Name: 공동 배양에서 Desmoplastic Three-dimensional Pancreatic Cancer Spheroids 성장 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 42 s
Description: 학습하세요 췌장암 연구를 위한 3D 공동 배양 기법으로 섬유성 종양 미세환경을 재현하는 방법을. 환자 유래 세포와 면역 세포를 통합하여 치료제 선별 및 종양 성장 기전 연구에 활용할 수 있습니다.

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1. 2D 세포 배양
<ol><li>멸균 상태에서 10% 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 Dulbecco의 DMEM(Modified Eagle Medium)에서 PANC-1 세포를 성장시킵니다. 통로 전에 최대 70%-80%의 밀도를 키우고 20번째 통로 이상 은 사용하지 마십시오. 4.2.1단계에 설명된 프로세스를 참조하십시오. 참고: 기준점으로, 20mL 배지에 있는 1 x 106 세포는 70-80% 밀도에 도달하는 데 약 2-3일이 필요합니다.</li>
	<li>멸균 조건에서 제조업체에서 제공한 키트를 사용하여 2% FBS, 1% PenStrep 및 1% SteCGS(Stellate Cell Growth Supplement)가 보충된 성상 세포 배지에서 HPaSteC 세포를 성장시킵니다. 4.2.2단계에 표시된 대로 제조업체의 지침(일부 수정 포함)에 따라 Poly-L-Lysine 코팅 플라스크에서 성장합니다.<ol><li>트립신 중화 용액(TNS)이 사용되므로 제조업체의 프로토콜에서 트립신화 중 FBS 중화 단계를 건너뜁니다. 단계 4.2.2.2에 설명된 대로 TNS 10mL의 전체 부피로 세포 현탁액을 중화합니다. 참고: 기준점으로, 20mL 배지에서 0.5 x 106 세포 및 1 x 106 세포는 90% 밀도를 달성하기 위해 각각 3일과 2일이 필요합니다.</li>
		<li>90% 밀도에서 세포를 수확합니다. Passage 7 이외의 셀을 사용하지 마십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>상대 습도가 90%-95%인 멸균 인큐베이터에서 5% CO2로 37°C에서 세포를 유지합니다. T-75 플라스크에서 모든 세포 배양 연구를 수행합니다.</li>
</ol>2. 96 웰 플레이트용 폴리(2 - 하이드록시에틸 메타크릴레이트(폴리-HEMA) 용액 코팅
<ol><li>95% 에탄올을 사용하여 37°C에서 가열된 교반기를 사용하여 밤새 혼합하여 5mg/mL의 poly-HEMA 용액을 준비합니다(예: 500mL 용액에는 2.5g의 poly-HEMA 필요).<ol><li>교반기를 추가하기 전에 시작 볼륨 위치를 표시하십시오. 95% 에탄올을 사용하여 다음날 용액의 손실을 만회하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>0.22μm 필터를 사용하여 멸균 후드에서 최종 용액을 여과하고 4°C의 냉장고에 보관합니다. 참고: Poly-HEMA는 표면의 소수성을 증가시키는 데 사용되며, 이는 세포가 부착되는 것을 억제하는 역할을 합니다. 이 연구는 세포가 웰에 부착되지 않고 단층으로 성장하도록 요구하기 때문에 poly-HEMA는 플레이트의 자연적인 낮은 부착 기능에 대한 추가 억제제로 사용되어 초저 부착 플레이트를 만듭니다.</li>
	<li>세포 배양 후드 내부에 있는 96웰 원형 폴리스티렌 바닥 마이크로웰 플레이트의 각 웰에 50μL의 콜드 용액을 추가하여 플레이트를 코팅합니다.</li>
	<li>접시가 완전히 건조되도록 37°C의 열풍 오븐에 뚜껑을 덮은 상태로 우물을 3일 동안 그대로 두십시오.</li>
