Name: Isolation, Expansion, and Nucleofection of Neural Stem Cells from Adult Murine Subventricular Zone (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-14T13:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: 학습하세요 성체 쥐 뇌실하 영역에서 신경줄기세포를 분리하고 배양하는 방법을. 뉴클레오펙션을 통해 유전자 전달 효율을 높이고 세포 생존률 80% 이상을 달성하는 개선된 프로토콜을 확인하세요.

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<meta charset="utf8"></head><body>쥐 뇌실하 영역에서 분리된 NSC의 효율적인 핵 분석

<ol><li>Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mammalian neural stem cells.</a> Science. 287 (5457), 1433-1438 (2000).</li>
<li>Ming, G., Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+in+the+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis in the mammalian central nervous system.</a> Ann Rev Neurosci. 28 (1), 223-250 (2005).</li>
<li>Doetsch, F., Caillé, I., Lim, D. A., García-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subventricular+zone+astrocytes+are+neural+stem+cells+in+the+adult+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Subventricular zone astrocytes are neural stem cells in the adult mammalian brain.</a> Cell. 97 (6), 703-716 (1999).</li>
<li>Obernier, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+is+sustained+by+symmetric+self-renewal+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis is sustained by symmetric self-renewal and differentiation.</a> Cell Stem Cell. 22 (2), 221-234 (2018).</li>
<li>Doetsch, F., García-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+a+germinal+layer+in+the+adult+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Regeneration of a germinal layer in the adult mammalian brain.</a> Proc Natl Acad Sci. 96 (20), 11619-11624 (1999).</li>
<li>Doetsch, F., García-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+composition+and+three-dimensional+organization+of+the+subventricular+germinal+zone+in+the+adult+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cellular composition and three-dimensional organization of the subventricular germinal zone in the adult mammalian brain.</a> J Neurosci. 17 (13), 5046-5061 (1997).</li>
<li>Mamber, C., Kozareva, D. A., Kamphuis, W., Hol, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shades+of+gray%3A+The+delineation+of+marker+expression+within+the+adult+rodent+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Shades of gray: The delineation of marker expression within the adult rodent subventricular zone.</a> Prog Neurobiol. 111, 1-16 (2013).</li>
<li>Cebrian-Silla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+of+the+ventricular-subventricular+zone+reveals+signatures+of+dorsal+and+ventral+adult+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis of the ventricular-subventricular zone reveals signatures of dorsal and ventral adult neurogenesis.</a> eLife. 10, e67436(2021).</li>
<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255 (5052), New York, N.Y. 1707-1710 (1992).</li>
<li>Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+expansion+of+the+adult+mouse+neural+stem+cells+using+the+neurosphere+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay.</a> J Vis Exp. (45), e2393(2010).</li>
<li>Jensen, J. B., Parmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strengths+and+limitations+of+the+neurosphere+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Strengths and limitations of the neurosphere culture system.</a> Mol Neurobiol. 34 (3), 153-161 (2006).</li>
<li>Ferrón, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+loss+of+Dlk1+imprinting+in+stem+cells+and+niche+astrocytes+regulates+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Postnatal loss of Dlk1 imprinting in stem cells and niche astrocytes regulates neurogenesis.</a> Nature. 475 (7356), 381-385 (2011).</li>
<li>Gil-Perotín, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neural+stem+cells+from+the+subventricular+zone%3A+A+review+of+the+neurosphere+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Record%22%5BJournal%5D)">Adult neural stem cells from the subventricular zone: A review of the neurosphere assay.</a> Anat Record. 296 (9), 1435-1452 (2013).</li>
<li>Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells%3A+origin%2C+heterogeneity+and+regulation+in+the+adult+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells: origin, heterogeneity and regulation in the adult mammalian brain.</a> Development. 146 (4), 156059(2019).</li>
<li>Ferrón, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combined+ex%2Fin+vivo+assay+to+detect+effects+of+exogenously+added+factors+in+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Prot%22%5BJournal%5D)">A combined ex/in vivo assay to detect effects of exogenously added factors in neural stem cells.</a> Nat Prot. 2 (4), 849-859 (2007).</li>
