Name: 나노미터 및 마이크로미터 크기의 소포에서 평형을 벗어난 대사 네트워크 구축 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-12T14:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: 학습하세요 합성세포 구축을 위한 막단백질 재구성 및 효소 캡슐화 기법. 리포솜 기반 대사 네트워크를 활용한 자율성장 시스템 개발 방법론을 탐색합니다.

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저자들은 pBAD-PercevalHR 유전자의 클로닝에 대해 Aditya Iyer에게 감사를 표하고, 단백질 생산 및 정제를 도와준 Gea Schuurman-Wolters에게 감사를 표합니다. 이 연구는 NWO 중력 프로그램인 "Building a Synthetic Cell"(BaSyC)의 자금 지원을 받았습니다.

복잡한 단백질 네트워크를 위한 지질 소포 캡슐화 프로토콜

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<li>Godoy-Hernandez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+highly+stable+membrane+reconstitution+by+LAiR+enables+the+study+of+physiological+integral+membrane+protein+functions%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Cent+Sci%22%5BJournal%5D)">Rapid and highly stable membrane reconstitution by LAiR enables the study of physiological integral membrane protein functions.</a> ACS Cent Sci. 9 (3), 494-507 (2023).</li>
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<li>Elias, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+characterization+of+biomimetic+membrane+mechanics+with+an+on-chip+micropipette%5BTitle%5D)+AND+%22Micro+Nano+Eng%22%5BJournal%5D)">Microfluidic characterization of biomimetic membrane mechanics with an on-chip micropipette.</a> Micro Nano Eng. 8, 100064(2020).</li>
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<li>Cooper, A., Girish, V., Subramaniam, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osmotic+Pressure+Enables+High-Yield+Assembly+of+Giant+Vesicles+in+Solutions+of+Physiological+Ionic+Strengths%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Osmotic Pressure Enables High-Yield Assembly of Giant Vesicles in Solutions of Physiological Ionic Strengths.</a> Langmuir. 39 (15), 5579-5590 (2023).</li>
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<li>Setyawati, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+reconstitution+of+dynamically+interacting+integral+membrane+subunits+of+energy-coupling+factor+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">In vitro reconstitution of dynamically interacting integral membrane subunits of energy-coupling factor transporters.</a> eLife. 9, e64389(2020).</li>
<li>Oropeza-Guzman, E., Ríos-Ramírez, M., Ruiz-Suárez, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leveraging+the+coffee+ring+effect+for+a+defect-free+electroformation+of+giant+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Leveraging the coffee ring effect for a defect-free electroformation of giant unilamellar vesicles.</a> Langmuir. 35 (50), 16528-16535 (2019).</li>
<li>Estes, D. J., Mayer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroformation+of+giant+liposomes+from+spin-coated+films+of+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+Surf+B+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Electroformation of giant liposomes from spin-coated films of lipids.</a> Colloids Surf B Biointerfaces. 42 (2), 115-123 (2005).</li>
</ol>