	<li>세포 파종 전에 세포 배양 후드에서 30분 동안 플레이트를 UV 멸균합니다. 장기간 보관을 위해 단단히 닫힌 지퍼 잠금 장치에 보관하고 사용하기 전에 소독하십시오.</li>
</ol>3. 2D 세포 배양 계획
<ol><li>HPaSteC 세포가 90%에 도달하는 같은 날 PANC-1 세포가 70%-80% 밀도로 사용 가능하도록 실험 시간을 정합니다. 참고: PANC-1 또는 HPaSteC의 약 100만 개 세포를 함유한 바이알은 같은 날 액체 질소에서 올리는 경우 약간의 차이가 있지만 두 세포주를 같은 날에 준비하려면 8일의 PANC-1 배양과 6-7일의 HPaSteC 배양이 필요합니다.</li>
</ol>4. 3D 문화 성장
<ol><li>이상을 참조하십시오view 프로세스를 시작하기 전에 그림 1 의 전체 프로세스. 주의: PANC-1과 HPaSteC은 모두 생물학적 기원입니다. PANC-1(암성 세포주)을 주의해서 다루십시오.</li>
	<li>Trypsinzing 및 세포 계수<ol><li>Trypsinze 및 PANC-1 세포 계수:<ol><li>상층액을 버리고 PANC-1 세포를 9mL의 HBSS(한 번에 3mL)로 세척합니다. 살아 있는/생존 가능한 물질의 완전한 죽음을 보장하기 위해 20-25% V/V 표백제 용액에 포함된 후드에 사용된 시약을 폐기하십시오.</li>
			<li>2mL의 트립신으로 세포를 트립신화합니다. 거의 10분 후(더 많은 시간이 필요할 수 있음) 모든 세포가 분리되면 10mL의 DMEM + 10% FBS로 현탁액을 중화합니다. 3mL로 시작하여 트립신화된 세포의 최대 수집을 보장하기 위해 세척당 1mL(7회 세척 남음)를 사용하여 후속 세척 단계를 수행합니다.</li>
			<li>각 중화된 부분 표본을 동일한 15mL 튜브에 합칩니다. 튜브의 최종 부피는 12mL(10mL 배지로 중화된 트립신 ~2mL)에 가깝습니다.</li>
			<li>중화된 셀 현탁액을 700 x g 에서 2분 30초 동안 원심분리합니다. 상층액을 버리고 DMEM +10% FBS 1mL에서 얻은 펠릿을 재현탁시킵니다. 세포 계수를 위해 여기에서 부분 표본을 취하고 이 섹션에서 얻은 값에 "Count A"라는 레이블을 지정합니다.</li>
		</ol></li>
		<li>Trypsinze 및 HPaSteC 세포 계수.<ol><li>상층액을 버리고 HPaSteC 세포를 9mL의 HBSS(한 번에 3mL)로 세척합니다.</li>
			<li>2mL의 트립신으로 세포를 트립신화합니다. 거의 10분 후 모든 세포가 분리되면 10mL의 트립신 중화 용액으로 현탁액을 중화합니다. 3mL로 시작하여 트립신화된 세포의 최대 수집을 보장하기 위해 세척당 1mL(7회 세척 남음)를 사용하여 후속 세척 단계를 수행합니다.</li>
			<li>각 중화된 부분 표본을 동일한 15mL 튜브에 합칩니다. 튜브의 최종 부피는 12mL(10mL의 중화 용액으로 중화된 트립신 ~2mL)에 가깝습니다.</li>
			<li>중화된 셀 현탁액을 700 x g 에서 2분 30초 동안 원심분리합니다. 상층액을 버리고 보충된 성상세포 매체 1mL에서 얻어진 펠릿을 재현탁시킵니다. 세포 계수를 위해 여기에서 부분 표본을 취하고 이 섹션에서 얻은 값을 "Count B"로 레이블을 지정합니다.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>초기 세포 현탁액 희석하기<ol><li>카운트 A와 B를 모두 얻은 후 또는 PANC-1과 HPaSteC을 모두 트립시화 및 중화한 후 필요한 경우(0.5시간 이상) 이 단계에서 잠시 중지하십시오. 사용하지 않은 배양 배지는 37°C에서 유지하고 세포 현탁액은 실온(RT; 25 ± 2°C)에서 유지합니다.</li>