<li>Ferron, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+shortening+and+chromosomal+instability+abrogates+proliferation+of+adult+but+not+embryonic+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Telomere shortening and chromosomal instability abrogates proliferation of adult but not embryonic neural stem cells.</a> Development. 131 (16), 4059-4070 (2004).</li>
<li>Singec, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+actual+sensitivity+and+specificity+of+the+neurosphere+assay+in+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology.</a> Nat Meth. 3 (10), 801-806 (2006).</li>
<li>Santa-Olalla, J., Baizabal, J., Fregoso, M., Cárdenas, M. D. C., Covarrubias, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vivo+positional+identity+gene+expression+code+is+not+preserved+in+neural+stem+cells+grown+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The in vivo positional identity gene expression code is not preserved in neural stem cells grown in culture.</a> Eur J Neurosci. 18 (5), 1073-1084 (2003).</li>
<li>Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eyes+wide+open%3A+A+critical+review+of+sphere-formation+as+an+assay+for+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Eyes wide open: A critical review of sphere-formation as an assay for stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8 (5), 486-498 (2011).</li>
<li>Wan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+utility+and+limitations+of+neurosphere+assay%2C+CD133+immunophenotyping+and+side+population+assay+in+Glioma+stem+cell+research%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">The utility and limitations of neurosphere assay, CD133 immunophenotyping and side population assay in Glioma stem cell research.</a> Brain Pathol. 20 (5), 877-889 (2010).</li>
<li>Deleyrolle, L. P., Rietze, R. L., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neurosphere+assay%2C+a+method+under+scrutiny%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropsych%22%5BJournal%5D)">The neurosphere assay, a method under scrutiny.</a> Acta Neuropsych. 20 (1), 2-8 (2008).</li>
<li>Campos, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurospheres%3A+Insights+into+neural+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Neurospheres: Insights into neural stem cell biology.</a> Neurosci Res. 78 (6), 761-769 (2004).</li>
<li>Reynolds, B. A., Rietze, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+and+neurospheres%E2%80%94re-evaluating+the+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells and neurospheres—re-evaluating the relationship.</a> Nat Meth. 2 (5), 333-336 (2005).</li>
<li>Parker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+profile+of+an+operationally-defined+neural+stem+cell+clone%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Expression profile of an operationally-defined neural stem cell clone.</a> Exp Neurol. 194 (2), 320-332 (2005).</li>
<li>Belenguer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neural+stem+cells+are+alerted+by+systemic+inflammation+through+TNF-%CE%B1+receptor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Adult neural stem cells are alerted by systemic inflammation through TNF-α receptor signaling.</a> Cell Stem Cell. 28 (2), 285-299 (2021).</li>
<li>Cruz, M. T. G., Simões, S., Lima, M. C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((de+Improving+lipoplex-mediated+gene+transfer+into+C6+glioma+cells+and+primary+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">de Improving lipoplex-mediated gene transfer into C6 glioma cells and primary neurons.</a> Exp Neurol. 187 (1), 65-75 (2004).</li>
<li>Hagemann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+transfection+of+glioma+cell+lines+and+primary+cells+for+overexpression+and+RNAi+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Meth%22%5BJournal%5D)">High efficiency transfection of glioma cell lines and primary cells for overexpression and RNAi experiments.</a> J Neurosci Meth. 156 (12), 194-202 (2006).</li>
<li>Moritz, S., Lehmann, S., Faissner, A., Holst, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((von+An+induction+gene+trap+screen+in+neural+stem+cells+reveals+an+instructive+function+of+the+niche+and+identifies+the+splicing+regulator+Sam68+as+a+Tenascin-C-regulated+target+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">von An induction gene trap screen in neural stem cells reveals an instructive function of the niche and identifies the splicing regulator Sam68 as a Tenascin-C-regulated target gene.</a> Stem Cells. 26 (9), 2321-2331 (2008).</li>
<li>Montalbán-Loro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TET3+prevents+terminal+differentiation+of+adult+NSCs+by+a+non-catalytic+action+at+Snrpn%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">TET3 prevents terminal differentiation of adult NSCs by a non-catalytic action at Snrpn.</a> Nat Comm. 10 (1), 1726(2019).</li>