저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

마이크로미터 미만의 지질 소포(proteoLUV)를 포함하는 (막) 단백질의 합성과 proteoLUV를 giant-unilamellar vesicles(proteoGUV)로 전환하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 다른 막 단백질 13,19,30,40의 재구성 및 여기에 제시된 L-아르기닌 분해 및 글리세롤 3-인산염 합성 경로 이외의 대사 네트워크의 캡슐화에 적용할 수 있어야 합니다.
리포좀에서 막 단백질의 재구성은 일반적으로 지질막 내 단백질의 무작위 방향을 생성합니다. ArcD 및 Glpt의 경우 단백질이 양방향으로 작동하고 용질이 총 전기화학적 전위의 부호에 따라 이동하기 때문에 방향은 중요하지 않습니다. 한 방향으로 기능하는 단백질의 경우 분자의 절반은 방향이 50/50일 때 활성에 사용할 수 없습니다.
폴리카보네이트 필터를 통해 소포를 압출하면 크기 분포가 좁아지고 필터의 공극 크기가 작을수록 소포가 더 균질해집니다. 그러나 더 작은 소포는 더 작은 부피를 갖는 대가를 치르게 되므로 소포당 매우 적은 수의 단백질(효소, 막 단백질)이 있습니다. 하나 이상의 성분이 결여된 LUV의 비율을 최소화하기 위해, 단백질의 농도는 그림 3A,B와 같이 조정될 수 있지만, 매우 작은 소포의 경우 확률적 효과는 불가피합니다.
겔 보조 팽창 방법은 건조된 아가로스 표면에 초음파 소포(SUV)의 증착에 의존합니다. 건조 과정에서 소포의 농도 구배가 형성되고 지질 농도는 스폿 주변에서 가장 높습니다. 이것은 커피 얼룩 효과(41,42)로 알려진 현상 때문입니다. 그 결과, 스폿 내의 작은 영역에만 GUV 형성에 적합한 지질 농도가 포함되어 있습니다. 원형의 고르지 않은 집중 지질 반점은 소포 융합에 사용할 수 없는 큰 미사용 영역을 초래합니다. 따라서 이 접근 방식에서 GUV 형성의 효율성이 낮아집니다. GUV의 수율을 증가시키려면, 균일한 지질 증착을 목표로 해야 하며, 이는 스핀 코팅(42) 또는 커피 염색 효과(41)를 활용하여 달성될 수 있다.
프로토콜에 대한 추가 참고 사항:
여러 막 단백질(>10)이 확률적 효과를 피하기 위해 소포당 평균적으로 재구성되도록 주의해야 합니다. 따라서 지질 대 단백질 비율이 400:1 w/w보다 높지 않도록 하십시오. 대부분의 단백질에 대해 무작위 방향이 가정됩니다.
이상적으로, 총 막 단백질의 부피는 가능한 한 작고, 어쨌든 리포좀 부피의 10-20%를 초과하지 않습니다. 더 많은 부피를 추가하면 더 많은 세제가 유입되고 대부분의 사전 형성된 리포좀이 용해될 수 있어 재구성 효율성에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다.
적절한 용액으로 압출기를 사전 평형화하는 것은 캡슐화 중 구성 요소가 희석되는 것을 방지하는 데 중요합니다. 이상적으로는, 전평형 용액은 또한 용해성 효소를 포함해야 하지만, 효소를 포함하는 것은 압출기의 전평형에 필요한 상대적으로 큰 부피로 인해 너무 비쌀 수 있습니다. 따라서 일반적으로 이러한 구성 요소를 생략하고 효소를 5% 희석합니다.
이오노포어는 프로테올리포좀을 포함하는 혼합물에 첨가해야 하는데, 이는 분자가 소수성이 높고 소포가 없는 경우 표면에 흡착될 수 있기 때문입니다. 첨가된 용매의 부피가 낮다는 점에 주의해야 합니다(총 반응 부피의 <1%). 제어는 용매가 소포의 대사 네트워크에 영향을 미치지 않는지 확인하기 위해 수행됩니다. 약 1μM의 이온단 농도는 일반적으로 ~3mg/mL의 총 지질 농도에 안전합니다.
물방울을 완전히 건조시키도록 주의해야 합니다. 액적이 충분히 건조되지 않으면 팽창 용액을 추가할 때 지질이 지질 응집체를 형성하고 MLV가 형성될 수 있으므로 GUV 형성의 효율성이 떨어집니다.
포도당은 외부 매체의 삼투압을 내부 매체와 일치시키는 데 사용됩니다. 후자는 포도당 대신 자당을 함유하여 소포의 밀도를 증가시켜 GUV의 침전을 촉진합니다. 또한, 외부 환경의 포도당은 위상 대비를 향상시켜 소포를 더 쉽게 볼 수 있도록 합니다.
확률적 효과는 GUV에서 훨씬 덜 문제가 됩니다. 그러나 여기에서, surface-to-volume 비율은 허용할 수 없을 정도로 낮아져서, 막 단백질(예를 들어, transporters)의 수가 내부 대사 네트워크에 대해 제한될 수 있다. 이 프로토콜에 설명된 방법은 proteoGUV의 크기를 정밀하게 제어할 수 없지만 대다수는 5-50μm의 크기 범위에 속합니다.
결론적으로, 여기에 제시된 연구는 다양한 크기의 지질 소포에서 막 단백질 재구성 및 효소 캡슐화에 대한 포괄적인 개요를 제공합니다. 우리는 아미노산 및 글리세롤과 같은 간단한 전구체로부터 ATP와 빌딩 블록의 합성을 위한 기능적 소포의 구성을 보여줍니다. GUV에서 막 단백질을 재구성하는 것은 여전히 어려운 일이지만, 여기에 제시된 프로토콜은 상향식 합성 생물학 연구의 추가 개발을 위한 길을 열어줍니다.