		<li>이전에 얻은 카운트 A와 카운트 B를 사용하여 부분 표본을 취하고 각각의 희석액(별도의 튜브에서)을 만들어 최종 부피가 1mL(희석제: DMEM + 두 바이알 모두에 대해 10% FBS)이고 최종 계수가 각 세포 유형에 대해 110,000-140,000개 세포 사이가 되도록 합니다. 이 희석이 이루어지면 각 희석에 대한 세포 수를 확인하여 카운트 C(PANC-1) 및 카운트 D(HPaSteC)를 제공합니다.</li>
		<li>카운트 C와 카운트 D를 얻은 후 필요한 경우(15-30분 이하) 이 단계에서 일시 중지합니다. 4.3.3.2 단계에서 최종 희석이 이루어지면 멈추지 마십시오. 세포 침전을 피하기 위해 실험하십시오. 사용하지 않은 배양 배지는 37°C에서 유지하고 세포 현탁액은 RT(25 ± 2°C)로 유지합니다.<ol><li>HPaSteC: PANC-1: 60:120에서 웰당 필요한 최종 셀 수를 유지합니다. 초과분을 설명하기 위해 계산에 110개의 웰을 사용합니다. 웰당 100μL의 세포 현탁액의 기본 값으로 계산합니다(총 현탁 부피는 HPaSteC: PANC-1: 60:120을 사용하는 110웰의 경우 11mL임). 쉽게 혼합할 수 있도록 이 현탁액을 멸균 50mL 원심분리 튜브에 넣으십시오.</li>
			<li>카운트 C와 카운트 D를 사용하고 DMEM + 10% FBS 용액에 충분한 세포 현탁액을 스파이크하여 최종 11mL(11mL에 6,600개의 HPaSteC 세포 및 13,200개의 PANC-1 세포)에서 HPaSteC: PANC-1: 60:120을 갖도록 합니다. 1mL 피펫을 사용하여 용액을 위아래로 저어주고 피펫팅하여 완전히 혼합합니다. 거품 형성을 피하십시오.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>시드<ol><li>200 μL 또는 100 μL 피펫을 사용하여 웰당 100 μL의 현탁액을 추가하기 전에 각 단계에서 최종 현탁액을 혼합합니다(피펫 팁을 위아래로 움직여 교반). 우물 모서리를 따라 100μL를 부드럽게 추가합니다.<ol><li>떨어지지 않는 한 여러 웰에 동일한 팁을 재사용하십시오. 앞뒤로 섞고 플레이트의 전반부(대략 처음 43웰) 동안 각 웰에 추가할 때 10 또는 15(초가 아님)까지 센다. 현탁액 부피가 더 적고 혼합 시간이 더 적게 필요하기 때문에 후반부(나머지 43개 웰) 동안 각 웰 사이의 혼합 수를 5-10으로 낮춥니다.</li>
			<li>소수성 poly-HEMA 코팅으로 인해 현탁액이 플레이트에서 튕겨 나와 고르지 않은 분포를 초래할 수 있으므로 반복 피펫터를 사용하지 마십시오.</li>
		</ol></li>
		<li>모든 웰이 채워진 후 과도한 현탁액을 버리십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>원심 분리<ol><li>셀 현탁액이 포함된 최종 플레이트를 원심분리하여 모든 셀을 펠릿으로 결합합니다. 이 단계에서 오염을 방지하기 위해 플레이트 테두리를 파라필름으로 조심스럽게 감쌉니다. 포장 후 1000 x g 의 균형추로 플레이트를 2분 동안 원심분리합니다.</li>
		<li>플레이트를 세포 배양 후드에 다시 넣고(에탄올이 분무된 장갑을 사용하여 취급) 파라필름을 제거한 다음 플레이트를 37% CO2로 5°C의 인큐베이터에 보관합니다. 어떤 지점에서도 플레이트에 에탄올-물 혼합물을 뿌리지 마십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>문화 유지 관리<ol><li>3일째까지 4x-5x 배율로 광학 현미경으로 세포가 모여 스페로이드를 형성하는 것을 봅니다. 아래 설명된 대로 문화권 유지 관리 프로토콜을 따릅니다.<ol><li>3일째에 5-6mL의 DMEM + 10% FBS를 측정하고 웰 측면을 따라 각 웰에 50μL를 추가합니다.<ol><li>스페로이드가 손상되거나 실수로 스페로이드가 제거될 수 있으므로 추가하는 동안 어떤 식으로든 매체를 혼합하거나 교반하지 마십시오. 웰당 최종 부피는 ~150μL입니다.</li>