<li>Gritti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+and+fibroblast+growth+factors+behave+as+mitogenic+regulators+for+a+single+multipotent+stem+cell-like+population+from+the+subventricular+region+of+the+adult+mouse+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Epidermal and fibroblast growth factors behave as mitogenic regulators for a single multipotent stem cell-like population from the subventricular region of the adult mouse forebrain.</a> J Neurosci. 19 (9), 3287-3297 (1999).</li>
<li>Nieto-Estévez, V., Pignatelli, J., Araúzo-Bravo, M. J., Hurtado-Chong, A., Vicario-Abejón, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+transcriptome+analysis+reveals+molecular+hallmarks+of+neural+stem+cell+death%2C+survival%2C+and+differentiation+in+response+to+partial+FGF-2+and+EGF+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A global transcriptome analysis reveals molecular hallmarks of neural stem cell death, survival, and differentiation in response to partial FGF-2 and EGF deprivation.</a> PLoS One. 8 (1), 53594(2013).</li>
<li>Vergaño-Vera, E., Méndez-Gómez, H. R., Hurtado-Chong, A., Cigudosa, J. C., Vicario-Abejón, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor-2+increases+the+expression+of+neurogenic+genes+and+promotes+the+migration+and+differentiation+of+neurons+derived+from+transplanted+neural+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor-2 increases the expression of neurogenic genes and promotes the migration and differentiation of neurons derived from transplanted neural stem/progenitor cells.</a> Neuroscience. 162 (1), 39-54 (2009).</li>
<li>Gabay, L., Lowell, S., Rubin, L. L., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deregulation+of+dorsoventral+patterning+by+FGF+confers+trilineage+differentiation+capacity+on+CNS+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Deregulation of dorsoventral patterning by FGF confers trilineage differentiation capacity on CNS stem cells in vitro.</a> Neuron. 40 (3), 485-499 (2003).</li>
<li>Hack, M. A., Sugimori, M., Lundberg, C., Nakafuku, M., Götz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regionalization+and+fate+specification+in+neurospheres%3A+the+role+of+Olig2+and+Pax6%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regionalization and fate specification in neurospheres: the role of Olig2 and Pax6.</a> Mol Cell Neurosci. 25 (4), 664-678 (2004).</li>
<li>Bithell, A., Finch, S. E., Hornby, M. F., Williams, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+2+maintains+the+neurogenic+capacity+of+embryonic+neural+progenitor+cells+in+vitro+but+changes+their+neuronal+subtype+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor 2 maintains the neurogenic capacity of embryonic neural progenitor cells in vitro but changes their neuronal subtype specification.</a> Stem Cells. 26 (6), 1565-1574 (2008).</li>
<li>Pastrana, E., Cheng, L. C., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+prospective+purification+of+adult+subventricular+zone+neural+stem+cells+and+their+progeny%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Simultaneous prospective purification of adult subventricular zone neural stem cells and their progeny.</a> Proc Natl Acad Sci. 106 (15), 6387-6392 (2009).</li>
<li>Kobayashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+delivery+to+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Def+Res+C%22%5BJournal%5D)">Gene delivery to embryonic stem cells.</a> Birth Def Res C. 75 (1), 10-18 (2005).</li>
<li>Gresch, O., Altrogge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+difficult-to-transfect+primary+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Transfection of difficult-to-transfect primary mammalian cells.</a> Meth Mol Biol. 801, 65-74 (2011).</li>
<li>Maasho, K., Marusina, A., Reynolds, N. M., Coligan, J. E., Borrego, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+human+natural+killer+cell+line%2C+NKL%2C+using+the+Amaxa+nucleofection+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Meth%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the human natural killer cell line, NKL, using the Amaxa nucleofection system.</a> J Immunol Meth. 284 (1-2), 133-140 (2004).</li>
<li>von Holst, A., Egbers, U., Prochiantz, A., Faissner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem%2Fprogenitor+cells+express+20+tenascin+C+isoforms+that+are+differentially+regulated+by+Pax6%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Neural stem/progenitor cells express 20 tenascin C isoforms that are differentially regulated by Pax6.</a> J Biol Chem. 282 (12), 9172-9181 (2007).</li>