상향식 합성생물학 분야는생명공학적 목적3,4 또는 생물의학적 목적5,6,7,8을 위한 (최소) 세포 1,2 및 대사 생물반응기를 구성하는 데 중점을 둡니다. 합성 세포의 구축은 연구자들이 토착 환경을 모방한 잘 정의된 조건에서 (막) 단백질을 연구할 수 있는 고유한 플랫폼을 제공하여 단백질 및 반응 네트워크의 창발적 특성과 숨겨진 생화학적 기능을 발견할 수 있도록 합니다9. 자율적으로 기능하는 합성 세포를 향한 중간 단계로, 대사 에너지 보존, 단백질 및 지질 합성, 항상성과 같은 살아있는 세포의 필수 기능을 포착하는 모듈이 개발되었습니다. 이러한 모듈은 삶에 대한 우리의 이해를 향상시킬 뿐만 아니라 의학8 및 생명공학10 분야에도 응용될 수 있는 잠재력을 가지고 있다.
막관통 단백질은 세포 안팎으로 분자를 운반하고, 신호를 보내고, 환경의 질에 반응하며, 수많은 생합성 역할을 하기 때문에 거의 모든 대사 네트워크의 중심에 있습니다. 따라서, 합성 세포에서 대사 모듈의 엔지니어링은 대부분의 경우 통합 및/또는 말초 막 단백질을 특정 지질과 높은 무결성(낮은 투과성)으로 구성된 막 이중층으로 재구성해야 합니다. 이러한 막 단백질을 다루는 것은 까다로우며 특정 지식과 실험 기술이 필요합니다.
인지질 소포 내에서 막 단백질을 재구성하기 위해 여러 가지 방법이 개발되었으며, 대부분 특정 단백질의 기능11,12, 조절13, 운동 특성14,15, 지질 의존성15,16 및/또는 안정성17을 연구하기 위한 목적으로 개발되었습니다. 이러한 방법에는 지질(18)이 있는 상태에서 세제-가용화 단백질을 수성 매체로 빠르게 희석하는 방법, 세제-가용화 단백질을 세제-불안정화된 지질 소포체와 함께 배양하여 세제를 제거하는 방법, 세제(들)를 폴리스티렌 비드(19)에 흡수하는 방법, 또는 투석 또는 크기 배제 크로마토그래피(20)에 의한 세제의 제거가 포함된다. 유기 용매는 예를 들어 유수계 간기(21)의 형성을 통해 지질 소포를 형성하는 데 사용되었지만, 대부분의 일체형 막 단백질은 이러한 용매에 노출될 때 비활성화됩니다.
우리 실험실에서는 주로 세제 흡수 방법으로 막 단백질을 재구성하여 대형 단층 소포(LUV)를 형성합니다19. 이 방법은 여러 막 단백질의 공동 재구성과 효소, 대사 산물 및 프로브22,23의 소포 내강에 캡슐화를 허용합니다. 막 단백질-함유 LUV는 막 단백질(26)의 완전성을 보존하기 위해 전기형성(24) 또는 겔 보조 팽창(gel-assisted swelling)25 및 특정 조건을 사용하여 수용성 성분의 캡슐화를 유무에 관계없이 거대-단층 소포(GUVs)로 전환될 수 있다.
이 논문은 L-아르기닌을 L-오르니틴으로 분해하여 ATP를 재생하는 평형외 대사 네트워크의 LUV에서 재구성을 위한 프로토콜을 제시합니다27. ATP의 형성은 인지질 합성을 위한 중요한 구성 요소인 글리세롤-3-포스페이트(G3P)의 생성과 관련이 있습니다22,28. 대사 경로는 아르기닌/오르니틴(ArcD)과 G3P/Pi 안티포터(GlpT)라는 두 개의 필수 막 단백질로 구성됩니다. 또한 ATP의 재활용을 위해 3가지 용해성 효소(ArcA, ArcB, ArcC)가 필요하며, GlpK는 L-아르기닌 분해에서 얻은 ATP를 사용하여 글리세롤을 글리세롤 3-인산으로 변환하는 데 사용됩니다(경로의 개략적인 개요는 그림 1 참조). 이 프로토콜은 지질 또는 단백질의 합성 또는 세포 분열을 위한 훨씬 더 복잡한 반응 네트워크의 미래 구축을 위한 좋은 출발점을 나타냅니다. 소포의 지질 조성은 다양한 일체형 막 단백질의 활성을 지원하며, 소포 27,29,30 안팎으로 다양한 분자를 수송하는 데 최적화되어 있다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig01v2.jpg"> 그림 1: ATP 생성과 글리세롤 3-포스페이트 합성 및 배설을 위한 경로 개요. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
요컨대, 정제된 막 단백질(도데실-β-D-말토사이드, DDM에 용해됨)을 Triton X-100으로 불안정화된 미리 형성된 지질 소포에 첨가하여 단백질을 막에 삽입할 수 있습니다. 세제 분자는 이후에 활성 폴리스티렌 비드를 첨가하여 (천천히) 제거되어 잘 밀봉된 프로테올리포좀이 형성됩니다. 그런 다음 용해성 성분을 소포에 추가하고 동결-해동 주기를 통해 캡슐화할 수 있으며, 이는 막 융합 과정에서 분자를 가둡니다. 얻어진 소포는 매우 이질적이며 많은 것이 다층입니다. 그런 다음 공극 크기가 400, 200 또는 100nm인 폴리카보네이트 필터를 통해 압출되어 보다 균일한 크기의 소포가 생성됩니다. 공극 크기가 작을수록 소포가 더 균질하고 단층류이지만 내부 부피가 더 작습니다. 통합되지 않은 단백질과 작은 분자는 크기 배제 크로마토그래피를 통해 외부 용액에서 제거됩니다. proteoLUV는 겔 보조 팽창을 통해 마이크로미터 크기의 소포로 전환될 수 있으며, 이러한 proteoGUV는 현미경 특성 분석 및 조작을 위해 미세유체 칩에 수집되고 포집됩니다. 그림 2 는 전체 프로토콜의 개략적인 개요를 보여줍니다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig02v2.jpg"> 그림 2: 마이크로미터 미만(LUV) 및 마이크로미터 크기(GUV)의 지질 소포에서 막 단백질을 재구성하고 효소 및 수용성 성분을 캡슐화하기 위한 프로토콜 개요. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
