Name: 마우스 췌장 내피 세포의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-21T14:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: 배우세요 마우스 췌장 내피 세포 분리 방법을 통해 췌장 혈관계의 정상 생물학 및 질병 발달 메커니즘을 이해하세요. 이 프로토콜은 부드러운 해리 기법과 자기 세포 분류를 사용하여 높은 생존율로 내피 세포를 풍부하게 합니다.

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<meta charset="utf8"></head><body>질병 연구를 위한 마우스 췌장 내피 세포 추출 간소화

<table><tbody><tr><td>1.5 mL eppendorf</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>10 cm 접시</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-202</td><td></td></tr><tr><td>25G 바늘</td><td>BD</td><td>305145</td><td></td></tr><tr><td>2X Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix</td><td>Vazyme</td><td>Q712-03-AA</td><td></td></tr><tr><td>5 mL eppendorf</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td></td><td></td>14282300</tr><tr><td>6웰 플레이트</td><td>Greiner Bio-One</td><td>07-000-208</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; m 여과기</td><td>Fisher</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD31-biotin</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>REA784</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 열 충격 처리</td><td>Fisher</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher</td><td>BP510</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagen Type 1, 송아지 피부에서</td><td>Sigma Aldrich& 주의;</td><td>C9791</td><td>프로토콜</td></tr><tr><td>콜라겐분해효소 유형 1의 부착 시약&nbsp;</td><td>Worthington Bio</td><td>LS004197</td><td></td></tr><tr><td>Countess 자동 세포 계수기</td><td>써모 피셔&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>써모 피셔&nbsp;</td><td>D1306</td><td>면역형광</td></tr><tr><td>일회용 안전 메스</td><td>Myco Instrumentation</td><td>6008TR-10</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I&nbsp;</td><td>로슈</td><td>260913&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (Ca2+,Mg2+)</td><td>써모 피셔&nbsp;</td><td></td><td></td>14080055</tr><tr><td>에탄올</td><td>Fisher</td><td>BP2818-4</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>Fisher</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td></td><td></td><td>37 &deg로 유지; C 5% CO2</td></tr><tr><td>LS 컬럼</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>M199</td><td>Sigma</td><td>M2520-1L</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand with the QuadroMACS Separator&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>미디엄 199</td><td>시그마 알드리치&nbsp;</td><td>M2520-10X</td><td></td></tr><tr><td>마이크로비즈 안티-비오</td>틴 <td>Miltenyi Biotech</td><td>130-090-485</td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td>Leica</td><td></td><td>세포 형태를 평가하기 위해</td></tr><tr><td>분자 등급 물</td><td>Corning</td><td>46-000-CM</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>New Brunswick Innova 44/44R Orbital shaker&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PECAM1 (CD31) 항체</td><td>Abcam</td><td>ab56299</td><td>immunofluorescence</td></tr><tr><td>PECAM1 (CD31) 항체</td><td>R& D Systems</td><td>AF3628</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 (10X) (Ca2+ 없음, Mg2+ 없음)</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-507-XB</td><td></td></tr><tr><td>프라이머 36B4 포워드 마우스</td><td>IDT</td><td></td><td>AGATTCGGGATATGCTGTTGGC</td></tr><tr><td>프라이머 36B4 Revese 마우스&nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td>TCGGGTCCTAGACCAGTGTTC</td></tr><tr><td>프라이머 Kdr 포워드 마우스&nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td>TCCAGAATCCTCTTCCATGC</td></tr><tr><td>프라이머 Kdr 리버스 마우스</td><td>IDT</td><td></td><td>AAACCTCCTGCAAGCAAATG</td></tr><tr><td>프라이머 Nkx6.1 리버스 마우스&nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td>CACGGCGGACTCTGCATCACTC</td></tr><tr><td>프라이머 Nxk6.1 포워드 마우스</td><td>IDT</td><td></td><td>CTCTACTTTAGCCCCAGCG</td></tr><tr><td>프라이머 PECAM1 포워드 마우스</td><td>IDT</td><td></td><td>ACGCTGGTGCTCTATGCAAG</td></tr><tr><td>프라이머 PECAM1 리버스 마우스</td><td>IDT</td><td></td><td>TCAGTTGCTGCCCATTCATCA</td></tr><tr><td>RNase ZAP</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>RNase-free water</td><td>Takara</td><td>RR036B</td><td></td></tr><tr><td>멸균 12" 긴 집게</td><td>F.S.T</td><td>91100-16</td><td></td></tr><tr><td>멸균 가는 집게</td><td>F.S.T</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>멸균 가는 가위</td><td>F.S.T</td><td>14061-11</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 접시 2cm</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-260</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol 시약</td><td>Fisher</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Trypan 블루</td><td>코닝</td><td>MT25900CI</td><td></td></tr><tr><td>트립신 억제제&nbsp;</td><td>Roche</td><td>10109886001</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>VE-Cadherin 항체</td><td>Abcam</td><td>ab33168</td><td>면역형광</td></tr><tr><td>수조</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