<li>Woodard, L. E., Wilson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac-ing+models+and+new+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Trend+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">piggyBac-ing models and new therapeutic strategies.</a> Trend Biotechnol. 33 (9), 525-533 (2015).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0.22 &무; m 모공 필터 병 (250 mL)</td><td>VWR</td><td>514-0330P</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &mu; m 기공 필터 병(500mL)</td><td>VWR</td><td>514-0332P</td><td></td></tr><tr><td>12웰 플레이트</td><td>LabClinics</td><td>PLC30012</td><td></td></tr><tr><td>15mL 튜브</td><td>Fisher</td><td>10738771</td><td></td></tr><tr><td>24웰 플레이트</td><td>LabClinics</td><td>PLC30024</td><td></td></tr><tr><td>4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(HEPES)</td><td>BioWest</td><td>L0180-100</td><td></td></tr><tr><td>4&prime;,6- 디아미디노-2-페닐린돌(DAPI)</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>48웰 플레이트</td><td>ThermoFisher</td><td>150687</td><td></td></tr><tr><td>6웰 플레이트</td><td>LabClinics</td><td>PLC30006</td><td></td></tr><tr><td>96웰 플레이트</td><td>Labclinics</td><td>PLC30096</td><td></td></tr><tr><td>Accutase 용액</td><td>Sigma</td><td>A6964-100ML</td><td>효소 용액</td></tr><tr><td>Amaxa 마우스 신경 줄기 세포 핵구맥자 Kit</td><td>Lonza</td><td>VPG-1004</td><td></td></tr><tr><td>Amaxa Nucleofector Iib</td><td>Lonza</td><td>10700807</td><td></td></tr><tr><td>항생제/항흡분제(A/A)</td><td>Sigma</td><td>A5955</td><td></td></tr><tr><td>Apo-t-Transferrine</td><td>Sigma</td><td>T2252-1G</td><td></td></tr><tr><td>Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)</td><td>Sigma</td><td>F0291</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>Sigma</td><td>203350</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td> <td>시그마</td><td>B4287-25MG</td><td></td></tr><tr><td>세포 여과기 40 &mu; m</td><td>LabClinics</td><td>PLC93040</td><td></td></tr><tr><td>디옥시뉴클레오티드 트리포스페이트(dNTPs)</td><td>NZYTech</td><td>MB08701</td><td></td></tr><tr><td>디메틸설폭사이드(DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s 인산염 식염수 완충액 (DPBS)</td> <td>Gibco</td><td>14080-055</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) F12 1:1</td><td>Gibco</td><td>11320-074</td><td></td></tr><tr><td>E. coli DH5&alpha; Competent Cells</td><td>ThermoFisher</td><td>EC0112</td><td></td></tr><tr><td>Earles's Balanced Salt Solution (EBSS)</td><td>Gibco</td><td>24010-043</td><td></td></tr><tr><td>표피 성장 인자 - 인간 재조합 (EGF)</td><td>Gibco</td><td>53003-018</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Sigma</td><td>E-6511</td><td></td></tr><tr><td>Fine</td><td>Forceps Fine Science Tools</td><td>11274-20</td><td></td></tr><tr><td>Fine Scissors Sharp</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-09</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G-7021</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq G2 Flexi DNA Polymerase</td><td>Promega</td><td>M7805</td><td>Kit에는 PCR용 시약이 포함되어 있습니다</td></tr>. <tr><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>H-3149</td><td></td></tr><tr><td>Insuline</td><td>Sigma</td><td>I6634</td><td></td></tr><tr><td>LB 한천 (Lennox)</td><td>LabKem</td><td>AGLB-00P-500</td><td></td></tr><tr><td>LB 국물 (Lennox)</td><td>LabKem</td><td>LBBR-00P-500</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteine</td><td>Sigma</td><td>C-8277</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer chamber</td><td>Blaubrand</td><td>BR718620</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease free water</td><td>Labbox</td><td>WATR-00A-10K</td><td></td></tr><tr><td>NZYMaxiprep Endotoxin Free Kit</td><td>NZYTech</td><td>MB39901</td><td></td></tr><tr><td>파파인 동결건조</td><td>워딩턴</td><td>LS003119</td><td></td></tr><tr><td>프로게스테론</td><td>시그마</td><td>P-6149</td><td></td></tr><tr><td>푸트레신</td><td>시그마</td><td>P-7505</td><td></td></tr><tr><td>메스</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>10316-14</td><td></td></tr><tr><td>sh스크램블</td><td>미션 (시그마)</td><td>SHC003</td><td></td></tr><tr><td>shSNRPN</td><td>미션 (시그마)</td><td>TRCN0000109285</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Selenite</td><td>Sigma</td><td>S-9133</td><td></td></tr><tr><td>스파튤라</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>10090-17</td><td></td></tr><tr><td>멸균 PES 주사기 필터 (0.22 &mu; m pore-filter)</td><td>Epica</td><td>SFPE-22E-050</td><td></td></tr><tr><td>T12.5 cm2 Flask</td><td>Biofil</td><td>TCF012025</td><td></td></tr><tr><td>T25 cm2 Flask</td><td>LabClinics</td><td>PLC70025</td><td></td></tr><tr><td>T75 cm2 Flask</td><td>LabClinics</td><td>PLC70075</td><td></td></tr><tr><td>핀셋</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>91150-20</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation, expansion, and nucleofection of neural stem cells from adult murine subventricular zone

