Name: 철분 결핍과 혐기성 성장에 따른 Yersinia pseudotuberculosis Type III 분비 시스템 활동의 정량화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-31T13:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: 배우세요 Yersinia pseudotuberculosis의 Type III 분비 시스템 활동을 철분과 산소 조건에 따라 정량화하는 방법을. 이 연구는 병원균의 독성 인자 조절 메커니즘을 이해하는 데 도움을 줍니다.

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<meta charset="utf8"></head><body>철분 고갈 및 혐기성 스트레스 하에서 Yersinia pseudotuberculosis 에서의 T3SS 활동

<ol><li>Deng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly%2C+structure%2C+function+regulation+of+type+III+secretion+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Assembly, structure, function regulation of type III secretion systems.</a> Nat Rev Microbiol. 15 (6), 323-337 (2017).</li>
<li>Springer International Publishing. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Bacterial+Type+III+Protein+Secretion+Systems%22">Bacterial Type III Protein Secretion Systems</a>. 427, Springer International Publishing. Cham. (2020).</li>
<li>Schubert, K. A., Xu, Y., Shao, F., Auerbuch, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Yersinia+type+III+secretion+system+as+a+tool+for+studying+cytosolic+innate+immune+surveillance%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Yersinia type III secretion system as a tool for studying cytosolic innate immune surveillance.</a> Annu Rev Microbiol. 74, 221-245 (2020).</li>
<li>Cassat, J. E., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+in+infection+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Iron in infection and immunity.</a> Cell Host Microbe. 13 (5), 509-519 (2013).</li>
<li>Singhal, R., Shah, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+battle+in+the+gut%3A+Hypoxia+and+hypoxia-inducible+factors+in+metabolic+and+inflammatory+responses+in+the+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Oxygen battle in the gut: Hypoxia and hypoxia-inducible factors in metabolic and inflammatory responses in the intestine.</a> J Biol Chem. 295 (30), 10493-10505 (2020).</li>
<li>Marteyn, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+Shigella+virulence+in+response+to+available+oxygen+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Modulation of Shigella virulence in response to available oxygen in vivo.</a> Nature. 465 (7296), 355-358 (2010).</li>
<li>Rakin, A., Schneider, L., Podladchikova, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hunger+for+iron%3A+the+alternative+siderophore+iron+scavenging+systems+in+highly+virulent+Yersinia%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Hunger for iron: the alternative siderophore iron scavenging systems in highly virulent Yersinia.</a> Front Cell Infect Microbiol. 2, (2012).</li>
<li>Lesic, B., Carniel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horizontal+Transfer+of+the+high-pathogenicity+island+of+Yersinia+pseudotuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Horizontal Transfer of the high-pathogenicity island of Yersinia pseudotuberculosis.</a> J Bacteriol. 187 (10), 3352-3358 (2005).</li>
<li>Green, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fis+is+essential+for+Yersinia+pseudotuberculosis+virulence+and+protects+against+reactive+oxygen+species+produced+by+phagocytic+cells+during+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Fis is essential for Yersinia pseudotuberculosis virulence and protects against reactive oxygen species produced by phagocytic cells during infection.</a> PLOS Pathog. 12 (9), e1005898(2016).</li>
<li>Cornelis, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Yersinia+Ysc-Yop+%26%2334%3BType+III%26%2334%3B+weaponry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The Yersinia Ysc-Yop &#34;Type III&#34; weaponry.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (10), 742-753 (2002).</li>