			</ol></li>
			<li>3일째 이후에는 그림 2 를 참조하여 우물의 구조와 헤일로라고 하는 매체에서 볼 수 있는 빛 반사(우물의 원통형 부분과 곡선 부분 사이)의 위치에 익숙해집니다. 스페로이드가 손상되지 않도록 주의해서 헤일로 가까이에서 작업을 수행하십시오.</li>
			<li>6일째에 10-11mL의 DMEM + 10% FBS를 측정합니다. 1mL 피펫을 사용하여 후광까지 배지를 당겨 여러 웰에서 배지를 대량으로 꺼냅니다. 전체 플레이트에 대해 이 작업을 수행한 다음 미디어를 교체합니다. 상층액을 대량으로 모아 버리거나, 뽑을 때 버리십시오.</li>
			<li>각 웰의 측면을 따라 100μL의 매체를 추가하여 폐기된 매체를 새 매체로 교체합니다. 웰의 최종 부피는 200μL에 가깝습니다.<ol><li>미디어를 후광 너머로 당기면 실수로 스페로이드를 잡아당길 위험이 높아집니다.</li>
			</ol></li>
			<li>10/11일째에 10-11mL의 DMEM + 10% FBS를 측정합니다. 1mL 피펫을 사용하여 후광까지 배지를 당겨 여러 웰에서 배지를 대량으로 꺼냅니다. 전체 플레이트에 대해 이 작업을 수행한 다음 미디어를 교체합니다. 상층액을 대량으로 모아 버리거나, 뽑을 때 버리십시오.</li>
			<li>각 웰의 측면을 따라 100μL의 매체를 추가하여 폐기된 매체를 새 매체로 교체합니다. 웰의 최종 부피는 200μL에 가깝습니다.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>최종 날 평가<ol><li>14일째에 스페로이드에 대한 약물 치료를 수행합니다. 사용하기 전에 4x 대물렌즈 아래에서 명시야 도립 현미경을 사용하여 스페로이드를 이미지화하여 스페로이드의 시작 부피를 확인합니다. 다음 공식을 사용하여 볼륨(V)을 계산합니다. V = 0.5 × L × W2</li>
		<li>위에 설명된 스페로이드 부피를 계산하기 위한 방정식을 따르십시오. 여기서 L은 장축의 길이이고 W는 너비(장축에 수직인 가장 긴 선)입니다. 모든 원래 단위를 마이크로미터에서 밀리미터로 변환하여 입방 밀리미터 단위의 부피를 얻습니다.</li>
		<li>14일째에 각 웰의 시작 부피는 증발로 인해 150-200μL 사이입니다. 약물 처리의 경우 각 웰에서 후광에 도달할 때까지 배지를 제거하고 2배 강도의 약물 용액 100μL로 교체하고 약간의 부드러운 혼합(각 웰 사이에 2까지 세면서 매체를 앞뒤로 부드럽게 혼합)으로 교체합니다.<ol><li>2x 강도 용액을 사용하여 최종 약물 용액이 1x가 되도록 하고 웰에서 오래된 매체를 완전히 제거하지 못하면 스페로이드가 방해받을 수 있습니다. 이 기간으로부터 3일 이내에 스페로이드를 사용하십시오.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>스페로이드 컬렉션<ol><li>4.7.2단계에 설명된 대로 채취하기 전에 스페로이드 부피를 측정합니다.</li>
		<li>실험의 필요에 따라 14일 또는 17일에 후광에 도달할 때까지 각 웰에서 매체를 제거하여 스페로이드를 수집합니다.</li>
		<li>1mL 피펫을 사용하여 배지를 제거하고 여러 웰에서 15mL 원뿔형 원심분리 튜브에 상층액을 수집합니다.</li>
		<li>모든 웰에 후광 수준의 배지가 있으면 1mL 피펫의 설정을 200-300 μL 사이로 줄입니다.</li>
		<li>플레이트를 후드의 배경이나 어두운 배경(예: 튜브 랙)에 맞춰 바닥에 가라앉은 스페로이드를 확인합니다.</li>
		<li>스페로이드 근처에 팁을 부드럽게 삽입하고(헤일로 아래로 이동) 소량의 매체(예: 50μL에 가까운 시각적 추정치)를 앞뒤로 피펫팅하여 스페로이드를 방해합니다. 스페로이드 구조를 손상시킬 수 있으므로 팁을 스페로이드 바로 위에 올려 놓지 마십시오.<ol><li>이 단계에서 우물에서 모든 매체를 빼내지 마십시오. 피펫의 피스톤에서 엄지 손가락의 움직임을 단단히 제어하십시오.</li>
