Name: 수모세포종(Medulloblastoma)의 페롭토시스 표현형(Ferroptotic Phenotype) 밝혀짐 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-15T14:50:00.000+00:00
Duration: 4 min 1 s
Description: 배우세요 수모세포종의 페롭토시스 유도 방법을 통해 소아암 치료 전략을 탐색하세요. 단일세포 유전체학과 유동세포측정법을 활용하여 치료 저항성 세포 집단을 분석하고 새로운 모델 시스템을 개발합니다.

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이 작업은 모나코 공국 정부, 'Le Groupement des Entreprises Monégasques dans la Lutte contre le cancer'(GEMLUC) 및 BD FACS Melody 구매 수단을 제공한 Flavien Foundation의 지원을 받았습니다.

본 연구는 8% FBS가 보충된 DMEM 배지에서 5% CO2 로 37°C에서 배양한 DAOY 야생형(WT) 수모세포종 세포주를 사용하여 수행되었습니다. xCT 결실 세포주는 1mM N-아세틸시스테인(NAC)이 보충된 배지에서 실험을 수행하여 동일한 조건에서 유지되었습니다. 세포는 상업적으로 이용 가능한 마이코플라스마 검출 키트( 재료 표 참조)를 사용하여 마이코플라스마에 대해 정기적으로 스크리닝하고 10번째 통로까지 배양했습니다.
1. 세포 수확 및 파종
알림: 모든 단계는 조직 배양 층류 후드에서 멸균 무균 기술을 사용하여 수행됩니다. DAOY 수모세포종 세포는 부착성이 있어 부착되지 않은 모든 세포는 Ca2+ 및 Mg2+ 없이 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척하여 폐기할 수 있습니다.
<ol><li>셀과 함께 스톡 접시(페트리 접시, 직경 100mm)를 취하고 흡인기기를 사용하여 플레이트에서 부유 셀과 매체를 제거합니다.</li>
	<li>접시에 5-10mL의 PBS를 추가하고 접시를 원을 그리며 바닥을 씻은 다음 흡인기기를 사용하여 접시에서 PBS를 제거합니다.</li>
	<li>접시에 트립신 1mL(10배 희석)를 추가합니다. 접시를 부드럽게 두드리면 세포가 제거될 때까지 접시를 배양합니다. 8% FBS가 보충된 DMEM 배양 배지 10mL를 취하고 접시에서 세포를 기계적으로 수확합니다.</li>
	<li>세포 현탁액을 15mL 튜브에 옮깁니다.</li>
	<li>셀 현탁액 500μL를 취하여 계수를 위해 큐벳에 넣습니다. 세포 현탁액의 mL당 세포 수를 계산합니다. 이 연구에는 자동화된 세포 계수기가 사용되었습니다( 재료 표 참조).</li>
	<li>1,00,000개의 세포를 갖기 위해 세포 현탁액에서 취하는 데 필요한 부피를 계산합니다.</li>
	<li>6-웰 플레이트를 가져와서 계산된 세포 현탁액의 부피를 각 웰에 추가한 다음 각 웰에 2mL에 8% FBS가 보충된 DMEM 배양 배지를 추가합니다.</li>
</ol>2. 세포의 처리
알림: 제어 및 치료는 세 번에 걸쳐 수행됩니다. 그룹은 다음과 같습니다 : 대조군 (DMSO), 에라스틴 1 μM, RSL3 0.3 μM, FAC 250 μM, 페로 스타틴 1 2 μM, 에라스틴 1 1 μM 1 μM 1 μM 0.3 μM RSL3 + 페로 스타틴 1 2 μM, FAC 250 μM + 페로 스타틴 2 μM 1. 표 1)에 표시된 것처럼 실험에는 4개의 6웰 플레이트가 필요합니다. 필요한 모든 시약의 상업적 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.
<ol><li>파종 후 24 시간, 세포가있는 우물에 해당 처리를 추가하십시오.</li>
	<li>인큐베이터에서 37 ° C와 5 % CO2 로 접시를 두십시오.</li>
</ol>3. BODIPY 581/591 C11 프로브를 사용한 처리된 세포의 지질 하이드로퍼옥사이드 염색
참고: 지질 하이드로퍼옥사이드 특이적 프로브의 원액은 1mM 농도로 DMSO에서 제조됩니다. 원액의 부분 표본은 -20 °C에서 불투명 튜브에 보관됩니다. 염색을 위해 8% FBS가 보충된 DMEM 매체에 프로브의 2μM 작업 용액을 준비합니다.
<ol><li>처리 6시간 후, 광학 현미경으로 세포를 관찰합니다(세포 반올림이 보여야 함).</li>
	<li>인큐베이터에서 접시를 제거하고 조직 배양 층류 후드에 넣습니다. 흡입기를 사용하여 매체와 부동(죽은) 세포를 제거합니다.</li>
	<li>각 웰에 PBS 2mL를 부드럽게 추가하고 6웰 플레이트를 원을 그리며 바닥을 세척한 다음 흡입기를 사용하여 웰에서 PBS를 제거합니다.</li>
	<li>프로브의 작업 용액 2mL를 추가합니다(FBS가 보충된 DMEM의 최종 농도 2μM).</li>
	<li>접시를 37 ° C와 5 % CO2 의 인큐베이터에 어두운 곳에서 30 분 동안 그대로 두십시오 (접시는 알루미늄 호일로 싸서 사용할 수 있음).</li>
</ol>4. 처리된 세포의 지질 하이드로퍼옥사이드 함량에 대한 유세포 분석
알림: 다음 단계는 모두 어두운 곳에서 수행됩니다(층류 후드에 조명 없음).
<ol><li>인큐베이터에서 접시를 꺼내 조직 배양 층류 후드에 넣습니다. 흡입기를 사용하여 염색 용액을 제거합니다.</li>
	<li>각 웰에 PBS 2mL를 부드럽게 추가하고 6웰 플레이트를 원을 그리며 바닥을 세척한 다음 흡입기를 사용하여 웰에서 PBS를 제거합니다.</li>