<li>Cheng, L. W., Anderson, D. M., Schneewind, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+independent+type+III+secretion+mechanisms+for+YopE+in+Yersinia+enterocolitica%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Two independent type III secretion mechanisms for YopE in Yersinia enterocolitica.</a> Mol Microbiol. 24 (4), 757-765 (1997).</li>
<li>Straley, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+low-Ca2%2B+response+virulence+regulon+of+human-pathogenic+yersiniae%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Pathog%22%5BJournal%5D)">The low-Ca2+ response virulence regulon of human-pathogenic yersiniae.</a> Microbial Pathog. 10 (2), 87-91 (1991).</li>
<li>Balada-Llasat, J. -M., Mecsas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yersinia+has+a+tropism+for+B+and+T+cell+zones+of+lymph+nodes+that+is+independent+of+the+type+III+secretion+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Yersinia has a tropism for B and T cell zones of lymph nodes that is independent of the type III secretion system.</a> PLoS Pathog. 2 (9), e86(2006).</li>
<li>Adams, W., Morgan, J., Kwuan, L., Auerbuch, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yersinia+pseudotuberculosis+YopD+mutants+that+genetically+separate+effector+protein+translocation+from+host+membrane+disruption%3A+YopD+central+region+promotes+Yop+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Yersinia pseudotuberculosis YopD mutants that genetically separate effector protein translocation from host membrane disruption: YopD central region promotes Yop translocation.</a> Mol Microbiol. 96 (4), 764-778 (2015).</li>
<li>Hooker-Romero, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+availability+and+oxygen+tension+regulate+the+Yersinia+Ysc+type+III+secretion+system+to+enable+disseminated+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Iron availability and oxygen tension regulate the Yersinia Ysc type III secretion system to enable disseminated infection.</a> PLOS Pathog. 15 (12), e1008001(2019).</li>
<li>Balderas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+scale+analysis+reveals+IscR+directly+and+indirectly+regulates+virulence+factor+genes+in+pathogenic+Yersinia%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Genome scale analysis reveals IscR directly and indirectly regulates virulence factor genes in pathogenic Yersinia.</a> mBio. 12 (3), e00633-00721 (2021).</li>
<li>Bearden, S. W., Perry, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Yfe+system+of+Yersinia+pestis+transports+iron+and+manganese+and+is+required+for+full+virulence+of+plague%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Yfe system of Yersinia pestis transports iron and manganese and is required for full virulence of plague.</a> Mol Microbiol. 32 (2), 403-414 (1999).</li>
<li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+iron+assimilation+and+fur+regulation+in+Yersinia+pestis%3A+Global+analysis+of+iron+assimilation+and+fur+regulation+in+Yersinia+pestis%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">Global analysis of iron assimilation and fur regulation in Yersinia pestis: Global analysis of iron assimilation and fur regulation in Yersinia pestis.</a> FEMS Microbiol Lett. 258 (1), 9-17 (2006).</li>
<li>Wijerathne, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+new+class+of+%5B2Fe-2S%5D+protein+that+functions+in+bacterial+iron+homeostasis%2C+requires+a+structural+anion+binding+site%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">a new class of [2Fe-2S] protein that functions in bacterial iron homeostasis, requires a structural anion binding site.</a> Biochemistry. 57 (38), 5533-5543 (2018).</li>
<li>Bearden, S. W., Staggs, T. M., Perry, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ABC+transporter+system+of+Yersinia+pestis+allows+utilization+of+chelated+iron+by+Escherichia+coli+SAB11%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">An ABC transporter system of Yersinia pestis allows utilization of chelated iron by Escherichia coli SAB11.</a> J Bacteriol. 180 (5), 1135-1147 (1998).</li>