재구성 및 캡슐화 프로토콜은 잘 작동하고 단백질의 기능은 유지되지만 proteoLUV와 proteoGUV는 크기가 이질적입니다. 미세유체역학(Microfluidic) 접근법31,32는 크기가 더 균질한 마이크로미터 크기의 소포를 형성할 수 있지만, 이중층의 잔류 용매가 단백질을 비활성화하기 때문에 일반적으로 막 단백질의 기능적 재구성이 불가능합니다. proteoLUV의 크기는 100nm에서 400nm까지 다양하며, 낮은 농도의 효소에서는 캡슐화로 인해 불완전한 대사 경로(확률적 효과, 그림 3 참조)를 가진 소포가 생성될 수 있습니다. LUV는 ATP 및 G3P와 같은 빌딩 블록의 생산을 위해 여기에서 볼 수 있듯이 특정 대사 모듈을 구성하는 데 이상적입니다. 이러한 proteoLUV는 잠재적으로 GUV에 캡슐화될 수 있으며 숙주 소포를 위한 소기관과 같은 구획 역할을 할 수 있습니다.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig03v2.jpg"> 그림 3: 직경이 100, 200 또는 400nm인 소포당 분자 수. (A) 캡슐화된 단백질(효소, 프로브)이 1-10μM 범위에 있을 때. (B) 재구성은 지질당 1 - 1,000개, 1 - 10,000개, 1 - 100,000개의 막 단백질(mol/mol)에서 수행됩니다. 우리는 분자가 표시된 농도로 캡슐화되고 이러한 단백질 대 지질 비율로 막에 통합된다고 가정합니다. 일부 효소의 경우, 우리는 그들이 막에 결합하여 소포의 겉보기 농도를 증가시킬 수 있음을 보았습니다. 약어: LPR = Lipid-Protein-Ratio <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>아가로스</td><td>시그마 알드리치</td><td>A9414-25g</td><td></td></tr><tr><td>아미콘 컷오프 필터</td><td>시그마 알드리치</td><td>밀리포어 원심 필터 유닛 아미콘 울트라&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BioBeads</td><td>BioRad</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>CHCl3</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>MFCD00000826</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucose</td><td>Formedium-D</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(+)-Sucrose</td><td>Formedium-DDM</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Glycon</td><td>D97002 -C</td><td></td></tr><tr><td>Diethyl Ether</td><td>Biosolve</td><td>52805</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>시그마-알드리치</td><td>276855-100ml</td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti</td><td>850375P-1g</td><td></td></tr><tr><td>DOPE</td><td>Avanti</td><td>850725P-1g</td><td></td></tr><tr><td>DOPG</td><td>Avanti</td><td>840475P-1g</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Formedium&nbsp;</td><td>DTT005</td><td></td></tr><tr><td>EtOH</td><td>J.T.Baker Avantor</td><td>MFCD00003568</td><td></td></tr><tr><td>Extruder</td><td>Avestin Inc</td><td>LF-1</td><td></td></tr><tr><td>형광계</td><td>Jasco</td><td>분광 형광계 FP-8300</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>BOOM</td><td>51171608</td><td></td></tr><tr><td>중력 흐름 기둥</td><td>Bio-Rad</td><td>732-1010</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 주사기 100 &micro; L</td><td>Hamilton</td><td>7656-01</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 주사기 1000 &micro; L</td><td>Hamilton</td><td>81320</td><td></td></tr><tr><td>핸드 헬드 LCP 디스펜서</td><td>Art Robbins Instruments</td><td>620-411-00</td><td></td></tr><tr><td>핸드 헬드 초음파 발생기</td><td>Hielscher 초음파 기술</td><td>UP50H</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>BOOM</td><td>x76021889.1000</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Roth</td><td>X998.4-250g</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Supelco</td><td>1.05099.1000</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>BOOM</td><td>76028270.1</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Supelco</td><td>1.04873.1000</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Kimtech Science</td><td>7552</td><td></td></tr><tr><td>대형 팔콘 튜브 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>Centrifuge 5810 R</td><td></td></tr><tr><td>L-Arginine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5006-100G</td><td></td></tr><tr><td>광학 