	<li>세척 단계를 한 번 더 반복하고 흡인기기를 사용하여 웰에 남아 있는 PBS를 흡인합니다.</li>
	<li>각 웰의 바닥에 시중에서 판매되는 세포 해리 시약 150μL( 재료 표 참조)를 추가하고 플레이트를 부드럽게 두드려 세포가 제거될 때까지 플레이트를 배양합니다. 250μL의 FACS 완충액(PBS, 2mM EDTA, 0.5% BSA)을 웰에서 기계적으로 수확합니다.</li>
	<li>필터 캡이 있는 해당(이전에 표시된) FACS 튜브로 세포를 옮깁니다. 분석이 수행될 때까지 세포가 있는 튜브를 어두운 곳에서 얼음 위에 놓습니다(분석은 염색 후 한 시간 이내에 수행해야 함). 알림: FACS 기계 설정 및 보정은 사용하는 기계에 따라 다릅니다( 재료 표 참조).</li>
	<li>새 실험을 만들고 이름을 지정합니다(DAOY의 페롭토시스 - 지질 하이드로퍼옥사이드).</li>
	<li>실험 설계에서 레이저(488nm)와 필터(FITC)를 선택합니다.</li>
	<li>데이터 보기에서 적절한 셀 크기(>12μm)를 선택하고, PMT 전압을 설정하고(셀 모집단은 SSC-H/FSC-H 도트 플롯의 첫 번째 사분면에 나타나야 함) 도트 플롯을 게이트합니다.</li>
	<li>y축과 로그 스케일에 FITC-A가 있는 새 플롯 히스토그램을 추가합니다.</li>
	<li>FACS 튜브의 샘플을 소용돌이치게 하고 FACS 기계에 넣고 샘플을 로드합니다. 10,000개의 FSC singlet 이벤트를 기록하고 파일 이름을 지정합니다(예: DAOY WT CTL 6h). 파일을 .fcs로 내보냅니다.</li>
</ol>5. 처리 시 죽은 세포의 프로피듐 요오드화물(PI) 염색
참고: 실험 설계는 지질 하이드로퍼옥사이드 측정과 정확히 동일합니다(1단계 및 2단계 참조).
<ol><li>파종 후 24시간 후에 인큐베이터에서 접시를 꺼내 층류 후드에 넣습니다.</li>
	<li>15mL 튜브에 배지(죽은 세포 포함)를 수집합니다.</li>
	<li>각 웰에 1mL의 PBS를 추가하고 6웰 플레이트의 원형 움직임으로 바닥을 세척한 다음 PBS를 해당 매체와 함께 튜브에 수집합니다.</li>
	<li>각 웰의 바닥에 200μL의 트립신(10배 희석)을 추가하고 플레이트를 부드럽게 두드려 세포가 제거될 때까지 플레이트를 배양합니다. 해당 매체 + PBS를 사용하여 웰에서 세포를 수확합니다.</li>
	<li>셀 현탁액을 실온에서 10분 동안 180 x g 으로 원심분리합니다. 흡입기를 사용하여 상층액을 제거합니다.</li>
	<li>세포 펠릿을 300μL의 FACS 완충액에 재현탁시키고 분석할 때까지 얼음 위에 놓습니다.</li>
	<li>분석 직전에 PI 용액( 재료 표 참조)을 최종 농도 2μg/mL에 추가합니다.</li>
</ol>6. 처리 후 24시간 동안 죽은 세포의 유세포 분석
알림: FACS 기계 설정 및 보정은 이전에 표시된 대로 수행됩니다(4단계 참조).
<ol><li>새 실험을 만들고 이름을 지정합니다(DAOY의 Ferroptosis - 세포 사멸).</li>
	<li>실험 설계에서 레이저(488nm)와 필터(PE)를 선택합니다.</li>
	<li>데이터 보기에서 적절한 셀 크기(>12μm)를 선택하고, PMT 전압을 설정하고(셀 모집단은 SSC-H/FSC-H 도트 플롯의 첫 번째 사분면에 나타나야 함) 도트 플롯을 게이트합니다.</li>
	<li>y축과 로그 스케일에 PE-A가 있는 새 플롯 히스토그램을 추가합니다.</li>
	<li>FACS 튜브의 샘플을 소용돌이치게 하고 FACS 기계에 넣고 샘플을 로드합니다.</li>
	<li>10,000개의 FSC singlet 이벤트를 기록하고 파일 이름을 지정합니다(예: DAOY WT CTL 6h). 파일을 .fcs로 내보냅니다.</li>
</ol>7. DAOY xCT-/- 세포의 지질 하이드로퍼옥사이드 함량에 대한 유세포 분석
참고: xCT-/- 셀은 앞서 설명한 대로 생성되었습니다24.
<ol><li>이 실험을 위해 2단계에서 지시한 대로 세포를 파종하되 처리 대신 하룻밤 동안 1mM NAC를 배지에 보충합니다.</li>
	<li>다음 날, 한 그룹에서는 NAC를 유지하고 다른 그룹에서는 NAC를 제거합니다.</li>
	<li>6단계에서 설명한 것과 정확히 동일한 방식으로 지질 하이드로퍼옥사이드 함량의 유세포 분석을 수행합니다.</li>
</ol>8. 유세포 분석기 결과 분석
<ol><li>FlowJo 소프트웨어에서 .fcs 문서를 엽니다( 자료 표 참조).</li>
	<li>개별 파일을 두 번 클릭하여 개별 샘플(SSC-A/FSC-A 도트 플롯)에 기록된 모든 이벤트(FCS 싱글렛뿐만 아니라)를 엽니다. 기계에서 수행된 게이팅이 유지되지 않도록 설정되어 있으므로 게이트를 다시 한 번 만들고 모집단의 이름을 지정해야 합니다(예: DAOY WT).</li>
	<li>제어된 모집단을 두 번 클릭하여 히스토그램이 있는 다른 창을 엽니다.</li>
	<li>Y축을 사용하는 형광 필터(Comp-FITC/PE-A)로 변경합니다.</li>
	<li>X축을 모달 로 변경합니다(각 피크를 해당 모드로 정규화, 즉 특정 bin에 있는 최대 셀 수의 %로 정규화).</li>
	<li>히스토그램을 레이아웃 편집기에 복사합니다. 모든 샘플에 대해 이 작업을 반복하고 레이아웃 편집기에 새 히스토그램을 붙여넣을 때마다 이전 히스토그램 위로 드래그하여 히스토그램이 오버레이(절반 오프셋)되도록 합니다.</li>
</ol>

