-EM을 위한 고급 입자 선택 방법인 CryoSieve는 실제 데이터 세트에 적용하여 입증된 바와 같이 최종 스택에서 대부분의 입자를 제거하여 밀도 맵 해상도를 향상시킵니다.

Enhancing Density Maps by removing the majority of particles in single particle cryyogenic electron microscopy final stacks(단일 입자 극저온 전자 현미경 최종 스택에서 대부분의 입자를 제거하여 밀도 맵 향상)

Over the past decade, advancements in technology and methodology within the field of cryogenic electron microscopy (cryo-EM) single-particle analysis ...

극저온 전자 현미경은 생물학적 거대분자의 원자에 가까운 구조를 결정하는 데 필수적입니다. 수많은 저신호 대 잡음비 이미지의 평균화에 의존하고 있음에도 불구하고 특정 해상도에 필요한 최적의 입자 수는 아직 알려져 있지 않습니다. 이러한 제한은 시료 분석 및 전처리 방법의 진행을 방해합니다.이 문제를 해결하기 위해 반복 정렬 방법인 CryoSieve를 도입했습니다. 표준 프로토콜 선택에는 2차원 및 3차원 분류가 포함되며, Normalized Cross-correlation 방법, 각도 그래프 일관성 접근 방식 및 비정렬 분류와 같은 다른 프로토콜 정렬 기준이 현재 사용 중입니다. 광범위한 실험을 통해 CryoSieve가 다른 Cryo-EM 입자 분류 알고리즘보다 성능이 뛰어나 대부분의 입자가 최종 스택에서 필요하지 않다는 사실이 밝혀졌습니다.최종 스택에 남아 있는 소수의 입자는 재구성 밀도 맵에서 매우 높은 해상도의 진폭을 생성합니다. 일부 데이터 세트의 경우 가장 미세한 부분 집합의 크기가 이론적 한계에 근접합니다. Cryo-EM에서 시료 전처리는 워크플로우를 방해합니다.프로토콜 비교를 위한 표준 메트릭이 없기 때문에 수집된 입자에 대한 선택된 입자의 비율이 품질 메트릭으로 사용될 수 있습니다. 그들의 공간적, 시간적 분포를 조사하는 것은 또한 준비 효과에 대한 주요 물리적 요인을 강조할 수 있습니다.

enhancing-density-maps-removing-majority-particles-single-particle

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 논문은 소프트웨어 스위트 인 SPHIRE를 사용하여 저온 EM 이미지를 처리하기위한 프로토콜을 제시합니다. 현재의 프로토콜은 원 자면 해상도를 목표로하는 거의 모든 단일 파티클 EM 프로젝트에 적용될 수 있습니다.

SPHIRE를 사용한 전자 저온 현미경 이미지의 고해상도 단일 입자 분석

극저온 전자 현미경 검사법의 단일 입자 분석은 고해상도에서 생물학적 앙상블의 구조를 결정하는 데 사용되는 주요 기술 중 하나입니다. Scipion은 현미경에 의해 획득된 정보를 처리하고 생물학적 표본의 3D 재구성을 달성하기 위해 전체 파이프라인을 만드는 도구를 제공합니다.

Scipion을 가진 극저온 EM 및 단일 입자 분석

극저온을 이용한 거대 분자 복합체의 구조 결정은 단백질과 복합체의 특정 클래스에 대한 일상이되었습니다. 여기서이 파이프 라인은 요약 (샘플 준비, 스크리닝, 데이터 수집 및 처리) 독자는 더 어려운 표본의 경우 변경 될 수있는 추가 상세한 자원과 변수를 향해 지시된다.

단일 입자 저온 전자 현미경 검사법: 샘플에서 구조로

단일 입자 냉동 전자 현미경 검사법은 고처리량 자동 데이터 수집을 위한 적합한 소프트웨어 패키지 및 사용자 친화적인 파이프라인을 요구합니다. 여기서는 완전 자동화된 이미지 수집 소프트웨어 패키지인 Latitude-S의 적용과 저용량 조건에서 유리화된 생체 분자의 데이터 수집을 위한 실용적인 파이프라인을 소개합니다.

단일 입자 극저온 전자 현미경 검사법을 위한 사용자 친화적이고 높은 처리량 및 완전 자동화된 데이터 수집 소프트웨어

이 문서에서는 3개의 cryo-EM 처리 플랫폼(예: cryoSPARC v3, RELION-3 및 Scipion 3)을 효과적으로 활용하여 고해상도 구조 결정을 위한 다양한 단일 입자 데이터 세트에 적용할 수 있는 단일하고 강력한 워크플로우를 만드는 방법을 설명합니다.

cryoSPARC, RELION 및 Scipion을 사용한 견고한 단일 입자 Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) 처리 워크플로우

거대분자의 고분해능 cryo-EM 맵은 또한 200kV TEM 현미경을 사용하여 달성할 수 있다. 이 프로토콜은 200kV TEM을 사용하여 고해상도 데이터 세트를 성공적으로 수집하는 데 필수적인 정확한 광학 정렬, 데이터 수집 체계 및 이미징 영역 선택을 설정하는 모범 사례를 보여줍니다.

200KV 투과 전자 현미경을 사용한 고해상도 cryo-EM 데이터 세트의 일상적인 수집

본 프로토콜은 Cryo-EM 실험에서 기울어진 단일 입자 데이터 수집을 위한 일반화되고 구현하기 쉬운 체계를 설명합니다. 이러한 절차는 공기-물 계면의 부착으로 인해 우선적인 방향 편향을 겪는 샘플에 대한 고품질 EM 맵을 얻는 데 특히 유용합니다.

Leginon을 사용한 스테이지 틸트를 이용한 단일 입자 Cryo-EM 데이터 수집

극저온 전자 현미경(cryoEM) 그리드에 지지층을 적용하면 입자 밀도를 높이고, 공기-물 계면과의 상호 작용을 제한하고, 빔 유도 동작을 줄이고, 입자 배향 분포를 개선할 수 있습니다. 이 백서에서는 cryoEM 그리드를 그래핀 단층으로 코팅하여 cryo-sample 전처리를 개선하기 위한 강력한 프로토콜에 대해 설명합니다.

고분해능 구조 측정을 위해 Monolayer Graphene을 Cryo-Electron Microscopy Grid에 적용

이 프로토콜은 시료 전처리 최적화를 통해 불균일한 입자 분포를 해결하기 위한 Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5)를 예로 사용하는 실용적인 방법을 제시하며, 연구자가 극저온 전자 현미경(cryo-EM)을 사용하여 고분자 구조를 효율적으로 규명할 수 있는 참고 자료를 제공합니다.

극저온 전자 현미경을 위한 시료 전처리 최적화

단일 입자 수준에서 바이러스성 퓨전 속도론의 측정 방법

학습하세요 CryoSieve를 활용한 단일 입자 극저온 전자 현미경 데이터 처리 방법을. 불필요한 입자를 제거하여 고해상도 밀도 맵을 재구성하고 구조생물학 연구의 정확성을 향상시키는 이 계산 방법을 탐색하세요.

Enhancing Density Maps by removing the majority of particles in single particle cryyogenic electron microscopy final stacks(단일 입자 극저온 전자 현미경 최종 스택에서 대부분의 입자를 제거하여 밀도 맵 향상) (동영상) | JoVE Journal

Enhancing Density Maps by removing the majority of particles in single particle cryyogenic electron microscopy final stacks(단일 입자 극저온 전자 현미경 최종 스택에서 대부분의 입자를 제거하여 밀도 맵 향상)

더 많은 동영상 탐색