Name: 혈소판에서 과산화물 음이온 생성을 검출하기 위한 대체 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-29T14:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: 학습하세요 혈소판에서 과산화물 음이온을 검출하는 대체 기법을 DHE 및 CMH 스핀 탐침을 사용하여. 이 방법은 혈전성 질환 연구에서 산화환원 의존적 혈소판 조절 메커니즘을 이해하는 데 필수적인 도구를 제공합니다.

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<meta charset="utf8"></head><body>Detection of Superoxide Anion in Platelets Using Fluorescence Imaging and EPR을 사용한 과산화물 음이온 검출

<table><tbody><tr><td>1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH)</td><td>Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH</td><td>NOX-02.1-50mg</td><td>EPR용 시약(스핀 프로브)</td></tr><tr><td>BD FACSAria III</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td>NA</td><td>유세포 분석기</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Merck/Sigma</td><td>A7030</td><td>&mu;-슬라이드 코팅용</td></tr><tr><td>Bruker E-scan M (Noxyscan)</td><td>Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH</td><td>&nbsp; 녹스-E.11-BES&nbsp;</td><td>EPR 분광계</td></tr><tr><td>카탈라제&ndash; 폴리에틸렌 글리콜 (PEG-Cat.)</td><td>Merck/Sigma</td><td>C4963</td><td>과산화수소 청소제 (특이성 제어)</td></tr><tr><td>ChronoLog 모델 490+4</td><td>Labmedics/Chronolog</td><td>NA</td><td>어그리고미터</td></tr><tr><td>CM radical</td><td>Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH</td><td>NOX-20.1-100mg&nbsp;</td><td>EPR용 시약(교정 제어)</td></tr><tr><td>데페록사민&nbsp;</td><td>Noxygen Science 운송 및 진단 GmbH</td><td>NOX-09.1-100mg&nbsp;</td><td>EPR용 시약</td></tr><tr><td>디에틸디티오카르바메이트(DETC)&nbsp;</td><td>Noxygen 과학 운송 및 진단 GmbH</td><td>NOX-10.1-1g&nbsp;</td><td>EPR용 시약</td></tr><tr><td>Dihydroethidium</td><td>Thermo Fisher Scientifics</td><td>D11347</td><td>슈퍼옥사이드 음이온 프로브</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Merck/Sigma</td><td>34869</td><td>원액 준비용&nbsp;</td></tr><tr><td>EPR 밀봉 왁스 플레이트</td><td>Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH</td><td>NOX-A.3-VPM</td><td>EPR</td></tr><tr><td>EPR 등급 물</td>용 소모품 <td>Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH</td><td>NOX-07.7.1-0.5L&nbsp;</td><td>EPR용 시약</td></tr><tr><td>인간 플라즈마에서 