페롭토틱 수모세포종 세포에서 지질 하이드로퍼옥사이드의 FACS 분석

<ol><li>Dixon, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ferroptosis%3A+An+iron-dependent+form+of+nonapoptotic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ferroptosis: An iron-dependent form of nonapoptotic cell death.</a> Cell. 149, 1060-1072 (2012).</li>
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<li>Vucetic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Together+we+stand%2C+apart+we+fall%3A+how+cell-to-cell+contact%2Finterplay+provides+resistance+to+ferroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Together we stand, apart we fall: how cell-to-cell contact/interplay provides resistance to ferroptosis.</a> Cell Death Dis. 11, 789(2020).</li>
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</ol>

우리는 여기에 제시된 연구에 대한 이해 상충이 없음을 선언합니다.

ferroptotic cell death의 주요 특징은 원형질막에 지질 하이드로퍼옥사이드가 통제되지 않고 축적된다는 것입니다. 이러한 산화적 손상은 효소 또는 비효소 방식으로 발생할 수 있지만, 두 경우 모두 반응은 철 의존적/촉매 작용을 통해 발생하며, 이는 이러한 유형의 세포 사멸의 이름을 설명합니다. 지질 하이드로퍼옥데이션은 종종 4-하이드록시-2,3-트랜스-노네날(4-HNE) 또는 말론알데히드(MDA)와 같은 지질 하이드로퍼옥다이션의 분해 산물을 측정하여 간접적으로 추정됩니다. 고도 불포화 지방산의 과산화 분해에 의해 생성된 이러한 제품은 다양한 거대분자와 반응하여 신경 퇴행성 질환, 당뇨병 및 만성 심부전과 같은 다양한 병리를 유발할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 이는 과산화 사건의 결과이며, 우수한 지질 과산화수소 특이적 프로브를 개발하기 위해 상당한 노력이 투자되었습니다.
자주 사용되는 프로브 중 하나는 BODIPY 581/591 C11이며, 이 프로브에도 고려해야 할 단점이 있습니다. 특히, BODIPY 591/581 형광 색상은 환원 상태(590nm)와 산화 상태(510nm)의 두 가지 방출 피크를 나타냅니다. 이 두 파장에서 형광 사이의 비율은 정확한 정량화가 목표인 경우 특히 중요합니다. 그러나 BODIPY 591/581 nm의 단일 방출 형광 강도는 문헌 1,25,26,27,28 전반에 걸쳐 널리 사용되었으며, 특히 510nm에서 감소된 적색 방출 강도는 산화된 분자 22,29의 형광 스필오버에 의해 자주 가려집니다. 이것이 BODIPY 591/581의 형광이 일반적으로 단일(녹색) 형광 강도의 함수로 정성적 방식으로 표현되는 주요 이유 중 하나입니다.
이 프로브의 또 다른 중요한 한계는 농도 의존적 방식으로 항산화제에 의한 형광 방출 억제이다(30). 따라서 항산화 보충제 없이 배지에서 염색을 수행해야 합니다. 본 프로토콜에서는 지질 히드로퍼옥사이드의 강력한 제거제인 페로스타틴 1이 사용되었습니다. 그럼에도 불구하고, 프로브를 첨가하기 전에 페로스타틴 1을 제거하고 세포를 PBS로 세척하여 프로브가 항산화 활성에 노출되지 않도록 했습니다.
페롭토시스 유도와 관련하여, 상업적으로 이용 가능한 많은 약물이 사용될 수 있습니다. 여기에는 xCT 트랜스포터(31)의 비가역적 억제제인 에라스틴이 사용되었다. 트랜스포터에 공유 결합한다는 점을 감안할 때, 더 짧은 시간(5분) 동안 훨씬 더 높은 농도(최대 100μM)를 사용할 수 있으며, 이어서 세척 단계(31)를 수행할 수 있습니다. xCT의 완전 억제 시 페롭토시스의 정확한 동역학을 평가하기 위해 NAC가 없는 상태에서 xCT-/- 세포를 사용했습니다. 지질 하이드로퍼옥사이드의 대량 축적은 6시간 후에 검출될 수 있었고 파종 후 24시간 후에는 생존 가능한 세포가 거의 검출되지 않았습니다. 나노몰 범위에서 매우 강력한 페롭토시스 유도인자인 RSL3의 경우 xCT-/- 세포에서 관찰된 것과 유사한 동역학을 나타냈습니다. 그 작용 방식은 여전히 논란의 여지가 있지만 활성에 영향을 미치지 않고 대신 GPx4 효소32,33의 분해를 유도하는 것으로 보입니다.
페롭토시스 in vitro 유도의 중요한 측면은 세포 밀도(cell confluency)입니다. 합류 세포층은 시스테인 결핍, xCT 또는 GPx4 억제, GSH 고갈 등에 훨씬 더 저항력이 있다는 것이 오랫동안 관찰되어 왔습니다.34. 주어진 주된 이유는 신체적 접촉, 즉 합류가 하마 경로의 활성화로 이어지고, 이는 차례로 활성 산소 종(ROS)의 신진대사와 내부 생성을 하향 조절하기 때문입니다. 또한, 환원된 시스테인의 셔틀은 불완전한 xCT 억제에 대한 내성에도 기여할 수 있다35. 본 연구에서는 다소 크고 평평한 세포와의 낮은 밀도를 유지하기 위해 웰당 1,00,000개의 세포(6-웰 플레이트)의 농도를 사용했습니다. 그러나 HD-MB03과 같은 더 작고 둥근 모양의 셀을 사용하면 이 수를 웰(6웰 플레이트)당 1,50,000-2,00,000개 셀로 늘릴 수 있습니다.
본 연구의 마지막 한계는 프로피듐 요오드화물(PI) 방법에 의한 세포 사멸 검출입니다. 이 방법은 모든 유형의 세포 사멸을 검출하는 데 사용자 친화적이며, 페롭토시스는 페로스타틴-1과 같은 페롭토시스 특이적 억제제를 사용하여 다른 유형의 세포 사멸과 구별할 수 있습니다. PI 염색은 죽어가는 세포가 막 무결성을 상실하여 PI가 세포를 관통하고 DNA 염기 사이를 삽입하며 형광 신호를 방출할 수 있다는 사실에 기반을 두고 있습니다. 그러나 지질 하이드로퍼옥시화는 세포막 "누출"을 유도하여 세포 사멸이 발생하기 전에도 PI의 침투를 허용한다는 점에 주목할 가치가 있습니다. 따라서 이 방법만으로 페롭토시스의 동역학을 추정하는 것은 어렵습니다.