현미경</td><td>Leica</td><td>DM LS2</td><td></td></tr><tr><td>L-Ornithine</td><td>Roth</td><td>T204.1</td><td></td></tr><tr><td>LSM 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경</td><td>Zeiss</td><td>LSM 710 ConfoCor 3</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Microfluidic chip</td><td>Homemade&nbsp;</td><td>PDMS 기반</td><td>DOI : https://doi.org/10.1039/C8LC01275J</td></tr><tr><td>Na-ADP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2754-1G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Supelco</td><td>1.06404.1000</td><td></td></tr><tr><td>나노 드롭 분광계</td><td>Isogen Life Science</td><td>ND-1000 분광 광도계 NanoDrop</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Supelco</td><td>1.06498.1000</td><td></td></tr><tr><td>GUV 용 바늘</td><td>Henke-Ject</td><td>14-14575</td><td>27 G x 3/4 ''0.4 x 20 mm</td></tr><tr><td>바늘 미세 유체</td><td>공학 Henke-Ject</td><td>14-15538</td><td>18 G x 1 1/2 ''1.2 x 40 mm</td></tr><tr><td>Ni2+ Sepharose</td><td>Cytiva</td><td>17526802</td><td></td></tr><tr><td>Nigericin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7143-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Nutator</td><td>VWR</td><td>83007-210</td><td></td></tr><tr><td>삼투압 측정기</td><td>Gonotec Salmenkipp</td><td>Osmomat 3000 기본 동결 점 삼투압계</td><td></td></tr><tr><td>플라즈마클리너</td><td>플라즈마 에칭</td><td>PE-Avenger</td><td></td></tr><tr><td>폴리카보네이트 필터</td><td>Cytiva Whatman</td><td>Nuclepor 트랙-에칭 멤브레인 제품: 10417104</td><td>0.4 &마이크로; m</td></tr><tr><td>폴리카보네이트 초원심분리기 튜브</td><td>Beckman Coulter</td><td>355647</td><td></td></tr><tr><td>Pyranine</td><td>Acros Organics</td><td>H1529-1G</td><td></td></tr><tr><td>Quartz 큐벳 (검정)</td><td>Hellma Analytics</td><td>108B-10-40</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-75 resin&nbsp;</td><td>GE 헬스케어</td><td>17-0050-01</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Sonics Sonics & 재료 INC</td><td>Sonics vibra cell</td><td></td></tr><tr><td>주사기 필터</td><td>Sarstedt</td><td>Filtropur S 플러스 0.2 0.2</td><td>&micro; m</td></tr><tr><td>주사기 펌프</td><td>하버드 장치</td><td>A-42467</td><td></td></tr><tr><td>탁상용 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>원심분리기 5418</td><td></td></tr><tr><td>테플론 스페이서</td><td>홈메이드&nbsp;</td><td>테프론 기반</td><td>45 x 26 x 1.5 또는 45 x 26 x 3 또는 20 x 20 x 3 mm</td></tr><tr><td>Tris</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A1086.1000</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>초원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima Max-E</td><td></td></tr><tr><td>UV 램프</td><td>Spectroline</td><td>ENB-280C/FE</td><td></td></tr><tr><td>UV/VIS 분광계</td><td>Jasco</td><td>V730 분광 광도계</td><td></td></tr><tr><td>Valinomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V0627-10MG</td><td></td></tr><tr><td>광시야 형광 현미경</td><td>Zeiss</td><td>AxioObserver</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Casein</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5890-500g</td><td></td></tr></tbody></table>