<li>Miller, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IscR+is+essential+for+Yersinia+pseudotuberculosis+type+III+secretion+and+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">IscR is essential for Yersinia pseudotuberculosis type III secretion and virulence.</a> PLoS Pathog. 10 (6), e1004194(2014).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>10 mL Luer-Lok 팁 주사기</td><td>BD</td><td>301029</td><td></td></tr><tr><td>10x SDS 러닝 버퍼&nbsp;</td><td>집에서 만든</td><td></td><td>0.25 M Tris base, 1.92 M Glycine, 1% SDS를 1 L 용량에</td></tr><tr><td>12.5% SDS-Page Gel</td><td>집에서 만든</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL 배양 튜브</td><td>Falcon</td><td>352059</td><td>초기 하룻밤을 위해&nbsp;</td></tr><tr><td>15 mL Falcon 튜브</td><td>Falcom</td><td>352196</td><td>상층액 수집용</td></tr><tr><td>250 mL 배양 플라스크</td><td>Belco</td><td>251000250</td><td></td></tr><tr><td>500 mL 필터 시스템</td><td>Corning</td><td>431097</td><td></td></tr><tr><td>6 N 염산 용액</td><td>Fisher Scientific</td><td>7732185</td><td></td></tr><tr><td>아세톤</td><td>Fisher Chemical</td><td>A949-4</td><td>4 L</td></tr><tr><td>Bio Rad ChemiDoc MP 이미징 시스템</td><td>Bio Rad</td><td>모델 번호 : Universal Hood III</td><td></td></tr><tr><td>붕규산 유리 배양 튜브</td><td>Fisherbrand</td><td>14-961-34</td><td>혐기성 배양 용</td></tr><tr><td>Chelex 100 수지</td><td>Bio Rad</td><td>142-1253</td><td></td></tr><tr><td>Chelex M9 + 0.9 % 포도당 매체</td><td>홈 메이드</td><td></td><td>6 g/L Na2HPO4, 3 g/L KH2PO4, 0.5 g/L NaCl, 1 g/L NH4Cl, 1% 카사미노산, < 강>0.9 % 포도당 < / 강>, 0.0005 % 티아민, 5g / L Chelex 100 수지. 실온에서 18 시간 동안 매체를 교반하고 500 mL 코닝 여과 장치를 사용하여 여과 한 다음 1 mM MgS<O>><4 최종 용액</td></tr><tr><td>최종 샘플 버퍼 (FSB)</td> <td>집에서 만든</td><td></td><td>0.1 M Tris-HCl, 4 % SDS, 20 % 글리세롤, 0.2 %의 브로 모페놀 블루</td></tr><tr><td>FSB를 추가합니다. DTT 솔루션</td><td>집에서 만든</td><td></td><td>FSB + 0.2M DTT</td></tr><tr><td>이미지 랩 소프트웨어</td><td>Bio Rad</td><td>https://www.bio-rad.com/en-us/product/image-lab-software?ID=KRE6P5E8Z</td><td>소프트웨어</td></tr><tr><td>Isotemp 열 블록</td><td>Fisher Scientific</td><td>88860021</td><td></td></tr><tr><td>LB 한천 플레이트</td><td>집에서 만든</td><td></td><td>10g 트립톤, 5g 효모 추출물, 10g NaCl, 15g 한천 총 부피 1L. 오토클레이</td></tr>브 <tr><td>M9+0.2% 포도당 매체</td><td>가정은</td><td></td><td>6 g/L Na2HPO4, 3 g/L KH2PO4, 0.5 g/L NaCl, 1 g/L NH4Cl, 1 mM MgSO4, 1 mg/L FeSO47H2O, 1% 카사미노산, 0.2% 덱스트로스, 0.0005% 티아민&nbsp;</td></tr><tr><td>Millex-GP PES 0.22um 주사기용 필터 부착물</td><td>Millipore</td><td>SLGPR33RS</td><td>FeSO47H2O 여과용</td></tr><tr><td>Millex-GV PVDF 0.22um 필터 부착 주사기용</td><td>Millipore</td><td>SLGVR33RS</td><td>상등액 여과용</td></tr><tr><td>Precision Plus Protein 염색되지 않은 표준</td><td>Bio Rad</td><td>1610363</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE 젤 장치</td><td>Bio Rad</td><td>모델 번호: Mini PROTEAN Tetra Cell</td><td></td></tr><tr><td>SilverXpress 실버 스테인 키트&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>LC6100</td><td></td></tr><tr><td>The BellyDancer Shaker</td><td>IBI Scientific</td><td>BDRAA1155</td><td></td></tr><tr><td>Trichloroacetic acid solution 6.1N</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T0699</td><td></td></tr><tr><td>Vinyl Anaerobic Chamber</td><td>Coy Lab Products</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>https://coylab.com/products/anaerobic-chambers/vinyl-anaerobic-chambers/#detailsqPCR 프라이머 서열&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>yfeA 전진 - CAC AGT CAG CAG ACC TTA TCT T</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>yfeA 역 - GGC AGA CGG GAC ATC TTT AAT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>bfd 전진 - CCAGCATCAGCCCCATACAG</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BFD 역 - tggcttgtcggatgcacttc</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>yopE 전진 - CCATAAACCGGTGGTGAC</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>yopE reverse - CTTGGCATTGAGTGATACTG</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