페롭토시스(Ferroptosis)는 새롭게 맥락화된 활성산소종(ROS) 의존적 유형의 세포 사멸이다1. ROS 외에도 철은 이러한 유형의 세포 사멸에서 중요한 역할을 하므로2라는 이름이 붙었습니다. 페롭토시스(ferroptosis)의 마지막 단계는 원형질막에서 지질의 산화적 손상이 철 촉매로 축적되는 것으로, 이는 결국 막의 무결성 손상과 선택적 투과성, 그리고 마지막으로 기포에 의한 세포 사멸로 이어집니다. 지질 하이드로퍼옥시드 현상은 자연적으로 발생하는 현상입니다. 그러나 세포막을 통한 증식은 세포의 항산화 방어에 의해 방지됩니다. 이러한 맥락에서 주요 역할을 하는 것은 Se-protein glutathione peroxidase 4 (GPx4)로, 막에 접근하여 지질 하이드로퍼옥사이드를 독성이 덜한 알코올 유도체로 전환할 수 있습니다3. GPx4의 환원력은 주로 비필수 아미노산인 글리신, 글루타메이트, 시스테인으로 구성된 트리펩타이드인 글루타치온(GSH)에 의해 제공되지만 배타적이지는 않습니다. GSH의 생합성을 위한 속도 제한 아미노산은 시스테인4입니다. 시스테인은 비필수 아미노산으로 분류되지만, 그 요구량은 증식성이 높은 세포(예: 암세포)에서 내부 생성을 쉽게 초과할 수 있습니다. 따라서 그것은 semi-essential 아미노산 그룹으로 재분류되었습니다. 시스테인의 필요한 수입은 주로 Xc- 시스템을 통해 발생하며, 이는 글루타메이트 수출을 희생하면서 산화된(우성) 형태의 시스테인(일명 시스틴)을 수입할 수 있게 해준다5. Xc- 시스템은 xCT로 알려진 Na+-독립, Cl--종속 수송 소단위와 CD98로 알려진 샤페론 소단위로 구성됩니다. 최근까지 xCT-GSH-GPx4 축의 반-페롭토틱 특성은 독특하고 복제할 수 없는 것으로 여겨져 왔다6. 그러나 2019년에는 유비퀴놀(코엔자임 Q10)과 그 재생 효소인 페롭토시스 억제 단백질 1(FSP1)로 구성된 대체 항페롭토틱 경로가 설명되었습니다 7,8. 그 직후, GTP 사이클로하이드로라제-1/테트라하이드로바이오프테린(GCH1/BH4)과 관련된 또 다른 지질 하이드로퍼옥사이드 해독 시스템이 보고되었다9. 그럼에도 불구하고 페롭토시스 예방에서 xCT-GSH-GPx4 축의 중심적인 역할은 도전받지 않는 것으로 보입니다.
지난 10년 동안 페롭토시스는 다양한 종양 유형에서 광범위하게 연구되어 항암 전략으로서 큰 잠재력을 보여주었습니다(Lei et al.10 검토). 또한, 기존의 화학요법제에 대한 저항성이 높거나 전이 성향을 보이는 암세포는 GPx4 11,12,13 억제제와 같은 페롭토시스 유도제에 놀라울 정도로 민감하다는 보고가 있었습니다. 그러나 뇌종양의 맥락에서 페롭토시스 유도제의 잠재력은 대체로 연구가 부족한 상태로 남아 있습니다. 이러한 유형의 세포 사멸은 대뇌 허혈-재관류 손상(cerebral ischemia-refusion injury)14및 신경퇴행성 질환(neurodegenerativediseases)15과 밀접한 관련이 있지만, 뇌종양의 맥락에서 그 잠재력은 주로 가장 흔한 악성 두개뇌 종양인 교모세포종(glioblastoma)에 국한되어 있다(Zhuo et al.16에 의해 검토됨). 한편, 가장 흔한 악성 소아 뇌종양이자 소아 사망률의 주요 원인인 수모세포종(medulloblastoma)이 페롭토시스 유발인자에 대한 민감성은 대부분 연구되지 않은 상태로 남아 있습니다. 우리가 아는 한, 페롭토시스와 수모세포종을 연결하는 동료 심사 문헌은 거의 없습니다. 그럼에도 불구하고 일부 연구에서는 철분이 수모세포종과 교모세포종 암 줄기 세포(CSC)의 생존, 증식 및 종양 생성 가능성에 중요한 역할을 한다는 것을 밝혀냈습니다.17,18 이로 인해 페롭토시스 유도에 더 취약해질 수 있습니다. 이는 수모세포종(medulloblastoma)이 종양 화학저항성, 전파 및 재발의 주요 원인이 되는 것으로 보이는 CSC(tumor-initiating/propagating cells)의 하위 집단으로 악명이 높기 때문에 특히 중요하다19.
페롭토시스 유도에 대한 민감도는 일반적으로 세포 사멸로 이어질 수 있거나 그렇지 않을 수 있는 지질 하이드로퍼옥사이드 함량/축적을 측정하여 조사합니다. 가장 일반적으로 사용되는 페롭토시스 유도제는 (1) xCT 수송체20의 억제제인 에라스틴, (2) GPx4 효소2의 억제제인 RSL3 및/또는 (3) 구연산제철암모늄(FAC)21과 같은 철 공여체입니다. 지질 하이드로퍼옥사이드 함량은 선택적 프로브 BODIPY 581/591 C1122를 사용하여 평가하며, 이 프로브는 감소된 상태에서 581/591nm에서 여기 및 방출 최대값을 갖습니다. 지질 하이드로퍼옥사이드와의 상호 작용 및 산화에 의해 산화되면 프로브는 여기 및 방출 최대값을 488/510nm로 이동합니다. 전형적으로, 지질 하이드로퍼옥사이드 함량의 현저한 증가는 페롭토틱 세포 사멸에 선행합니다. 페롭토시스는 프로그래밍된 세포 사멸이 아니기 때문에 페롭토시스 실행으로 이어지는 분자 신호 전달 캐스케이드가 없습니다. 따라서 이를 확인할 수 있는 유일한 방법은 지질 하이드로퍼옥사이드 함량을 모니터링하고 이러한 유형의 세포 사멸에 대해 페로스타틴 123과 같은 특정 억제제를 사용하는 것입니다. 페로스타틴 1은 세포의 지질 구획에 침투하여 지질 하이드로퍼옥사이드를 해독하여 페롭토시스 사건을 예방할 수 있는 친유성 항산화제입니다.