		</ol></li>
		<li>회전 타원체가 더 이상 중앙에 남아 있지 않고 배경에 대해 움직이는 것을 볼 수 있을 때까지 미디어를 이동합니다. 스페로이드를 빨아들일 수 있을 만큼 충분한 매체를 끌어올려 원하는 위치로 이동합니다(예: 동일한 처리 세트의 일부인 웰에 다른 스페로이드와 함께 모임).</li>
	</ol></li>
	<li>쓰레기 버리기<ol><li>모든 액체 s를 폐기하십시오.amp각 실험실의 환경 및 보건 안전 부서의 프로토콜에 따라 표백제로 중화되면 파일. 생물학적 유해 폐기물과 함께 사용된 모든 피펫과 플라스크를 오토클레이브하고 폐기하십시오.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66625/66625fig01.jpg"> 그림 1: 3D 탈형성 췌장암 스페로이드를 성장시키는 과정 개요 (BioRender를 사용하여 생성됨). 이 그림은 관련된 기본 프로세스에 대한 개요를 제공합니다. 즉, 세포를 trypsinzing하고, 초기 세포 수를 사용하여 희석된 세포 현탁액을 만들고, 희석된 세포 현탁액을 사용하여 공동 배양을 준비하고, 각 웰에 세포 현탁액을 추가하고, 배양물을 배양하고, 배지 유지 관리 및 최종 스페로이드 형성을 14일째에 예상대로 수행합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66625/66625fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66625/66625fig02.jpg"> 그림 2: U 바닥 우물의 구조. 오른쪽 이미지는 우물의 "후광" 부분을 보여주기 위해 과장된 모양입니다. 이 그림은 헤일로 위에서 작업하는 것이 스페로이드를 성장시키고 우발적인 손실을 방지하는 데 중요하기 때문에 우물의 "후광" 부분이 어디에 있는지 정의하는 것을 목표로 합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66625/66625fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
5. ECM 구성 요소 및 컨포칼 현미경 평가
<ol><li>Durymanov et al.38에 설명된 프로토콜에 따라 약물 요법에 대한 ECM의 반응을 평가하기 위해 면역염색을 사용합니다.<ol><li>스페로이드를 함께 모으고 100μL의 PBS로 두 번 세척합니다. 최적 절단 온도(OCT) 조직 매립 매체에 매립하고 동결 및 -80°C에서 유지합니다.</li>
		<li>동결된 종양 블록을 10μm 절편으로 자르고 절편을 아세톤-메탄올(1:1) 혼합물에 15분 동안 고정한 다음 실온에서 자연 건조합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>ECM 성분을 측정하려면 토끼 단클론 항-피브로넥틴 1차 항체, 토끼 다클론 항-I형 콜라겐 항체, 토끼 다클론 항-라미닌 항체 및 양 다클론 항-히알루론산 항체로 냉동절편을 면역염색합니다.</li>
	<li>Alexa Fluor 488로 표지된 염소 항토끼 IgG 또는 Alexa Fluor 568로 접합된 당나귀 항양 IgG를 2차 항체로 사용합니다. 참고: 1차 및 2차 항체는 각각 1:200 및 1:300으로 희석하였다.</li>
	<li>20x/0.45 대물 렌즈가 장착된 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 모든 스페로이드 단면의 이미지를 획득합니다.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>치료 평가를 위한 탈모증을 캡처하는 3D-PDAC 모델