나노미터 및 마이크로미터 크기의 소포에서 평형을 벗어난 대사 네트워크 구축

Construction of Out&#45;of&#45;Equilibrium Metabolic Networks in Nano&#45; and Micrometer&#45;Sized Vesicles

정제된 구성 요소를 사용하여 통합 막 단백질, 효소 및 형광 기반 센서를 포함하는 복잡한 단백질 네트워크를 소포에 통합하는 방법을 제시합니다. 이 방법은 생물 반응기의 설계 및 건설과 복잡한 평형 외 대사 반응 네트워크 연구와 관련이 있습니다. 우리는 이전에 개발된 프로토콜에 따라 (다중) 막 단백질을 큰 단층 소포(LUV)로 재구성하는 것으로 시작합니다. 그런 다음 동결-해동-압출을 통해 정제된 효소, 대사 산물 및 형광 기반 센서(형광 단백질 또는 염료)의 혼합물을 캡슐화하고 원심분리 및/또는 크기 배제 크로마토그래피를 통해 통합되지 않은 구성 요소를 제거합니다. 대사 네트워크의 성능은 형광 판독을 통해 ATP/ADP 비율, 대사 산물 농도, 내부 pH 또는 기타 매개변수를 모니터링하여 실시간으로 측정됩니다. 100-400 nm 직경의 막단백질 함유 소포는 기존의 최적화된 절차를 사용하여 거대 단층 소포(GUV)로 전환할 수 있습니다. 이 접근법을 사용하면 용해성 구성 요소(효소, 대사 산물, 센서)를 마이크로미터 크기의 소포에 포함할 수 있으므로 생물반응기의 부피를 수십 배로 늘릴 수 있습니다. GUV를 포함하는 대사 네트워크는 광학 현미경으로 분석하기 위해 미세유체 장치에 갇혀 있습니다.

리포좀에서 용해된 막 단백질의 재구성은 미리 형성된 소포의 불안정화를 필요로 합니다. 소량의 Triton X-100을 추가하면 초기에 소포의 팽창으로 인한 광 산란의 증가로 인해 540nm(A540)에서 흡광도가 증가합니다(그림 4). 최대 A540 값은 리포좀이 세제로 포화되는 지점(Rsat)이며, 그 후 Triton X-100을 더 추가하면 소포가 부분적으로 용해됩니다. Rsol에서 리포좀은 완전히 용해됩니다(그림 4). 막 단백질의 재구성을 위해 일반적으로 Rsat(화살표로 표시)보다 60% 이상 불안정한 소포를 사용합니다.
재구성 된 막 단백질 ArcD는 L-아르기닌을 소포로 운반하고 L-오르니틴을 소포 밖으로 운반하는 데 사용되며 캡슐화 된 효소 ArcA, ArcB 및 ArcC와 함께 사용하여 ADP 및 무기 인산염에서 ATP를 재활용합니다. GlpT는 글리세롤 3-인산/인산염 항운반체로, GlpK와 함께 글리세롤과 L-아르기닌 분해에 의해 생성된 ATP의 글리세롤 3-인산염의 합성(및 배설)에 필요합니다. t = 0 에서 5mM L-아르기닌을 프로테올리포좀에 추가하면 500 및 430 nm excitation39에서 PercevalHR 형광의 비율이 급격히 증가하며, 이는 소포 내부의 ATP/ADP 비율을 반영합니다(그림 5). 글리세롤을 첨가하면 ATP가 글리세롤 3-포스페이트의 합성에 사용되어 ATP/ADP 비율(28)이 낮아집니다. L-아르기닌의 분해는 또한 pH 변화를 일으키며, 이는 피라닌 또는 pHluorin27을 사용하여 정량화할 수 있습니다.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig05v2.jpg"> 그림 5: L-아르기닌 분해 경로에 의한 ATP의 재활용. 2.7mg의 지질/mL의 LUV를 큐벳에 배치하고 500nm 및 430nm에서 형광 비율을 기록합니다. 5mM의 L-아르기닌이 t = 0에서 첨가됩니다. F500/F430 비율은 소포 내부의 ATP/ADP 비율을 측정한 것입니다. 약어: LUVs = large-unilamellar vesicles. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
ATP를 생성하는 LUV는 GUV를 형성하는 데에도 사용할 수 있습니다. LGT 아가로스 겔에서 건조된 proteo-LUV를 재수화하면 마이크로미터 크기의 소포가 형성됩니다(그림 6). 건조된 LUV 반점 내에서 단백질-GUV의 형성은 지질의 국소 농도와 탈수 정도에 따라 크게 달라집니다. 일부 영역에는 GUV의 큰 패치가 있는 반면 동일한 액적의 다른 위치에서는 GUV가 형성되지 않거나 거의 형성될 수 없습니다. LGT 아가로스 보조 팽창을 통한 GUV의 형성은 일반적으로 수 마이크로미터에서 50 μm 이상에 이르는 다양한 GUV 크기를 초래합니다.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig06v2.jpg"> 그림 6: 겔 보조 팽창에 의해 형성된 proteoGUV의 DIC 이미지. 눈금 막대 = 25μm. 약어: DIC = 차동 간섭 대비; GUV = 거대-단층 소포. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
GUV는 β-카제인 부동태화 PDMS 기반 미세유체 장치에 채취되어 포집됩니다(그림 7). 이 장치는 단일 실험으로 많은 소포를 포획하고 분석할 수 있도록 설계되었으며 장치는 외부 환경(유속, 완충액 조성 등)을 제어하는 데 사용됩니다. 34. proteo-GUV의 수율이 낮더라도 미세유체 칩을 통한 GUV의 일정한 흐름으로 많은 소포를 수집할 수 있습니다. 충분한 GUV가 포집되면 시스템을 삼투압 균형 잡힌 완충액으로 세척하여 용해성 단백질, 소분자 및 형광 프로브와 같은 외부 구성 요소를 제거합니다. 그런 다음 세척 완충액은 50mM KPi(pH 7.0), 다양한 양의 포도당(삼투압 조정용) 및 10mM L-아르기닌과 같은 기질을 포함하는 동일한 삼투압의 기질 용액으로 교체됩니다. 미세유체 칩의 여러 트랩에서 시계열 실험이 수행되며 90초(PercevalHR 사용 시 405nm 및 488nm 여기)마다 이미지를 촬영합니다. 또한 각 시점에서 명시야 이미지가 촬영됩니다. 488 및 405 nm에서 여기 후 방출 강도의 비율은 소포의 ADP/ATP 비율을 측정한 것입니다.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig07.jpg"> 그림 7: 미세유체 칩을 사용한 소포의 포집. (A) 외부 환경과 유속을 제어할 수 있는 능력을 동반한 소포의 포획. (B) 미세유체 장치에 갇혀 405nm 레이저(녹색) 및 488 레이저(빨간색)로 여기되는 ProteoGUV. 두 채널 모두 방출은 &gt;500nm에서 측정됩니다. brightfield 이미지를 사용하면 형광 없이 소포를 시각화할 수 있습니다. 눈금 막대 = 25μm. 약어: GUVs = giant-unilamellar vesicles. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig07large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