Isolation, Expansion, and Nucleofection of Neural Stem Cells from Adult Murine Subventricular Zone

최적의 배양 조건으로 체외에서 성인 SVZ 유래 NSC의 분리 및 증식이 가능합니다. 성인 SVZ에서 유래한 NSC 배양은 특정 미세환경 내에서 NSC를 조절하는 분자 메커니즘 및 틈새 신호를 조사하기 위한 유용한 시험관 내 분석법으로 사용되었습니다. 이 원고에 요약된 신경구 분석은 성인 SVZ 내의 NSC 수를 검사하는 데 사용되었습니다. SVZ 조직을 3개월 된 마우스의 뇌에서 분리하고, 해리하고, EGF와 bFGF를 모두 보충하거나 각각 따로 보충한 완전한 NSC 배지에서 배양했습니다. 10일 시험관입(DIV) 후, 이러한 세 가지 별개의 배양 조건 하에서 형성된 1차 구체의 총 수를 위상차 현미경을 사용하여 정량화했습니다(그림 2A,B). 놀랍게도, 우리의 발견은 EGF의 존재가 최대의 일차 구체 형성으로 이어졌다는 것을 보여주며, 이는 bFGF만 있는 배양에서 관찰되는 일차 구의 수가 감소한 것에서 분명합니다(그림 2A, B). 다양한 배지 조건에서 NSC의 자가 재생 능력을 평가하기 위해 세포를 하위 배양하고 앞서 언급한 미토겐 조합이 보충된 배지에서 저밀도(5 cells/μL)로 도금했습니다. 2차 구체 정량화에 따르면 SVZ NSC가 효율적으로 자가 재생되기 위해서는 최소한 EGF가 필요하며 EGF와 bFGF의 조합은 세포의 자가 재생 능력을 개선합니다(그림 2B). 또한, 다양한 배지 조건에 걸친 성장 역학의 자세한 분석을 위해 7개의 통로를 통해 파종되고 얻어진 세포의 수를 기록했습니다. 다양한 배지 조건에서 얻은 성장 곡선은 EGF를 단독으로 보충하거나 bFGF와 함께 보충한 배양이 bFGF만 보충한 배양에 비해 향상된 성장 동력을 나타냈다는 것을 확인했습니다(그림 2C). 종합적으로 이러한 결과는 EGF와 bFGF를 동시에 사용하면 시험관 내 NSC 배양 수율이 향상된다는 것을 입증합니다.
다양한 출생 후 연령에 걸쳐 SVZ 내 NSC 수를 조사하고 마우스 노화가 신경구 배양 효율성에 미치는 영향을 평가하기 위해 1개월에서 12개월까지의 마우스의 SVZ 조직을 절개했습니다. 특히, 우리의 연구 결과는 연령이 증가함에 따라 주요 구체의 수가 크게 감소하는 것으로 나타났으며, 이는 생후 약 2-4개월에 구체 수의 최대 효율성을 보여줍니다(그림 2D). 또한, subcultureing 중 NSC의 자가 재생 능력을 평가하기 위해 2-4개월 된 마우스의 NSC를 하위 배양하고 완전한 배지에서 클론 밀도(5 cells/μL)로 파종했습니다. 후속 통로를 통한 2차 구체의 수를 정량화한 결과, 통로에 대한 배양 효율성이 상당히 감소한 것으로 나타났습니다(그림 2E). 이러한 모든 관찰을 바탕으로 NSC 배양 조건을 더욱 최적화하기 위해 초기 통로에서 자가 갱신 분석을 수행하는 것이 권장됩니다.
뉴클레오펙션(Nucleofection)은 성인 NSC에서 유전자 발현을 조작하기 위한 매우 효율적인 기술입니다 NSC는 유전자 발현을 조작하기 위해 쉽게 transfection할 수 없다는 점을 감안할 때, 여기에서는 바이러스 transduction을 사용할 필요 없이 더 높은 성공적인 유전자 전달률을 가진 nucleofection 프로토콜을 제시합니다. 2개월에서 4개월된 마우스의 개별 SVZ를 절개 및 배양한 후, NSC는 설명된 대로 GFP-운반 플라스미드로 핵융합되었습니다(그림 3A). 뉴클레오펙션 2일 후 GFP 양성 세포의 검출은 30%에서 50%에 이르는 효율을 나타냈으며, 이는 이전 문헌28과 일치했다. 성공적으로 뉴클레오펙션된 NSC를 특이적으로 분리하기 위해, 뉴클레오펙션(nucleofection) 3-5일 후의 GFP 형광 강도를 기준으로 FACS로 세포를 분류하였다(그림 3A-C). pre-FACS 분석 세포의 약 40%가 높은 GFP 형광 수준을 나타냈고 이후 분류를 통해 선택되었습니다(그림 3C). 분류된 GFP+ NSC의 재seeding은 모든 세포가 GFP 양성임을 보여주었으며, 이는 핵융합 기반 세포 분리 방법을 검증했습니다(그림 3D). 특히, 뉴클레오펙트된 NSC는 후속 과정을 통해 생존력을 유지하여 성인 NSC에 대한 뉴클레오펙션 타당성을 확인했습니다. 이러한 결과는 변형된 NSC의 순수 배양을 확립하기 위해 핵절충과 FACS를 결합하는 것의 효과를 강조합니다.