<table><tbody><tr><td>BODIPY 581/591 C11</td><td>Thermo Fisher</td><td>D3861</td><td></td></tr><tr><td>셀 카운터</td><td>Beckman</td><td>Coulter Z1</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 중간&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10569010</td><td></td></tr><tr><td>Erastin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7781-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Ferroamminium citrate</td><td>Acros Organics</td><td>211842500</td><td></td></tr><tr><td>Ferrostatin-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0583-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovin serum (FBS)</td><td>Dominique Dutcher</td><td>500105N1N</td><td></td></tr><tr><td>유세포 분석기</td><td>BD Biosciences</td><td>FACS Melody</td><td></td></tr><tr><td>Gibco StemPro Accutase 세포 해리 시약</td><td>Thermo Fisher</td><td>11599686</td><td></td></tr><tr><td>N-acetylcysteine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7250</td><td></td></tr><tr><td>PlasmoTest 마이코플라즈마 검출 키트</td><td>InvivoGen</td><td>rep-pt1</td><td></td></tr><tr><td>프로피듐 요오드화물</td><td>Invitrogen</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>RSL3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML2234-25MG</td><td></td></tr><tr><td>트립신 - EDTA 10X - 100 mL</td><td>Dominique Dutcher</td><td>X0930-100</td><td></td></tr></tbody></table>

수모세포종(medulloblastoma)의 페롭토시스 표현형(ferroptotic phenotype) 밝혀짐

Revealing the Ferroptotic Phenotype of Medulloblastoma

철과 산소의 상호 작용은 지구상의 생명 발달에 필수적인 부분입니다. 그럼에도 불구하고 이 독특한 화학 물질은 계속해서 매혹적이고 당혹스러워하며 새로운 생물학적 모험으로 이어지고 있습니다. 2012년, 컬럼비아 대학의 한 연구팀은 이러한 상호작용을 "페롭토시스(ferroptosis)"라는 새로운 유형의 조절 세포 사멸로 이끄는 중심 사건으로 인식했습니다. 페롭토시스의 주요 특징은 (1) 항산화 방어 기능 장애 및/또는 (2) 압도적인 산화 스트레스로 인한 지질 하이드로퍼옥사이드의 축적이며, 이는 세포 내 유리 불안정한 철 함량 증가와 가장 빈번하게 일치합니다. 이는 일반적으로 시스틴 수송체 xCT, 글루타티온(GSH) 및 GSH 퍼옥시다제 4(GPx4)로 구성된 표준 항페롭토틱 축에 의해 방지됩니다. 페롭토시스(ferroptosis)는 프로그래밍된 유형의 세포 사멸이 아니기 때문에 세포사멸(apoptosis)의 특징적인 신호 전달 경로를 포함하지 않습니다. 이러한 유형의 세포 사멸을 증명하는 가장 일반적인 방법은 친유성 항산화제(비타민 E, 페로스타틴-1 등)를 사용하여 예방하는 것입니다. 이 분자는 원형질막의 산화 손상에 접근하여 해독할 수 있습니다. 페롭토틱 표현형을 밝히는 또 다른 중요한 측면은 특정 염료 BODIPY C11이 사용되는 지질 하이드로퍼옥사이드의 선행 축적을 검출하는 것입니다. 본 논문은 야생형 수모세포종 세포에서 에라스틴(erastin), RSL3, 철 공여체(iron-donor) 등 다양한 유도 인자를 사용하여 페롭토시스(ferroptosis)를 유도하는 방법을 보여줍니다. 마찬가지로, NAC가 있는 곳에서 성장하고 NAC가 제거된 후 페롭토시스(ferroptosis)를 겪는 xCT-KO 세포가 사용됩니다. 특징적인 "버블링(bubbling)" 표현형은 페롭토시스(ferroptosis)가 촉발되는 순간으로부터 12-16시간 이내에 광학 현미경으로 볼 수 있습니다. 또한 BODIPY C11 염색 후 FACS 분석을 통해 PI 염색법을 사용하여 지질 하이드로퍼옥사이드의 축적과 그에 따른 세포 사멸을 보여줍니다. 세포 사멸의 페롭토시스 특성을 입증하기 위해 페로스타틴-1은 특정 페롭토시스 예방제로 사용될 것입니다.