철분 결핍과 혐기성 성장에 따른 yersinia pseudotuberculosis type iii 분비 시스템 활동의 정량화

Quantifying Yersinia pseudotuberculosis Type III Secretion System Activity Following Iron Starvation and Anaerobic Growth

이 방법을 사용하면 관심 있는 참조 조건과 관련된 다양한 조건에서 분비된 Yops를 상대적으로 비교할 수 있습니다. 전체 실험 워크플로우는 그림 1에 나와 있습니다. 표 1은 각 배양 조건의 인스턴스에서 세포 배양 정규화가 일반적으로 어떻게 발생하는지와 각 상층액에 추가되는 TCA의 부피를 나타냅니다. 여기서, 대표적인 결과는 야생형(WT) Y. pseudotuberculosis IP2666pIB1과 두 개의 선천성 돌연변이인 ΔyscNU 및 ΔyopE를 사용하여 표시되었습니다. ΔyopE 돌연변이는 YopE가 결핍된 대조군으로 사용되는 반면, ΔyscNU 돌연변이는 기능적 T3SS13,14를 조립할 수 없기 때문에 완전한 T3SS 음성 대조군으로 사용됩니다. 분비된 단백질을 포함하는 은염색 12.5% SDS-PAGE 겔의 대표적인 이미지는 그림 2에 나와 있습니다. 위에서 설명한 바와 같이, 각 샘플에는 단백질 침전 효율에 대한 대조군으로 스파이크인 BSA가 포함되어 있습니다. 데이터를 분석할 때, 혐기성 및 호기성 데이터 세트는 각각이 별도로 정규화되었기 때문에 독립적인 데이터 세트로 취급되어야 합니다. 혐기성 샘플에서는 고철 샘플에 비해 저철분 샘플에서 ~38배 더 많은 YopE가 존재했으며, 이는 이전 결과15,16과 일치합니다. 호기성 샘플에서, 낮은 철분 샘플과 높은 철분 샘플에서 유사한 양의 분비된 YopE가 관찰되었으며, 이는 이전 결과와 일치한다16. 일반적으로 통계적 유의성을 확립하기 위해 각 조건에 대한 최소 3개의 생물학적 복제가 사용됩니다.
이 프로토콜이 적절한 철분 결핍을 초래하는지 확인하기 위해 모든 조건에서 야생형 균주의 철 반응성 유전자 yfeA 및 bfd에 대해 qPCR 분석을 수행했습니다. YfeA는 철 수송을 담당하는 ABC 수송 시스템의 주위 결합 단백질이며, Bfd는 철 저장17 , 18 , 19 , 20 의 동원에 관여하는 박테리오 페리틴 관련 페레독신입니다. RNA는 앞서 설명한 바와 같이 분리되었으며,21 에서 볼 수 있듯이 예상대로 yfeA 및 bfd는 철이 풍부한 조건에 비해 철이 고갈된 조건에서 호기성 및 혐기성으로 유의하게 상향 조절되었습니다. 또한 qPCR을 사용하여 yopE mRNA 정상 상태 수준을 정량화하여 단백질 수준에서 상대 YopE에 대해 관찰된 결과가 yopE 전사체 수준과 일치하는지 확인했습니다(그림 3 참조).
마지막으로, 박테리아는 스트레스가 많은 배양 조건에서 용해되기 쉽기 때문에 이 프로토콜의 단계가 잠재적으로 결과를 혼동시킬 수 있는 박테리아 용해를 초래하지 않는다는 것을 보여주는 것이 중요했습니다. 이를 확인하기 위해 TCA 침전된 상등액 샘플을 웨스턴 블로팅(western blotting)하고 RNA 중합효소 및 세포질 단백질의 하위 단위체인 YopE 및 RpoA를 조사했습니다. 그림 4에서 볼 수 있듯이 YopE 발현 패턴은 그림 3에 표시된 패턴을 따랐지만 샘플 상등액에 RpoA가 존재한다는 증거는 없었으며, 이는 세포질 RpoA를 상등액으로 방출하는 관찰 가능한 용해가 없음을 시사합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66642/66642fig01.jpg"> 
그림 1: 다양한 철분 및 산소 가용성에서 Yersinia pseudotuberculosis가 성장하기 위한 실험 워크플로우. 배양 단계를 그래픽으로 표현합니다. 산성 세척 유리 제품은 4일차부터 사용해야 합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66642/66642fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66642/66642fig02.jpg"> 