성인 NSC에서 유전자 조절의 예로, 짧은 헤어핀(sh) RNA 핵을 통한 유전자 감쇠가 사용되었습니다. 구체적으로, CAG-GFP 리포터(shSNRPN)를 운반하는 Small nuclear ribonucleoprotein polypeptide N(Snrpn) 유전자를 표적으로 하는 shRNA를 2개월 된 마우스에서 유래한 NSC 배양에서 핵융합했습니다. Snrpn의 하향 조절은 shSNRPN 플라스미드로 핵화된 세포에서 qPCR 및 면역세포화학에 의해 확인되었지만, 대조군 shSCRAMBLE 플라스미드에 대해서는 확인되지 않았습니다(그림 3E, F)29. NSC 자가 재생 능력에 대한 Snrpn 하향 조절의 효과를 설명하기 위해 핵절충된 세포에서 저밀도 분석을 수행했습니다(그림 3F,G). 핵절제된 배양에서 2차 신경구의 정량화는 Snrpn 하향 조절 시 신경구 형성 능력이 증가한다는 것을 보여주었습니다(그림 3G). 이 분석은 성인 NSC에서 유전자 발현을 조작할 수 있는 핵절착 능력을 강조하고, 보다 구체적으로 성인 NSC에서 줄기세포를 유지하는 데 있어 Snrpn의 역할을 식별합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66651/66651fig01.jpg"> 그림 1: SVZ 해부에 대한 자세한 설명. (A) 쥐의 뇌를 제거한 후 전체 뇌를 DPBS로 실리콘 패드로 옮겨 절개합니다. (B) 산부인과와 소뇌를 메스를 사용하여 뇌에서 제거합니다. (C) 뇌는 두 개의 반구로 나뉘어 별도로 해부를 진행합니다. (D) 뇌는 뇌량(corpus callosum)의 선을 따라 열려 피질과 선조체를 해마, 중격 및 간뇌에서 분리하여 외측 심실을 노출시킵니다. (E-F) 해마(hippocampus), 중격(septum), 간뇌(diencephalon)는 심실의 복부 한계(ventral limit)를 따라 제거됩니다. (지-나) SVZ와 피질의 로스트랄 및 꼬리 끝 너머의 조직은 뇌량(corpus callosum)을 따라 제거됩니다. (제이케이) SVZ가 옆을 향하도록 조직이 기울어져 SVZ 아래의 선조체 조직을 제거할 수 있습니다. (L) SVZ를 포함하는 얇은 조직 조각이 얻어집니다. 검은색 점선은 절단 위치를 나타냅니다. 검은색 점선은 각 단계에서 SVZ의 위치를 나타냅니다. 약어: OB = 후각 전구; CB = 소뇌. AH의 눈금 막대 : 5 mm; I-L: 3mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66651/66651fig1v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66651/66651fig02.jpg"> 그림 2: 미토겐 EGF와 bFGF는 모두 in vitro에서 NSC의 최적 배양 및 확장에 필요합니다. (A) EGF 및 bFGF 또는 각 미토겐이 개별적으로 보충된 NSC 배지에서 1차 및 2차 신경권 배양의 위상차 현미경 이미지. (B) 배양 배지의 미토겐 조성에 따라 마우스당 및 웰당 얻어진 1차 구체의 수: 미토겐 없음(회색, n=9), EGF+bFGF(파란색, n=33), EGF만(녹색, n=20) 또는 bFGF(분홍색, n=19, 왼쪽 패널). 배양 배지의 미토겐 조성에 따라 웰당 낮은 밀도(5개 세포/μL)로 형성된 2차 신경구의 수: 미토겐 없음(회색, n=11), bFGF(분홍색, n=18), EGF(녹색, n=18) 또는 EGF+bFGF(파란색, n=37, 오른쪽 패널). Dunn의 사후 분석을 사용한 Kruskal-Wallis 테스트가 사용되었습니다. (C) 배양 배지에 존재하는 미토겐에 따라 뚜렷한 신경구 배양에서 8개 통과 후 형성된 세포의 총 수를 보여주는 성장 곡선: bFGF(분홍색, n=5), EGF(녹색, n=5) 또는 EGF+bFGF(파란색, n=10). 