피브리노겐</td><td>Merck/Sigma</td><td>F4883</td><td>&mu;-슬라이드 코팅용</td></tr><tr><td>FITC anti-human CD41 항체</td><td>BioLegend</td><td>303704</td><td>플로우 사이토메트리를 위한 혈소판 특정 염색</td></tr><tr><td>유리 큐벳&nbsp;</td><td>Labmedics/Chronolog</td><td>P/N 312</td><td>응집체에서 인큐베이션용</td></tr><tr><td>소모품 Horm Collagen</td><td>Labmedics/Chronolog</td><td>P/N 385</td><td>혈소판 자극용</td></tr><tr><td>이미지J&nbsp;</td><td>미국 국립보건원(NIH)</td><td>NA</td><td>ImageJ 1.53t (Wayne Rasband)</td></tr><tr><td>Indomethacin</td><td>Merck/Sigma</td><td>I7378</td><td>혈소판 분리용</td></tr><tr><td>마이크로피펫 DURAN 50&micro; l</td><td>Noxygen 과학 운송 및 진단 GmbH</td><td>NOX-G.6.1-50&micro; </td><td>L EPR용 소모품</td></tr><tr><td>Poly-L-lysine hydrochloride</td><td>Merck/Sigma</td><td>P2658</td><td>&mu;슬라이드 코팅용</td></tr><tr><td>Prostaglandin E1 (PGE1)</td><td>Merck/Sigma</td><td>P5515</td><td>혈소판 분리용</td></tr><tr><td>구연산나트륨(4% w/v 용액)</td><td>Merck/Sigma</td><td>S5770</td><td>혈소판 분리용</td></tr><tr><td>교반 바(테프론 코팅)</td><td>Labmedics/Chronolog</td><td>P/N 313</td><td>응집계에서 배양을 위해 소모품</td></tr><tr><td>Superoxide dismutase&ndash; 폴리에틸렌 글리콜 (PEG-SOD)</td><td>Merck/Sigma</td><td>S9549</td><td>슈퍼옥사이드 음이온 제거제(특이성 조절)</td></tr><tr><td>인간 플라즈마의 트롬빈</td><td>Merck/Sigma</td><td>T6884</td><td>혈소판 자극 및 &mu;슬라이드 코팅용</td></tr><tr><td>VAS2870</td><td>Enzo Life Science</td><td>BML-EI395</td><td>NOX inhibitor</td></tr><tr><td>Zeiss 510 LSM 컨포칼 현미경</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td>컨포칼 현미경</td></tr></tbody></table>

혈소판에서 과산화물 음이온 생성을 검출하기 위한 대체 방법 

Alternative Methods for the Detection of Superoxide Anion Generation in Platelets

DHE 형광의 유세포 분석 검출을 위해 휴지 상태(그림 3A) 또는 0.1 unit/mL 트롬빈으로 자극된 혈소판(그림 3B)에 대한 대표적인 결과를 보여줍니다. O2•- 출력은 0.1 unit/mL 트롬빈(그림 3C) 또는 3μg/mL 콜라겐 관련 펩타이드(CRP)를 사용한 자극에 대해 표시된 바와 같이 혈소판 평균 형광 강도(MFI)로 정량화되었습니다(그림 3D). 혈소판 자극의 결과로 DHE 염색의 2/3배 증가가 관찰되었습니다. O2 • -가 측정되었는지 확인하기 위해 세포 투과성 O2 • - 제거제 페길 화 과산화물 디스 뮤타 제 (PEG-SOD, 100 units / mL)를 사용하는 것이 좋으며, O2 •-의 출처를 확인하기 위해 NOX 억제제 VAS2870 (10 μM)를 사용했습니다. 콜라겐과 트롬빈 모두에 대해 PEG-SOD 및 VAS2870는 혈소판 활성화로 인한 DHE 형광의 증가를 폐지하여 측정이 O2•-에 대해 특이적이며 이러한 조건에서의 소스가 NOX 효소임을 확인했습니다.