그림 2: 배양 상등액에서 TCA 침전 단백질의 은 염색 12.5% SDS-PAGE 겔의 결과. 침전된 배양 상등액을 12.5% SDS-PAGE 젤 및 은 염색 처리한 용액에 적재하였다. (A) 혐기성으로 성장한 WT, ΔyscNU 및 ΔyopE 균주의 분비 프로필. 혐기성 WT 철이 풍부한 샘플로 정규화된 YopE의 대표적인 상대값. (B) 호기성으로 성장한 WT, ΔyscNU 및 ΔyopE 균주의 분비 프로필. YopE의 대표적인 상대값은 호기성 WT 철이 풍부한 샘플로 정규화되었습니다. 흰색 화살표는 YopE(~23kDa)를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66642/66642fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66642/66642fig03.jpg"> 
그림 3: 철에 반응하는 유전자의 상대적 mRNA 수치는 철 결핍을 보여줍니다. RNA는 도 1에 기술된 조건에서 배양된 WT Y. pseudotuberculosis로부터 분리하였다. qPCR은 혐기성(A-C) 및 호기성(D-F) 조건에서 16S rRNA로 정규화된 yfeA, bfd 및 yopE 수준의 상대적 발현을 측정하는 데 사용되었습니다. *p &lt; 0.0001은 짝을 이루지 않은 t-테스트에 의해 결정됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66642/66642fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66642/66642fig04.jpg"> 
그림 4: 상등액 샘플에서 세포질 RpoA가 부족하다는 것은 배양 조건에서 세포 용해가 부족함을 보여줍니다.그림 3의 (A) 혐기성 및 (B) 호기성 샘플의 침전된 상등액 5μL를 펠릿 대조군과 함께 12.5% SDS-PAGE 겔에서 실행했습니다. 단백질은 웨스턴 블로팅(western blotting)을 위해 PVDF 멤브레인으로 옮겨졌습니다. 멤브레인을 절단하고 위쪽 절반은 항-RpoA 항체를 사용하여 RpoA를 조사하고 아래쪽 절반은 항-YopE 항체를 사용하여 YopE를 조사했습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66642/66642fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">(가)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">혐 기성</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>조건</td>
			<td>최저가</td>
			<td>수집 부피 (mL)</td>
			<td>Sup에 6.1N TCA 추가 부피(mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WT 로우 아이언</td>
			<td>0.5</td>
			<td>6</td>
			<td>0.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WT 하이 아이언</td>
			<td>1</td>
			<td>3</td>
			<td>0.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">(나)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">에어로빅</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>조건</td>
			<td>최저가</td>
			<td>수집 부피 (mL)</td>
			<td>Sup에 6.1N TCA 추가 부피(mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WT 로우 아이언</td>
			<td>0.9</td>
			<td>6</td>
			<td>0.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WT 하이 아이언</td>
			<td>1.4</td>
			<td>3.857</td>
			<td>0.386</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 1: 대표적인 검체 채취 워크플로우. 5일째, (A) 혐기성 샘플에 대해 37°C에서 4시간 배양이 완료되면 OD600 값이 가장 낮은 샘플 6mL를 수집하고 그에 따라 나머지 샘플 부피를 정규화했습니다. 상등액을 여과한 후, 6.1 N TCA를 첨가하였다. (B) 호기성 배양(26°C에서 2시간, 37°C에서 4시간)이 완료되면 OD600 값이 가장 낮은 샘플 6mL를 수집하고 그에 따라 나머지 샘플 부피를 정규화했습니다. 상등액을 여과한 후, 6.1 N TCA를 첨가하였다.