선형 회귀 분석이 사용되었습니다. (D) 다양한 출생 후 발달 단계의 동물에서 해부되고 분해된 개별 마우스에서 파생된 주요 신경구의 수. 선형 회귀 분석이 사용되었습니다. n은 괄호로 표시됩니다. (E) 자가 재생 능력을 평가하기 위해 시험관 내 후속 통로를 통해 저밀도(5개 세포/μL)에서 형성된 2차 신경구의 수. Kruskal-Wallis 검정이 사용되었으며 p 값이 포함됩니다 : * : p&lt;0.05; **: p&lt;0.01; : p&lt;0.001; : p&lt;0.0001. N.S: 중요하지 않습니다. 오차 막대는 SEM을 나타냅니다. A의 눈금 막대는 100 μm입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66651/66651fig2v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66651/66651fig03.jpg"> 그림 3: nucleofection 과정 및 nucleofected cell의 FACS 기반 cell selection의 개략도. (A) nucleofection 과정 및 nucleofected cell의 FACS 기반 cell selection에 대한 개요. 1) 플라스미드 DNA 용액을 뉴클레펙션 용액과 결합하여 세포에 첨가합니다. 그런 다음 이 혼합물을 뉴클레오펙션을 위해 큐벳으로 옮겨집니다. 2) DNA와 세포를 담고 있는 큐벳을 뉴클레오프텍터에 삽입하여 전기충격을 가합니다. 성인 SVZ에서 분리된 신경권 배양의 경우 A-031 NSC 프로그램을 사용하는 것이 좋습니다. 3) 뉴클레오펙션 후 세포는 EGF 및 bFGF가 보충된 완전한 배지가 포함된 플라스크로 옮겨집니다. 4) plasmid DNA에 포함된 reporter의 발현에 따라 FACS로 세포를 분류합니다. 5) 분류된 세포는 후속 실험을 위해 추가 배양을 거칩니다. (B) 핵융합된 NSC에 대한 FACS 기반 선택 전략 및 게이팅. 먼저 높은 FSC-A 및 높은 SSC-A를 기반으로 살아있는 세포를 선택한 다음(왼쪽 그래프) FSC-A 대 FSC-H 매개변수를 분석하여 세포 이중항 및 삼중항을 제거합니다(오른쪽 그래프). (C) GFP 발현을 기반으로 한 핵세포에 대한 FACS 게이팅(SSC-A 대 FITC-A 형광). (D) FACS 선택 전(n=3) 및 후(n=4) 핵화된 NSC의 위상차 현미경 및 GFP 형광 이미지(왼쪽 패널). nucleofected GFP+ 세포의 비율은 FACS 선택 전후에 표시됩니다(오른쪽 패널). t-검정이 사용되었습니다. (엘레) Snrpn 특이적 shRNA(n=4)로 핵화된 증식하는 NSC에서 Snrpn 발현의 정량적 PCR(qPCR) 분석. shRNA SCRAMBLE을 사용한 Nucleofection이 대조군으로 작용했습니다(n=4). t-검정이 사용되었습니다. (F) shRNA nucleofection 7일 후 NSC에서 SNRPN(빨간색)을 표시하는 면역세포화학 이미지(외부 패널). DNA를 대조염색하기 위해 DAPI를 사용했습니다. shSNRPN 및 shSCRAMBLE 조건에서 NSC에서 파생된 신경구를 묘사한 대표적인 이미지(중간 패널). (G) shSNRPN(n=8) 또는 shSCRAMBLE(n=8)을 사용한 핵절법 후 NSC 배양에서 형성된 신경구의 수 정량화. t-검정이 사용되었습니다. P 값이 포함됩니다 : * : P&lt; 0.05; **: p&lt;0.01; : p&lt;0.001; : p&lt;0.0001. N.S: 중요하지 않습니다. 오차 막대는 SEM을 나타냅니다. D의 눈금 막대, 10 μm; F, 100 μm(F, 7 μm의 고배율 이미지). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66651/66651fig3v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Isolation and expansion of neural stem cells (NSCs) from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain can be achieved in a medium supplemented ...