우리는 막 단백질을 재구성하고 효소 및 기타 수용성 구성 요소를 마이크로미터 미만 및 마이크로미터 크기의 지질 소포에 캡슐화하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

We present a method to incorporate into vesicles complex protein networks, involving integral membrane proteins, enzymes, and fluorescence-based sensors, ...

네덜란드의 BaSyC 컨소시엄은 분자 구성 요소로부터 합성 세포를 만드는 것을 목표로 합니다. BaSyC 컨소시엄은 분자 생물학에서 화학, 물리학 및 컴퓨터 과학에 이르는 연구 그룹으로 구성되어 있습니다. 이 컨소시엄의 목표는 자율적으로 성장하여 정보를 전송하고 분할할 수 있는 자기 복제 시스템을 만드는 것입니다.그리고 우리는 현재 더 복잡한 분자 시스템을 향해 통합된 분자 네트워크를 구축하는 데 중점을 두고 있습니다. 합성 생물학의 최근 발전에는 세포 기능을 위한 모듈 엔지니어링이 포함되며, 이를 진단, 치료, 합성 면역학 및 적응 물질 응용 분야를 위한 복잡한 네트워크에 통합합니다. 이러한 진전은 유럽, 미국 및 아시아의 그룹에 걸쳐 있으며, 합성 세포 구축에 대한 하향식 및 상향식 접근 방식을 모두 발전시키고 있습니다.우리 분야의 현재 기술에는 대사 네트워크를 구성하고 최적화하는 엔지니어링 및 진화 방법이 포함됩니다. 우리는 분자 선택에 AI를 사용하고 구성 요소 분리 및 네트워크 형성을 위한 고급 생화학 및 생물물리학 기술을 사용합니다. 우리는 또한 막 재구성, 물리적 캡슐화 및 형광 분광법 및 현미경을 통한 시각화를 사용합니다.모듈의 통합으로 막 단백질과 효소의 수가 엄청나게 증가하여 당사의 재구성 및 캡슐화 기술에 제약이 가해지고 있습니다. 확률적 캡슐화(Stochastic encapsulation)는 서브미크론 크기의 소포에서 문제가 되며, 지질막에서 여러 막 단백질이 재구성될 때 마이크로미터 크기의 소포 형성 효율성이 감소합니다. 흐로닝언에서는 ATP 생산을 위한 대사 네트워크를 개발하고 기판 공급 및 제품 수출을 통해 평형 상태를 유지했습니다.또한 ATP 재활용을 지질 전구체의 합성 및 배설과 연결하여 2차 소포가 지질을 생산할 수 있도록 했으며, 이는 우리 분야에서 중요한 발전입니다.

construction-out-equilibrium-metabolic-networks-nano-micrometer-sized

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

여기에서 우리는 소포, 전사 및 번역 기계 캡슐, 단백질 생산의 모니터링 준비를위한 간단한 방법을 설명합니다. 그 결과 세포가없는 시스템은 점점 더 복잡 해지는 세포의 모방을 구축하기 시작 지점으로 사용할 수 있습니다.