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<li>Laklai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotype+tunes+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+tissue+tension+to+induce+matricellular+fibrosis+and+tumor+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Genotype tunes pancreatic ductal adenocarcinoma tissue tension to induce matricellular fibrosis and tumor progression.</a> Nat Med. 22 (5), 497-505 (2016).</li>
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<li>Spano, D., Zollo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+microenvironment%3A+a+main+actor+in+the+metastasis+process%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Tumor microenvironment: a main actor in the metastasis process.</a> Clin Exp Metastasis. 29 (4), 381-395 (2012).</li>
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<li>Alseud, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+biological+activity+of+11-oxygenated+and+heterocyclic+estrone+analogs+in+pancreatic+cancer+monolayers+and+3D+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Synthesis and biological activity of 11-oxygenated and heterocyclic estrone analogs in pancreatic cancer monolayers and 3D spheroids.</a> Bioorg Med Chem. , (2024).</li>
<li>Fitzgerald, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+activation+protein+regulates+natural+killer+cell+migration%2C+extravasation+and+tumor+infiltration%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Fibroblast activation protein regulates natural killer cell migration, extravasation and tumor infiltration.</a> bioRxiv. , 429622(2021).</li>
<li>Wishart, G., Gupta, P., Schettino, G., Nisbet, A., Velliou, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+tissue+models+as+tools+for+radiotherapy+screening+for+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Radiol%22%5BJournal%5D)">3D tissue models as tools for radiotherapy screening for pancreatic cancer.</a> Br J Radiol. 94 (1120), 20201397(2021).</li>
<li>Peirsman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MISpheroID%3A+a+knowledgebase+and+transparency+tool+for+minimum+information+in+spheroid+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">MISpheroID: a knowledgebase and transparency tool for minimum information in spheroid identity.</a> Nat Methods. 18 (11), 1294-1303 (2021).</li>
<li>Durymanov, M., Kroll, C., Permyakova, A., Reineke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+endocytosis+in+nanoparticle+penetration+of+3D+pancreatic+cancer+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharm%22%5BJournal%5D)">Role of endocytosis in nanoparticle penetration of 3D pancreatic cancer spheroids.</a> Mol Pharm. 16 (3), 1074-1082 (2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Axio Observer 반전 현미경</td><td>Carl Zeiss</td><td>0450-354</td><td></td></tr><tr><td>셀로미터 Auto T4</td><td>Nexcelom Bioscience LLC</td><td>Auto-T4</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, 분말, 고포도당</td><td>Gibco</td><td>12100046</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-sheep Alexa Fluor 568</td><td>Abcam</td><td>ab175712</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum&nbsp;</td><td>Cytiva</td><td>SH3091003HI</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488로 표시된 염소 안티 토끼 IgG;</td><td>Abcam</td><td>ab150077</td><td></td></tr><tr><td>행크스 밸런스 솔트 솔루션(HBSS)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14175145</td><td></td></tr><tr><td>Human Pancreatic Stellate Cells (HPaSteC)</td><td>ScienCell</td><td>3830</td><td></td></tr><tr><td>microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclipse ts 100</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 96-well polystyrene round bottom microwell plates</td><td>Thermo Scientific</td><td>12-565-331</td><td></td></tr><tr><td>Olympus Fluoview FV1200 confocal laser</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td>단종 제품</td></tr><tr><td>PANC-1</td><td>ATCC</td><td>CRL-1469</td><td></td></tr><tr><td>Poly-HEMA</td><td>Sigma</td><td>P3932</td><td></td></tr><tr><td>토끼 폴리클로날 항-라미닌 항체&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab11575</td><td></td></tr><tr><td>토끼 다클론 항-타입 I 콜라겐 항체&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab34710</td><td></td></tr><tr><td>양 다클론 항히알루론산 항체</td><td>Abcam</td><td>ab53842</td><td></td></tr><tr><td>스텔레이트 세포 미디어 완전 키트&nbsp;</td><td>ScienCell</td><td>5301</td><td></td></tr><tr><td>트립신&nbsp;</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>153571</td><td>제조사 프로토콜에 따라 준비된 Trypsin 용액을 0.25%w/v&nbsp로 사용합니다;</td></tr><tr><td>트립신 중화 용액(TNS)</td><td>ScienCell</td><td>103</td><td></td></tr></tbody></table>