수모세포종 세포주 DAOY는 약 60%의 밀도에 도달할 때까지 8% FBS가 보충된 표준 DMEM 배지에서 배양되었습니다. 실험 당일, 세포를 수확하고, 웰 당 1,00,000 개의 세포를 표 1에 따라 6-웰 플레이트에 도말하였다. 다음 날, 세포(삼중)를 1μM의 에라스틴, 0.3μM의 RSL3 또는 250μM의 FAC로 처리했습니다. 그런 다음 플레이트를 37°C 및 5%CO2의 인큐베이터에 넣었습니다. 6시간 후, 그림 1의 화살표로 표시된 것처럼 기포 세포를 감지하기 위해 현미경으로 세포를 관찰했습니다. 이는 세포가 지질 하이드로퍼옥사이드 염색 및 후속 FACS 분석을 위해 준비되기 전에 약물이 페롭토시스를 유도하는 데 효과적이라는 지표로 작용했습니다.
지질 하이드로퍼옥사이드 함량을 검출하기 위해 특정 염료 BODIPY 581/591 C11을 최종 농도 2μM에서 30분 동안 사용했습니다. 이 염료는 산화 환원에 민감하기 때문에 세포에서 모든 처리물을 제거하고 미리 예열된 PBS로 세척해야 했습니다. 30분 염색 후, PBS로 세포를 2회 세척하고, 세포 분리 용액을 사용하여 분리하고, FACS 분석을 위해 준비했습니다. 이 단계에서 얻은 데이터는 세 가지 약물로 처리된 샘플에서 염료의 녹색 형광이 증가했음을 보여주었습니다(그림 2). 그러나 가장 강력한 효과는 0.3μM의 RSL3(그림 2B)로 관찰된 반면, 1μM의 에라스틴(그림 2A) 및 250μM의 FAC(그림 2C)는 6시간의 처리 후 다소 적은 효과를 보였습니다.
검출된 지질 하이드로퍼옥사이드 축적이 세포 사멸, 특히 페롭토시스(ferroptosis)로 이어진다는 것을 확립하기 위해, 표 1 에 요약된 동일한 처리를 24시간 동안 적용하였다. 유세포 분석을 통한 죽은 세포 분석을 위해 세포와 상층액을 모두 채취했습니다. 살아있는 세포와 죽은 세포를 원심분리에 의해 펠릿화한 다음 후속 유세포 분석을 위해 FACS 완충액에 재현탁시켰습니다. 그림 3 에 제시된 데이터는 세 가지 치료 모두 대량 세포 사멸을 유발한다는 것을 보여주었으며, 이는 페롭토시스 특이적 억제제인 페로스타틴-1을 사용하여 완전히 예방되었습니다. 이는 수모세포종 세포에서 xCT 억제, GPx4 억제 또는 철 과부하 시 철강 세포 사멸이 발생한다는 것을 명확하게 뒷받침합니다.
세 가지 약물이 효능의 차이로 인해 지질 하이드로퍼옥사이드 축적에 다소 다른 효과를 보였다는 점을 감안할 때, 페롭토틱 유도제의 전체 효능을 조사하기 위해 유전적 접근 방식이 사용되었습니다. 이전에 얻은 DAOY xCT-/- 세포(보충 그림 1A)는 WT 세포와 동일한 배지에서 배양했지만 NAC 보충을 사용했습니다. 이 positive selection은 xCT-/- 세포가 배양에서 성장할 수 있도록 했습니다. 그러나 배양 배지에서 NAC를 제거한 지 6시간이 지나자 세포는 RSL3로 처리한 WT 세포와 동일한 수준으로 지질 하이드로옥사이드를 축적하기 시작했습니다(그림 4). 약리학적 억제와 유사하게, 배지에서 NAC를 제거하면 6시간 후 xCT-/- 세포의 특징적인 버블링이 유도되었습니다(보충 그림 1B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66645/66645fig01.jpg"> 그림 1: 수모세포종 세포의 페롭토틱 표현형. 2μM 페롭토시스 억제제 페로스타틴-1(Ferro-1)의 존재 여부와 관계없이 1μM의 에라스틴(ERA), 0.3μM의 RSL3 또는 250μM의 구연산페로암모늄(FAC)으로 6시간 동안 처리된(또는 투여되지 않은) DAOY WT 세포의 대표적인 현미경 사진. 흰색 화살표는 둥글고 "버블링" 세포를 나타내며, 광학 현미경으로 볼 수 있는 페롭토틱 표현형을 나타냅니다. 배율 : 20 배, 인서트 : 40 배. 스케일 바: 50 μm, 인셋: 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66645/66645fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66645/66645fig02.jpg"> 그림 2: 수모세포종 세포에서 페롭토시스(ferroptosis)의 핵심 마커인 지질 하이드로퍼옥사이드(Lipid hydroperoxide). 2μM 페롭토시스 억제제 페로스타틴-1(Ferro-1)의 존재 여부와 관계없이 (A,B) 1μM의 에라스틴(ERA), (C,D) 0.3μM의 RSL3 또는 (E,F) 250μM의 시트르산페로암모늄(FAC)으로 6시간 동안 처리된 세포에서 유세포 분석에 의한 지질 하이드로퍼옥사이드 염색의 대표 데이터. (A,C,E) 기록된 이벤트의 점도표; (금, D, 층) 지질 하이드로퍼옥사이드 함량의 히스토그램 표현. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66645/66645fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66645/66645fig03.jpg"> 그림 3: 약리학적 접근법에 의한 페롭토틱 세포 사멸 유도. 2μM 페롭토시스 억제제 페로스타틴-1(Ferro-1)의 존재 여부와 관계없이 1μM의 에라스틴(ERA), 0.3μM의 RSL3 또는 250μM의 시트르산페로암모늄(FAC)으로 6시간 처리한 후 프로피듐 요오드화물 염색 세포의 대표적인 유세포 분석 점도표. 게이팅은 세포의 살아있는(Q4) 및 죽은 (Q3) 집단을 분리합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66645/66645fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66645/66645fig04.jpg"> 그림 4: 유전적 접근법에 의한 페롭토시스 유도. 2μM 페롭토시스 억제제인 페로스타틴-1(Ferro-1)의 존재 여부와 관계없이 6시간 후 DAOY WT 및 xCT-/- 세포에서 유세포 분석에 의한 지질 하이드로퍼옥사이드 염색의 대표 데이터. 왼쪽은 지질 하이드로퍼옥사이드 함량의 히스토그램 표현입니다. 오른쪽에는 기록된 이벤트의 점 그림이 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66645/66645fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>플레이트 I</td>
			<td>CTL 나</td>
			<td>CTL II</td>
			<td>CTL 3세</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>1μM 에라스틴 I</td>
			<td>1μM 에라스틴 II</td>
			<td>1μM 에라스틴 III</td>
		</tr><tr><td>플레이트 II</td>
			<td>0.3μM RSL3 나</td>
			<td>0.3 μM RSL3 II</td>
			<td>0.3 μM RSL3 세</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>250μM FAC I</td>
			<td>250μM FAC II</td>
			<td>250 마이크로미터 팩사 III</td>
		</tr><tr><td>플레이트 III</td>
			<td>2 μM 페로-1 I</td>
			<td>2 μM 페로-1 II</td>
			<td>2 μM 페로-1 III</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>1 M 에라스틴 + 2 M 페로-1 I</td>
			<td>1 M 에라스틴 + 2 M 페로-1 II</td>
			<td>1 M 에라스틴 + 2 M 페로-1 III</td>
		</tr><tr><td>플레이트 IV</td>
			<td>0.3 M RSL3 + 2 M 페로-1 I</td>
			<td>0.3 M RSL3 + 2 M 페로-1 II</td>
			<td>0.3 M RSL3 + 2 M 페로-1 III</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>250M FAC + 2M 페로-1 I</td>
			<td>250m FAC + 2m 페로-1 II</td>
			<td>250 M FAC + 2 M 페로-1 III</td>
		</tr></tbody></table>표 1: 대조 세포와 실험 세포의 처리 세부 정보.
보충 그림 1: DAOY xCT-/- 세포의 페롭토틱 세포 사멸. (A) 2μM의 페로스타틴-1이 보충되거나 보충되지 않은 DMEM 배지의 DAOY WT 및 xCT-/- 세포의 xCT 수준에 대한 웨스턴 블롯 분석. (B) 6시간 동안 1mM N-아세틸시스테인의 존재(왼쪽) 및 부재(오른쪽)에서 DAOY xCT-/- 세포의 대표적인 현미경 사진. 흰색 화살표는 둥글고 "버블링" 세포를 나타내며, 광학 현미경으로 볼 수 있는 페롭토틱 표현형을 나타냅니다. 배율 : 40x. 스케일 바: 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66645/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