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오 프로토콜은 성인 마우스 periventricular 지역에서 신경 줄기 세포를 생성하고 확장 neurosphere 분석 방법을 보여줍니다, 그리고 하나는 재현성 neurosphere 문화를 달성할 수 있도록 기술적인 통찰력을 제공합니다.

절연 및 Neurosphere 어세를 사용하여 성인 마우스 신경 줄기 세포의 확장

체세포 줄기 세포의 확장을 제어하는​​ 것은 자신의 연구와 치료에 사용 hampering 결정하는 주요 요인입니다. 여기 시간적 마우스 뇌에서 생성 된 뉴런의 수를 증가하는 데 사용할 수있는 개발 및 성인기 동안 신경 줄기 세포 확장을 제어 할 수있는 시스템을 설명합니다.

의 배아와 성인 신경 줄기 세포의 확장<em&gt; 자궁에</em&gt; Electroporation 또는 바이러스 성 Stereotaxic 주입

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Isolation and Culturing of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

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성체 신경 줄기세포(aNSCs) 확장을 위한 배양 시스템을 구축하면 치료를 위한 aNSC를 검사하고 적용할 수 있습니다. 굳은살하영역(subcallosal zone, SCZ)은 최근 성체 마우스에서 새로운 신경아세포 형성 영역으로 인식되고 있습니다. 여기에서는 SCZ-aNSC의 분리, 확장 및 분화 방법에 대해 설명합니다.

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이 기사에서는, 구체적으로, 메인 마우스 신경생성 틈새에서 유래된 산후 마우스 신경 줄기 세포로부터의 신경구 배양물의 생성을 위한 프로토콜을 설명한다. 신경구는 전구체 세포 수의 추정을 허용하는 두뇌 조직에서 신경 줄기 세포를 확인하기 위하여 이용됩니다. 더욱이, 이 3D 구조물은 세포 운명의 연구 결과허용하는 신경, oligodendrocytes 및 성상 세포를 초래하는 분화한 조건에서 도금될 수 있습니다.

산후 (P1−3) 마우스 신경성 틈새에서 신경구의 격리 그리고 확장

측면 뇌실 벽은 성인 포유류의 두뇌에서 가장 큰 새싹 지역을 포함하고 있습니다. 전통적으로이 지역에서 neurogenesis 연구는 histological 분석을위한 고전 sectioning 기술에 의존합니다. 여기서 우리는 다른 접근이 새싹 지역의 종합 엉 - 얼굴보기를 제공 wholemount 기법을 제시한다.

Subventricular 존 엉 - 얼굴 : Wholemount 스테 이닝 및 Ependymal 흐름

이 문서는 인간의 모낭에서 신경 문장의 줄기 세포의 분리와 문화에 대한 강력한 프로토콜을 제공합니다.

인간의 모공에서 신경 크레스트 줄기 세포의 분리와 문화

기록 칼슘 활동을위한 칼슘 표시기 염료와 subventricular 영역 (SVZ) 세포를로드 할 방법이 설명되어 있습니다. 출생 후의 SVZ는 신경 전구 세포와 neuroblasts 포함 단단히 포장 세포가 포함되어 있습니다. 오히려 목욕로드를 사용하는 것보다 우리가 더 나은 염료 확산을 허용 조직 내부의 압력에 의해 염료를 주입했다.

칼슘 이미징에 대한 급성 Subventricular 지대 슬라이스의 작성

학습하세요 성체 쥐 뇌실하 영역에서 신경줄기세포를 분리하고 배양하는 방법을. 뉴클레오펙션을 통해 유전자 전달 효율을 높이고 세포 생존률 80% 이상을 달성하는 개선된 프로토콜을 확인하세요.

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