공동 배양에서 desmoplastic three-dimensional pancreatic cancer spheroids 성장

Growing Desmoplastic Three-Dimensional Pancreatic Cancer Spheroids from Co-Culture

스페로이드 성장과 관련된 가장 중요한 세 가지 단계는 초기 세포 수, 스페로이드를 파종하는 동안 혼합 단계, 스페로이드가 성장할 수 있도록 적시에 배지 교체를 수행하는 것입니다(그림 1). 또한 3일차 이후의 배지 변화에 대한 그림 2 를 숙지하는 것은 웰당 매체 양이 증가하기 때문에 효과적인 매체 변경을 허용하는 데 중요합니다. 이러한 모든 단계를 주어진 지시에 따라 수행하면 스페로이드(그림 3)가 평균 부피 0.048 ± 0.012mm3(451μm x 462.84μm)까지 성장하는 것으로 나타났습니다(그림 4). 세포가 더 잘 자라 14일째에 초기 평균 부피가 0.096 ± 0.014 mm3(611 μm x 560 μm)로 더 커질 수 있는 경우가 발견되었습니다. 인큐베이터의 온도 및 습도를 유지하거나 나중 통로에 비해 약간 향상된 활력을 가진 초기 세포 통로의 사용과 같은 다양한 이유로 스페로이드가 더 큰 초기 부피를 가질 수 있습니다.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66625/66625fig03.jpg"> 그림 3: 14일째에 본 대표적인 스페로이드(크기: 451.59 μm x 462.84 μm). 스케일 바 = 200 μm. 각 스페로이드는 각각 가장 긴 축과 가장 짧은 축을 따라 측정되며 방법 섹션에 설명된 방정식을 사용하여 부피를 계산합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66625/66625fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66625/66625fig04.jpg"> 그림 4: 17일 동안의 스페로이드 성장 진행 상황. 플레이트 1과 2는 반복실험입니다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림은 6일, 10일, 14일, 17일에 볼 수 있는 스페로이드 부피의 대략적인 추정치로 사용할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66625/66625fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
그러나 세포가 올바르게 계수되지 않거나, 세포 현탁액이 완전히 혼합되지 않거나, 최종 배양이 정기적으로 유지되지 않거나, 이러한 오류의 조합이 발생하는 경우, 더 작은 스페로이드 또는 불완전하게 성장한 스페로이드의 발달로 이어질 수 있습니다. 유사한 모양의 스페로이드는 초기 최적화 연구에서 3일차에 전체 플레이트가 아닌 플레이트 주변 웰의 매체만 보충했을 때도 관찰되었습니다(그림 5). 또는 세포가 잘 혼합되지 않거나 초기 계수/희석 오류로 인해 권장 사항보다 웰당 더 많은 세포가 파종되는 경우 웰당 여러 스페로이드가 보일 수 있습니다. PANC-1:HPaSteC 세포를 240:120 비율로 사용했을 때도 비슷한 결과가 나타났습니다(그림 6). 이것은 스페로이드가 방향별로 성장할 때도 가끔 나타날 수 있지만, 이러한 스페로이드는 수가 더 적습니다(예: 4/96 웰은 웰당 1개가 아닌 2개의 스페로이드를 포함할 수 있음). 여러 스페로이드가 발견되는 경우, 여러 스페로이드가 있는 웰을 사용하지 않거나 이러한 스페로이드를 처리할 때 부피의 변화를 기록해 두십시오. 피펫 팁이 헤일로 아래로 떨어지는 부적절한 매체 변경(그림 1)도 스페로이드의 우발적인 손실로 이어질 수 있습니다.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66625/66625fig05.jpg"> 그림 5: 14일째에 제대로 성장하지 못한 스페로이드의 대표 이미지. 스케일 바 = 200 μm. 여기서 세포가 잘 응집되지 않아 스페로이드의 길이와 너비를 측정하기가 어려워집니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66625/66625fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66625/66625fig06.jpg"> 그림 6: 14일째에 본 두 개의 제대로 성장하지 않은 스페로이드가 들어있는 우물의 대표적인 이미지. 스케일 바 = 200 μm. 여기서 스페로이드 중 하나는 246.61μm x 178.31μm이고 다른 하나는 289.13μm x 252.35μm입니다. 이는 초기 희석 또는 실험을 시작하는 데 사용된 세포의 품질에 문제가 있을 수 있는 예입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66625/66625fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
스페로이드는 또한 4가지 주요 ECM 구성 요소인 콜라겐-I, 라미닌, 히알루론산, 피브로넥틴으로 ECM을 형성합니다. 연구실이 이전에 발표한 연구에서 PANC-1 단독에 비해 공동 배양의 이점은 호모 PANC-1 스페로이드가 미만 콜라겐, 피브로넥틴이 없고 히알루론산 침착이 적다는 점에서 입증되었습니다.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66625/66625fig07.jpg"> 그림 7: 처리되지 않은 스페로이드에서 17일째에 볼 수 있는 4가지 주요 ECM 구성 요소인 콜라겐 I, 라미닌, 히알루론산 및 피브로넥틴의 대표 이미지. 이 이미지는 스페로이드의 cryosection을 면역염색한 후 얻은 것입니다. 이러한 이미지의 밝기는 모양의 차이를 강조하는 데 도움이 되도록 균일하게 증가했습니다. 조직이 손상되거나 누락된 영역은 강도 측정을 수행하는 동안 조정해야 합니다. 스케일 바 = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66625/66625fig07large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

공동 배양에서 Desmoplastic Three-dimensional Pancreatic Cancer Spheroids 성장

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is one of the deadliest cancers with a 5-year survival rate of &#60;12%. The biggest barrier to therapy is the ...

growing-desmoplastic-three-dimensional-pancreatic-cancer-spheroids

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

간단한 방법은 관련 상피 세포에서 조직 섬유아 세포의 효과를 분석하는 설명되어 있습니다. 이 방법과 3 차원 조직 배양의 결합 차원에서 고립 후 세포의 분석을 용이하게하실 수 있습니다. 기술은 종양 세포에서 종양 - 관련 기질의 효과를 체계적으로 연구를 허용, 악성 잠재력을 변화의 세포에 적용됩니다.