DHE 형광의 이미징 검출을 위해 콜라겐 또는 피브리노겐에 접착되는 순간(그리고 다음 10분)에 O2•- 의 생성을 평가하는 실험의 데이터(그림 4A) 또는 트롬빈으로 자극을 받았을 때 이전에 PLL에 부착된 혈소판에서 O2•- 생성을 평가하기 위한 실험의 데이터를 제시합니다(그림 4B). 예상대로, PLL에 대한 접착력은O2•-의 견고한 생성을 유발하지 않는다. 가장 가능성이 높은 이유는 이러한 형태의 접착이 어떠한 신호 반응(45)의 개시 없이 정전기 상호 작용에 의존하기 때문이며, 이는 이 접근법을 용해성 작용제의 첨가에 대한 응답으로O2•- 출력을 측정하는 데 적합하게 만든다. 이 프로토콜이 O2•-의 검출을 허용하는지 확인하기 위해 스캐빈저 또는 선택적 억제제를 사용할 수 있습니다. 우리는 이전 연구에서 N-아세틸-시스테인(NAC)이O2•- 를 청소하고 혈소판 형광을 제거할 수 있음을 보여주었습니다46. 여기에서 선택적 NOX 억제제가 콜라겐 또는 피브리노겐에 부착되거나(그림 4A) 트롬빈(그림 4B)에 반응하는 혈소판의 형광을 효과적이고 즉각적으로 감소시킬 VAS2870 있음을 보여줍니다. 이것은 NOX가 이러한 실험 조건에서 O2•- 의 원인임을 시사합니다. 콜라겐 또는 피브리노겐에 대한 접착 또는 PLL에 부착된 혈소판의 트롬빈에 의한 자극에 반응하는 DHE 형광(405nm 여기)의 대표적인 동영상이 각각 보충 파일 1, 보충 파일 2, 보충 파일 3에 포함되어 있습니다. 주목할 점은 다른 실험 설정에서 O2•- 제거제로 성공적으로 사용된 PEG-SOD는 이러한 유형의 실험에서 효과적이지 않다는 것입니다. 현재로서는 이에 대한 명확한 설명이 없습니다. 우리는 PEG-SOD가 O2•- 가 효율성이 낮거나 느린 역학으로 이미징 기반 분석에서 증가된 형광을 유도하는 세포 구획에 도달한다는 가설을 세울 수 있습니다. 이 점을 명확히 하기 위해 더 집중적인 조사가 필요할 수 있습니다.
우리는 이전에 발표된 다른 연구 1,13,47,48,49,50에서 혈소판에서 EPR에 의한 O 2•-의 측정을 적용했습니다. 이 기술의 중요한 단계는 상업적으로 이용 가능한 CM●(즉, 스핀 프로브 CMH와O2•- 및 EPR로 측정된 공진 종 사이의 반응 생성물)를 사용하여 보정선을 준비하는 것입니다. CMH와O2•-의 반응은 그림 5A에 나타나 있으며, 서로 다른 농도의 CM●에 의해 유도되는 EPR 신호의 대표적인 예가 그림 5B에 나타나 있다. 다양한 CM● 농도의 데이터를 사용하여 산화된 CMH의 양과 샘플의 EPR 신호 강도 간의 선형 상관 관계를 설명하는 보정 곡선을 작성했습니다(그림 5C). 아래 방정식은 CM● 농도와 EPR 신호 강도 간의 상관 관계를 설명하며 이 연구의 실험에 대한 검량선 계산의 시작점입니다(방정식 1).
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66647/66647eq01v2.jpg" style="margin: auto;">
CM● 농도와 해당 EPR 강도를 모두 실험적으로 얻었으므로 검량선의 기울 기 및 Y축 절편 을 계산할 수 있습니다. 그림 5C에 표시된 예에서 기울기 = 1,002,169 및 절편 = 596,383. 따라서 검량선에 대한 방정식은 다음과 같이 다시 작성할 수 있습니다.
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/66647/66647eq02.jpg" style="margin: auto;">
위의 방정식을 재배열하면 EPR 강도 값을 기반으로 다른 샘플에 대한 CM● 농도를 계산할 수 있습니다(방정식 2).
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/66647/66647eq03v2.jpg" style="margin: auto;">
샘플에서 CM● 의 농도가 알려지면 아래 방정식(방정식 3)을 사용하여 혈소판당 생성 속도와 시간 단위를 계산할 수 있습니다.
<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/66647/66647eq04v2.jpg" style="margin: auto;">
수식 2를 사용하면 수식 3을 (수식 4)로 다시 쓸 수 있습니다.
<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/66647/66647eq05v2.jpg" style="margin: auto;">
그림 5C에 표시된 예에서 다음과 같이 다시 작성할 수 있습니다.