지질 하이드로퍼옥사이드 함량은 페롭토틱 세포 사멸의 가장 일반적으로 사용되는 지표를 나타냅니다. 이 기사는 페롭토시스 유도 시 세포의 지질 하이드로퍼옥사이드 함량에 대한 단계별 유세포 분석을 보여줍니다.

수모세포종(Medulloblastoma)의 페롭토시스 표현형(Ferroptotic Phenotype) 밝혀짐

The interaction of iron and oxygen is an integral part of the development of life on Earth. Nonetheless, this unique chemistry continues to fascinate and ...

본 연구의 궁극적인 목표는 근모세포종과 같은 소아암에 대한 새로운 치료법을 개발하는 것입니다. 이를 위해 우리 팀은 질병의 유전적 배경을 강조하는 새로운 모델 시스템을 개발하고 새로운 치료 방법을 활용합니다. 최근 몇 년 동안 단세포 유전체학(single cell genomics)은 손상된 혈통 헌신이 소아암의 임상 결과, 치료에 대한 반응, 그리고 궁극적으로 종양 내 치료 저항성 세포 집단의 발달에 어떻게 영향을 미치는지 밝혀냈습니다.신경 전구 세포의 분화 상태의 스펙트럼은 소아암의 임상 결과의 기초가 되는 것으로 보입니다. 주요 과제는 종양 내에서 고도로 가소성적으로 알려져 있거나 불충분한 전구 세포를 이해하고 이러한 질병에 더 효율적이고 덜 해로운 새로운 치료법을 개발하는 것입니다. 이러한 관점에서 볼 때, 페롭토시스에 대한 우리의 연구는 매우 유망해 보입니다.철분 의존성은 암 줄기세포라고도 알려진 암세포의 주요 취약점 중 하나이며, 모든 필수 요소입니다. 철은 활성산소종과의 반응으로 페롭토시스(ferroptosis)라고 하는 특정 유형의 세포 사멸로 이어질 수 있기 때문에 양날의 검입니다. 우리의 데이터는 페롭토시스가 이러한 유형의 암세포에 대해 큰 잠재력을 가지고 있음을 분명히 보여주었습니다.

revealing-the-ferroptotic-phenotype-of-medulloblastoma

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

이 프로토콜은 절연, 강화하고, 이소성 소닉 헤지 호그 경로 활동과 돌연변이 생쥐에서 파생된 medulloblastoma 종양의 줄기 세포의 유지 보수를 설명합니다.

절연, 강화하고, Medulloblastoma의 줄기 세포의 유지 보수

이 프로토콜은 마우스 medulloblastoma 조직의 격리와 분리를 설명하고, 보조 medulloblastoma를 시작하기 위해 immunocompromised받는 생쥐에 종양 세포의 후속 allografting.

Immunocompromised 마우스의 Medulloblastoma 세포 Intracranial Orthotopic Allografting

여기에서는 신생아 마우스의 심실에 주입된 트랜스포존 DNA를 사용하여 새로운 교모세포종(GBM)을 유도, 모니터링 및 분석하는 효율적이고 다재다능한 프로토콜에 대해 설명합니다. 플라스미드를 흡수하는 뇌실하부의 세포는 인간 교모세포종의 조직병리학적 특성을 가진 종양을 변형, 증식 및 생성합니다.

신생아 마우스의 뇌실 영역에 플라스미드 DNA의 트랜스포존 중재 통합 아교 ​​모세포종의 소설 모델을 생성합니다

여기에 제시된 자궁 전기화에서 사용하는 배아 페렛 뇌에서 유전자 조작을 수행하는 프로토콜이 있다. 이 방법은 생체 내의 신피질에서 신경 전구 세포를 표적으로 하는 것을 허용합니다.

자궁 에서 뇌포화에 의해 페렛 신피질에서 신경 전구 세포의 생체 포팅

난자 전기천공을 사용하여 닭 배아의 청각 내이와 달팽이관 핵을 선택적으로 형질감염시켜 회로 조립의 개별 기간 동안 깨지기 쉬운 X 정신 지체 단백질의 세포 그룹 특이적 녹다운을 달성하는 방법을 고안했습니다.

In ovo 전기천공에 의한 청각회로에서 깨지기 쉬운 X 정신지체 단백질의 세포 자율 기능 해부

생물학적 시료에서 줄기 세포 집단의 특성 분석 및 분리를 허용하는 방법은 암 및 그 이상에서 줄기 세포 표적 처리의 발전에 중요합니다. 여기에서 우리는 염료에 의해 유발 된 부작용 표현형을 사용하는 암 줄기 세포 분리를위한 상세한 프로토콜을 제공합니다.

DNA 염료에 의한 측면 집단 표현형을 활용하여 생물학적 샘플에서 암 줄기 세포를 검출하고 정제

여기, 우리는 암에 대 한 신뢰할 수 있는 전 임상 모델을 만드는 생물학 관련 사이트에서 초음파 유도 신경 (NB) 및 Ewing의 육 (ES) 세포의 주입을 활용 (설립 세포 및 종양 환자에서 파생 된 셀) 프로토콜 제시 연구입니다.

초음파의 이용 가이드 생물학 관련 전이성 종양 Xenografts의 설립을 위한 세포 이식 조직 감독

여기, 선물이 형광 활성화 된 세포 분류에 의해 유방암 apoptotic 세포를 분리 하 고 추가 cytometry에 의해 apoptosis 반전 후 유방암 줄기 세포와 같은 세포에 유 방 비 줄기 암 세포의 전이 감지 하는 프로토콜.

새로 형성 된 유방암 줄기 세포와 같은 세포 Apoptosis 반전 후 흐름 Cytometric 감지

이 프로토콜은 0-4일 된 마우스의 피부로부터 멜라닌세포 및 섬유아세포 배양을 동시에 생성하는 신속한 방법을 간략하게 설명한다. 이러한 1차 배양은 피부 세포 생물학, 색소 침착, 상처 치유 및 흑색종을 포함한 다양한 생리학적 관련 과정을 연구하기 위해 시험관 내에서 유지 및 조작될 수 있다.

1 차적인 뮤린 멜라닌세포 및 섬유아세포 배양물의 급속한 생성

이 기사에서는 시험관 내 키나아제 분석, RAF 공동 활성화 분석 및 상보적인 분할 루시페라아제 분석법을 포함하는 RAF 패밀리 키나아제의 질병 관련 돌연변이를 특성화하기 위한 실용적이고 실현 가능한 방법 세트를 제시했습니다.

실용적이고 실행 가능한 방법 세트를 사용하여 RAF 패밀리 키나아제의 질병 관련 돌연변이 특성화

배우세요 수모세포종의 페롭토시스 유도 방법을 통해 소아암 치료 전략을 탐색하세요. 단일세포 유전체학과 유동세포측정법을 활용하여 치료 저항성 세포 집단을 분석하고 새로운 모델 시스템을 개발합니다.

수모세포종(Medulloblastoma)의 페롭토시스 표현형(Ferroptotic Phenotype) 밝혀짐

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