세 가지 차원 혼합 셀 회전 타원체 공동 문화에서 Mammary 상피 세포의 분리

이 동영상은 공동 배양된 췌장암 세포와 섬유아세포의 3D 자기 바이오프린팅에 대해 설명합니다. 췌장암 세포와 활성화된 췌장 섬유아세포 세포는 자기력의 영향으로 스페로이드를 생성하기 위해 생체 적합성 나노 입자 어셈블리를 사용하여 공동 배양 및 자화됩니다.

자기 바이오프린팅 3D 스페로이드 공동 배양: 암세포와 섬유아세포를 공동 배양하는 방법

이 동영상은 3차원 종양 스페로이드와 T 세포 공동 배양을 확립하는 방법을 보여줍니다. 종양 스페로이드를 함유하는 마이크로웰이 있는 아가로스 캐스트를 준비한 후 T 세포를 첨가합니다. 배양 후 이 설정을 통해 통제된 3차원 환경에서 T 세포와 종양 스페로이드의 상호 작용을 연구할 수 있습니다.

종양 스페로이드에 침투하는 T 세포의 3차원 공동 배양 모델

주변 정상 조직의 침입은 악성 종양을 정의하는 특징입니다. 우리는 여기에서 여러 진행성 인간 암 모델로 예시된 자연 3D 바이오매트릭스로의 침입에 대한 간단한 반자동 마이크로 플레이트 분석을 제공합니다.

3 차원 (3D) 종양 회전 타원체 침공 분석

여기, 췌장암 세포 및 섬유 아 세포, 세포 외 유출 분석기를 사용 하 여 대사 기능을 측정 하 여 다음의 3 차원 (3D) 회전 타원 체 공동 문화의 준비에 대 한 메서드를 설명 합니다.

준비 및 췌장암 세포 및 섬유 아 세포의 3 차원 회전 타원 체 공동 문화의 변화 분석 결과

제시된 접근은 3D 스페로이드 ascy 및 T 세포 세포 독성에 있는 암 세포 침략을 동시에 평가합니다. 스페로이드는 비계가 없는 아가로즈 멀티 마이크로웰 캐스트에서 생성됩니다. I형 콜라겐 매트릭스에 공동 배양 및 포함은 암세포 침입 및 T세포 중재 세포 독성을 모니터링할 수 있는 동일한 장치 내에서 수행된다.

3D 배양에서 암 세포 침략 및 T 세포 세포 독성 을 감시

이 프로토콜은 Caco2 결장 아데노암종 세포에서 3차원 스페로이드를 생성하고 성장시키는 새로운 견고하고 재현 가능한 배양 시스템을 제공합니다. 결과는 화학요법에 대한 반응을 포함하여 암 줄기 세포 생물학을 공부하는 이 접근의 적합성을 위한 개념증명을 제공합니다.

대장암 줄기세포를 연구하는 스페로이드의 3차원 모델

관련 인간 질병을 충실하게 재구성하는 포괄적인 체외 모델은 부족합니다. 현재 연구는 인간 간세포 암에서 종양 기질 상호 작용을 연구하는 신뢰할 수있는 체외 도구인 3차원 (3D) 종양 스페로이드 생성 및 문화를 제시합니다.

간세포 암에서 종양-기질 상호 작용을 조사하는 3차원 스페로이드 모델

현재 프로토콜은 원발성 암세포에서 3D 종양 배양 모델을 생성하고 세포 생존력 분석 및 현미경 검사를 사용하여 약물에 대한 민감도를 평가하는 것을 설명합니다.

환자 유래 종양 샘플에서 3차원 스페로이드 설정 및 약물에 대한 민감도 평가

이 연구는 스탬프 기반 시스템을 사용하여 아가로스 주형에 마이크로웰을 생성함으로써 3D 세포 구조를 생성하는 비용 효율적이고 효율적인 방법론을 제시합니다. 이 시스템은 균일한 스페로이드/오가노이드의 형성을 촉진하여 세포 상호 작용을 개선합니다. 이 접근 방식은 실험 변동성을 줄이고 약물 테스트 및 조직 공학의 응용 분야를 지원합니다.

Novel Stamp Device를 사용한 2차원 세포 배양에서 3차원 스페로이드/오가노이드 생성

학습하세요 췌장암 연구를 위한 3D 공동 배양 기법으로 섬유성 종양 미세환경을 재현하는 방법을. 환자 유래 세포와 면역 세포를 통합하여 치료제 선별 및 종양 성장 기전 연구에 활용할 수 있습니다.

공동 배양에서 Desmoplastic Three-dimensional Pancreatic Cancer Spheroids 성장

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