휴대 모방 자의 건설을위한 소포는의 셀이없는 전사 및 번역 기계의 캡슐화

제시된 프로토콜은 공극 스패닝 무용매 지질 이중층을 사용하여 단일 수송체 수준에서 막 단백질 매개 수송을 분석하는 방법을 설명합니다. 이는 대단히 병렬적인 데이터 수집 및 분석과 결합된 대량 생산된 나노포어 어레이 칩을 생성함으로써 달성되며, 향후 멤브레인 단백질 이펙터 스크리닝의 확립을 가능하게 합니다.

멤브레인 운송은 단일 단백질 해상도에서 고도의 병렬 나노 기공 칩 시스템에 의해 분석 처리합니다

많은 단백질이 막 표면에 부착될 때 기능을 수행합니다. 나노 디스크 막에 대한 외인성 단백질의 결합은 투과 전자 현미경에 의해 간접적으로 이미지화될 수 있습니다. 우리는 음성 염색 인산 텅스텐 산 나트륨에 의해 유도 된 나노 디스크의 특징적인 적층 (rouleau)이 외인 단백질의 결합에 의해 방지된다는 것을 보여줍니다.

방법은 시각화 및 투과 전자 현미경에 의해 막 상호 작용하는 단백질을 분석하는

셀에 많은 단백질을 감지 하 고 막 곡률을 유도. 곡선된 막 체 외단백질 또는 어떤 곡률 활성 분자의 상호작용을 연구 하는 지질 소포에서 막 나노튜브를 당겨 하는 방법을 설명 합니다.

거 대 한 Unilamellar 소포에서 막 나노튜브를 당기

솔리드-지원, 단백질-무료, 이중 인지질 bilayer 막 (DLBM) 복잡 하 고 동적 지질 나노튜브 네트워크로 변형 될 수 있다 고 바인딩과 그물의 2D 상향식 모델로 사용할 수 있습니다.

자발적인 형성 및 바인딩과 그물에 대 한 상향식 모델로 인공 지질 나노튜브 네트워크의 재배치

이 프로토콜은 거대한 유니라멜라 지질 소포와 함께 글라이딩 키네신 운동성을 사용하여 지질 나노튜브 네트워크를 제조하는 과정을 기술한다.

글라이딩 키네신 운동성 분석을 이용한 다성분 지질 나노튜브 네트워크 제작

유기 및 수성 용매의 계면에서 맞춤형 양피 성 엘라스틴과 같은 단백질은 환경 매개 변수에 의해 유발되는 소포, 섬유 및 응고체와 같은 복잡한 상분자 구조로 조립됩니다. 설명된 조립 프로토콜은 튜닝 가능한 특성을 가진 단백질 멤브레인 기반 구획(PMBC)을 생성하여 다양한 화물을 캡슐화할 수 있도록 합니다.

엘라스틴과 같은 단백질을 체외에서 정의된 수분자 구조 및 화물 캡슐화로 조립하도록 지시

이 원고에서는 F-actin 세포 골격을 거대한 unilamellar 지질 소포 (리포솜이라고도 함)로 캡슐화하는 실험 기술과 리포솜 막의 내부 전단지에 피질 생모방 F- 액틴 층을 형성하는 방법을 보여줍니다.

체외 거대한 Unilamellar 소포 내부의 Actin Cytoskeleton 재구성

본 프로토콜은 생체적합성 리포솜을 생성하기 위한 미세유체 기술인 옥탄올 보조 리포솜 어셈블리(OLA)를 설명합니다. OLA는 효율적인 캡슐화를 통해 단분산 미크론 크기의 리포솜을 생산하여 즉각적인 온칩 실험이 가능합니다. 이 프로토콜은 합성 생물학 및 합성 세포 연구에 특히 적합할 것으로 예상됩니다.

생명공학을 위한 온칩 옥탄올 보조 리포솜 어셈블리

이 기사에서는 상으로 분리된 거대 소포 내부의 세포골격 네트워크의 간단한 원팟 재구성을 소개합니다. 이 방법은 일반화되어 광범위한 생체 분자의 캡슐화 또는 제한에 적용될 수 있습니다.

시험관 내 상분리된 거대 단일층 소포(GUV) 내부 세포골격 네트워크의 재구성

학습하세요 합성세포 구축을 위한 막단백질 재구성 및 효소 캡슐화 기법. 리포솜 기반 대사 네트워크를 활용한 자율성장 시스템 개발 방법론을 탐색합니다.

나노미터 및 마이크로미터 크기의 소포에서 평형을 벗어난 대사 네트워크 구축

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