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/66647/66647eq06v2.jpg" style="margin: auto;">
CMH 산화 속도는 분당 혈소판당 생성되는 CM●의 아토몰로 표현됩니다. 이 값은 실험과 공여체 간의 O2•- 생성 속도를 비교하는 데 사용할 수 있으며, 이는 DHE(또는 DCFDA)와 같은 형광 프로브에서는 불가능합니다. 형광 프로브는 일반적으로 동일한 실험 내에서 형광 강도의 변화로O2•- 생성에 대한 다른 조건의 효과만 추정할 수 있습니다. 이 기사에서 설명하는 모든 기술과 마찬가지로 ROS 제거제(예: PEG-SOD, NAC) 또는 과산화물 음이온을 생성하는 효소의 선택적 억제제(예: NOX 억제 VAS2870)로 검출의 특이성을 확인했습니다. 여기에서는 트롬빈(그림 6A,C,E) 또는 콜라겐(그림 6B,D,F)을 사용한 혈소판 자극(그림 6)에 대한 데이터를 제시합니다. 두 작용제 모두에 대해 PEG-SOD를 사용하여 O2•-가 검출되었음을 확인했지만, 페길화 카탈라아제(PEG-Cat.)에 대한 효과가 없다는 것은 이 기술로 과산화수소가 검출되지 않음을 시사합니다(각각 그림 6C,D). VAS2870는 트롬빈-(그림 6E) 및 콜라겐 유도(그림 6F) EPR 신호를 제거하며, 이는 NOX가 이 두 작용제에 대한 반응으로 혈소판 O2•-의 주요 공급원임을 시사합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66647/66647fig01.jpg"> 그림 1: 혈소판 현탁액의 유세포 분석 (A) 분리된 혈소판에 대한 전방(FSC) 및 측면 산란(SSC) 플롯의 일반적인 표현. (B) 항-CD41 항체를 이용한 혈소판 현탁액의 면역염색은 제제에 있는 입자의 &gt;98%를 혈소판으로 확인합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66647/66647fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66647/66647fig02.jpg"> 그림 2: DHE와 과산화물 음이온 및 기타 ROS의 화학 반응 및 제품의 스펙트럼 특성. DHE와 그 두 가지 산화 생성물인 2-하이드록시-에티듐(2OH-Et+)은 과산화물 음이온과 반응하여 생성되고, 에티듐(Et+)은 다른 유형의 ROS(예: 하이드록실 라디칼 및 과산화수소)와 반응하여 생성됩니다. 그림에서 파란색 점선 사각형으로 강조 표시된 405nm의 여기 피크는 2OH-Et+에 대해 고유하므로 O2•-를 검출/측정하는 데 사용할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66647/66647fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66647/66647fig03.jpg"> 그림 3: DHE 및 유세포 분석으로 검출된 트롬빈 및 콜라겐 의존성 과산화물 음이온 생성. (A) 휴지 및 (B) 트롬빈 자극 혈소판의 DHE 염색에 대한 대표 히스토그램. 이 막대는 DHE 염색 값이 500 미만임을 나타내며, 이는 휴지 및 트롬빈 자극 혈소판에 대해 각각 70.7% 및 16.1%입니다. 이 기법은 (C) 0.1 unit/mL 트롬빈 및 (D) 3 μg/mL 콜라겐 자극 혈소판에서 과산화물 음이온 생성을 추정하는 데 사용되었습니다. 이 실험에서 PEG-SOD(100 unit/mL)를 사용하여 과산화물 음이온이 측정되었음을 확인했으며, 10μM VAS2870를 사용하여 과산화물 음이온의 공급원으로 NOX 효소를 식별했습니다. 각 데이터 포인트는 50,000개의 혈소판에서 평균 형광 강도(MFI)로 계산되었으며, 각 실험은 그래프에 표시된 평균 ± SEM을 사용하여 5회 독립적으로 반복되었습니다(n = 5). 통계적 유의성은 쌍별 비교를 위해 Tukey 사후 테스트를 사용한 일원 분산 분석으로 평가되었습니다(** = p &lt; 0.01, *** = p &lt; 0.001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66647/66647fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66647/66647fig04.jpg"> 그림 4: DHE 형광 이미징으로 검출된 콜라겐, 피브리노겐 및 트롬빈 의존성 과산화물 음이온 생성. (A) 콜라겐 또는 피브리노겐에 부착하는 혈소판에 대해 과산화물 음이온 생성 역학을 평가했습니다. 