철분 결핍과 혐기성 성장에 따른 Yersinia pseudotuberculosis Type III 분비 시스템 활동의 정량화

A key virulence mechanism for many Gram-negative pathogens is the type III secretion system (T3SS), a needle-like appendage that translocates cytotoxic or ...

quantifying-yersinia-pseudotuberculosis-type-iii-secretion-system

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오에서는, 우리는 효모와 효과기 유발 성장 저해 phenotypes의 식별에 세균성 유형 III의 effectors의 표현을위한 절차를 설명합니다. 이러한 phenotypes는 이후 이펙터 기능과 목표를 명료하게하다에 악용될 수 있습니다.

성장 저해 Phenotypes의 확인은 효모에서 세균의 종류 III Effectors 표현에 의해 유도된

출처: Gupta, S., et al. 철 제한 마이코박테리아에 의해 생성된 세포외 소포의 분리 및 특성화. J. Vis. 경험. (2019년)이 비디오는 철분 제한 조건에서 결핵균 을 배양하여 철분 스트레스를 유도하고 박테리아 생존을 지원하는 시데로포어의 분비를 촉진하는 절차를 보여줍니다.

철분 제한 조건에서 결핵균 배양

그람 음성 예르시니아 종과 비예르시니아 장내세균과의 배양으로 시작하십시오.멸균 바늘 접종기를 사용하여 배양물을 전통적인 Cefsulodin-Irgasan-Novobiocin 또는 CIN 한천과 변형된 CIN 한천 모두에 점착시킵니다.박테리아 성장을 촉진하기 위해 플레이트를 배양합니다.전통적인 CIN 한천과 변형된 CIN 한천은 모두 만니톨을 발효시켜 산성 부산물을 생성하는 예 르시니아 및 비-예르시니아 장내세균과의 성장을 지원합니다.산 생성은 pH를 낮추고 색상 변화를 유발하여 특징적인 적색 중심 콜로니 형태를 생성합니다.변형된 CIN 한천에는 비-Yersinia Enterobacteriaceae에 의해 발현되는 특정 효소 활성을 검출하는 추가 기질이 포함되어 있습니다.이 박테리아는 기질을 대사하여 pH 변화 또는 색소 생성을 일으켜 콜로니의 형태를 변화시킵니다.대조적으로, Yersinia 종은 특징적인 빨간색 중심의 모양을 유지합니다.결과적으로, 변형된 CIN 한천은 뚜렷한 대사...

변형된 Cefsulodin-Irgasan-Novobiocin 한천을 사용한 Yersinia 종의 개선된 차등 분리

이 비디오는 HIV-1에 감염된 CD4+ T 세포에 의한 형질세포(plasmacytoid dendritic cell)의 자극 후 방출되는 I형 인터페론(IFN)을 정량화하기 위해 HEK-Blue 인터페론-α/β 리포터 세포를 사용하여 분비된 배아 알칼리 인산가수분해효소 분석을 보여줍니다.