혈소판은 이미징 시작 후 1분 후에 코팅된 μ-슬라이드에 분주되었으며, 이미지 수집 시작 5분 후에 10μM VAS2870이 추가되었습니다. (B) 트롬빈으로 자극할 때 혈소판에 대한 과산화물 음이온 생성 역학. 혈소판은 이미지 수집이 시작되기 전에 10분 동안 PLL-코팅된 μ-슬라이드에 부착되도록 했습니다. 2분 후 0.1 unit/mL 트롬빈을 첨가하고 5분 더 VAS2870 후 10μM 트롬빈을 첨가했습니다(즉, 이미징 시작으로부터 7분 후). 실험 방식은 패널 상단에 표시되며 0분, 1분, 3분, 6분 및 9분의 대표 이미지가 패널 중앙에 표시됩니다. 단일 혈소판 DHE 형광 정량화는 패널 하단에 표시되며 ImageJ를 사용한 형광 강도 분석으로 얻었습니다. 데이터는 4개의 독립적인 실험에서 조건당 8-12개의 혈소판에서 SEM± 평균입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66647/66647fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66647/66647fig05.jpg"> 그림 5: 검량선 및 CMH 산화율 계산. (A) CMH 및 CM●의 화학 구조 및 EPR 특성. (B) CM● (100 nM - 10 μM)의 다양한 농도에 대한 EPR 데이터의 대표적인 예. (C) EPR 강도 대 CM● 농도의 보정 곡선. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66647/66647fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66647/66647fig06.jpg"> 그림 6: 트롬빈 또는 콜라겐 자극 시 혈소판에 의한 과산화물 음이온 생성 감지. 과산화물 음이온 출력은 (A) 0.1 단위/mL 트롬빈 또는 (B) 3 μg/mL 콜라겐으로 자극된 혈소판에서 스핀 프로브 CMH를 사용하여 EPR로 측정했습니다. (씨, 디) 과산화물 음이온 제거제 PEG-SOD 100단위/mL 또는 과산화수소 제거제 페길화 카탈라제(PEG-Cat.) 100단위/mL의 농도가 두 작용제에 대해 테스트된 조건에 포함되었습니다. 과산화물 음이온의 출처는 NOX 억제제 VAS2870(10μM)와 함께 공동 배양하여 조사했습니다. (E) 트롬빈과 (F) 콜라겐은 모두 과산화물 음이온의 생성을 위한 NOX 활성에 의존합니다. 그림 전체에서, CMH/과산화물 음이온 반응 속도는 원고에 설명된 대로 EPR 트레이스로부터 계산되었습니다(방정식 4). 데이터는 5 (C, D) 및 4 개의 독립적 인 실험 (E, F)의 SEM± 평균입니다. 통계적 유의성은 쌍별 비교를 위해 Tukey 사후 테스트를 사용한 일원 분산 분석으로 평가되었습니다(** = p &lt; 0.01, *** = p &lt; 0.001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66647/66647fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 1: 콜라겐에 대한 접착에 반응하는 DHE 형광(405nm excitation)의 대표 동영상. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66647/Suppl%20file%201.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 2: 접착 피브리노겐에 반응하는 DHE 형광(405nm excitation)의 대표 동영상. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66647/Suppl%20file%202.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 3: PLL에 부착된 혈소판의 트롬빈에 의한 자극에 대응하여 DHE 형광(405nm excitation)을 대표하는 동영상입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66647/Suppl%20file%203.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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혈소판에서 과산화물 음이온 생성을 검출하기 위한 대체 방법

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