Secreted Embryonic Alkaline Phosphatase Reporter Assay를 사용한 Bioactive Type-I 인터페론의 정량화

여기에서는 Cag Type IV 분비 시스템(Cag-T4SS)으로 알려진 발암성 박테리아 소기관을 시각화하는 방법을 설명합니다.  우리는 Cag-T4SS가 다양한 철 가용성 조건에 반응하여 H. pylori의 표면에서 차등적으로 생성된다는 것을 발견했습니다.

고해상도 전자 현미경 헬리코박터 파이로리 CAG 유형 IV 분비 시스템 필리

III형 분비 시스템을 통해 숙주 세포로 이펙터 전좌는 그람 음성 박테리아 사이에서 일반적인 독성 전략입니다. 전좌의 정량 분석을 위한 beta-lactamase effector fusion 기반 분석법을 적용했습니다. Yersinia에 감염된 세포에서 베타-락타마제에 의한 FRET 리포터의 전환은 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 모니터링됩니다.

분석<em&gt; 예 르시 니아의 enterocolitica</em숙주 세포 내로&gt; 이펙터 전좌 베타 - 락타 마제 이펙터의 용해 사용

β-barrel 외막 단백질(OMP)은 그람 음성 박테리아, 미토콘드리아 및 엽록체의 외막 내에서 많은 기능을 수행합니다. 여기에서 우리는 X선 결정학 또는 NMR 분광법에 의한 구조 결정을 위해 충분한 양의 β배럴 OMP를 생산하기 위한 프로토콜을 제시하여 구조 연구에서 알려진 병목 현상을 완화하기를 희망합니다.

β-배럴 외부 막 단백질의 구조 결정을 향해 - 구축해에서 결정에

결핵 균은 낮은 철 조건에 응하여 세포외 소포의 증가된 생산 그리고 방출을 보여줍니다. 이 작품은 철 결핍에 응하여 풀어 놓인 진균 세포외 소포의 정제 그리고 특성화를 위한 낮은 철 조건 및 방법을 생성하기 위한 프로토콜을 상세히 기술합니다.

철분 제한 마이코박테리아에 의해 생성된 세포외 소포의 격리 및 특성화

우리는 여기에서 금속 섭취에 대한 유전자의 발현을 용이하게하기 위해 금속 제한 액체 배지에서 Neisseria 임질의 성장을위한 방법을 설명합니다. 우리는 또한 이 조건에서 성장한 임노코커스의 표현형을 특성화하기 위하여 다운스트림 실험을 개략적으로 설명합니다. 이들 방법은 다른 박테리아에서 금속 반응성 유전자의 특성화에 적합하도록 적응될 수 있다.

호스트 리간드에서 금속 반응 유전자 및 금속 취득의 특성화를 위한 Neisseria 임질의 금속 제한 성장

이 프로토콜은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 총 siderophores, pyoverdine 및 pyochelin에 대한 정성적 및 정량적 분석을 모두 제공합니다.

녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 Siderophore 생산에 대한 정성적 및 정량적 분석

본 프로토콜은 시험관 내 상피 세포주를 사용하여 Shigella 부착, 침습 및 세포 내 복제를 조사하기 위한 감염 분석을 설명합니다.

Shigella를 사용한 상피 세포 감염 분석

배우세요 Yersinia pseudotuberculosis의 Type III 분비 시스템 활동을 철분과 산소 조건에 따라 정량화하는 방법을. 이 연구는 병원균의 독성 인자 조절 메커니즘을 이해하는 데 도움을 줍니다.

철분 결핍과 혐기성 성장에 따른 Yersinia pseudotuberculosis Type III 분비 시스템 활동의 정량화

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