마우스 췌장 내피 세포의 분리

Isolation of Mouse Pancreatic Endothelial Cells

이 프로토콜에 따라, 3개의 마우스 췌장을 풀링할 때 약 2 x 106 개의 살아있는 세포를 얻을 수 있으며, 단일 마우스 췌장에서 750,000개의 세포를 얻을 수 있습니다. EC의 농축을 검증하기 위해 다음과 같은 분석을 수행했습니다: 1) 정량적 PCR: 플로우 스루(FT) 샘플(즉, non-CD31 항체 결합 분획)과 비교하여, EC 분획은 Pecam1 (CD31 인코딩) 및 Kdr (VEGFR2 인코딩) 수치가 현저히 높았고, 두 개의 EC 마커 유전자33 및 췌장 내분비 세포의 전사 인자인 NK6 homeobox 1 (Nkx6.1) 수치가 낮았습니다(그림 4A); 2) 웨스턴 블로팅(western blotting): 3가지 제제(pEC-1-3)의 EC가 풍부한 샘플은 예상 크기(~130kDa)에서 CD31의 강력한 신호를 보여주었습니다. 이에 비해 입력 샘플과 FT 샘플은 최소한의 CD31 신호를 보여주었습니다. 양성 대조군으로서, pEC 세포주인 MS1 세포의 용해물도 강한 CD31 신호를 보였습니다(그림 4B). 3) 트리판 블루 염색: 분리된 세포의 생존율이 약 50%임을 발견했습니다(그림 4C). 4) 발표된 프로토콜에 따른 유세포 분석15 : 살아있는 세포 집단에 대한 게이팅(Gating)을 통해 CD31+ 세포는 88%, TdTomato+ 세포는 76%임을 확인했습니다. 주목할 점은 대부분의 분리된 세포가 CD31과 TdTomato를 동시에 발현한다는 것입니다(그림 4E). 음성 대조군으로, 염색되지 않은 MS1 세포와 IgG로 배양된 MS1은 CD31로 표시된 살아있는 세포를 보여주지 않았습니다. 양성 대조군, 즉 CD31로 염색된 MS1 세포는 100%에 가까운 살아있는 CD31+ 세포를 보여주었습니다(그림 4F). 또한 분리된 세포를 배양하고, 발표된 프로토콜36에 따라 PECAM1의 면역형광 염색을 수행하고, 분리된 세포에서 두 마커의 강력한 신호를 보여 EC의 존재를 암시하는 TdTomato를 이미지화했습니다(그림 4G).
<img alt="혈관 구조 연구 및 세포 상호작용 분석을 위한 섬 내 EC를 보여주는 췌장 다이어그램." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66690/66690fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 
그림 1: 췌장과 췌장섬의 혈관형성에 대한 그림. 췌장 내피 세포(EC)와 섬 내 EC의 그림 묘사. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66690/66690fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="단일 세포 췌장 준비 다이어그램; 원심분리, CD31-비오틴 표지, 플로우 스루 분석." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66690/66690fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 
그림 2: 워크플로우 개요. 1) 췌장 해부, 2) 기계적 분해, 3) 효소 배양, 4) 원심분리, 5a) 상층액 제거 및 5b) 상층액 제거 및 5b) 6) 및 8) 펠릿 재구성 및 항체 결합, 9) 마이크로비즈 배양, 10) MACS 컬럼 농축, 11) 생존율을 위한 세포 계수, 12) 다운스트림 분석. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66690/66690fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="생물학 연구에서 췌장 채취, 분리 및 트리밍 과정을 보여주는 조직 해부." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66690/66690fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 
그림 3: 조직 처리 단계. (A) 복강, (B) 고립된 쥐 췌장, (C) 잘린 쥐 췌장의 이미지. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66690/66690fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="유전자 발현, CD31 분석, DAPI, 세포 분류, 형광 및 유세포 분석 결과." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66690/66690fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> 
그림 4: 마우스 췌장에서 분리된 EC 분획의 검증. (A) FT 샘플의 qPCR 및 농축을 위해 CD31을 사용한 농축된 EC 분획. Pecam1 (CD31), Kdr (VEGFR2) 및 Nkx6.1 (췌장 β세포 특이 전사 인자) 33. * t 검정을 기반으로 한 FT와 비교하여 p &lt;0.05를 나타냅니다. n = 각각 3 마리의 마우스로 구성된 3-4 개의 풀링 샘플. (B) CD31의 웨스턴 블로팅. pEC-1-3은 3개의 개별 풀링된 마우스 샘플에서 농축된 EC를 나타냅니다. 30mg의 세포 용해물을 각 레인에 로드한 후 Ponceau S 염색을 수행했습니다. (C) 생존율 분석을 위한 농축 pEC의 세포 계수 및 트리판 블루 염색. (D) 4', 6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI) 및 CD31 항체로 염색된 마우스 pEC에 대한 유세포 분석 게이팅 전략. (E) 염색되지 않은 MS1(왼쪽 상단), AlexaFluor-488 2차 항체로 염색된 MS1(IgG 대조군, 오른쪽 상단), CD31로 염색된 MS1(왼쪽 하단) 및 CD31로 염색된 분리된 마우스 pECs(오른쪽 하단)의 유세포 분석 히스토그램. (F) 유세포 분석을 사용하여 정량화된 살아있는 세포의 비율. (G) DAPI(파란색) 대조염색 및 내인성 TdTomato 형광 리포터(빨간색)를 사용한 CD31 발현의 면역형광(녹색). 스케일 바 = 100μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66690/66690fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="면역형광현미경 CD31/CD144/DAPI, Cdh5, Pecam1의 UMAP 유전자 발현 분석." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66690/66690fig05.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> 
그림 5: 쥐 췌장에서 CD31 및 CD144 특이성. (A) CD31(마젠타) 및 CD144(시안색)를 사용한 쥐 췌장의 면역형광, DAPI 대조염색. 광시야 형광 도립 현미경에서 10x 렌즈를 사용하여 캡처한 이미지. 눈금 막대 = 100μm. 점선은 섬 지역을 구분합니다. (B) scRNA-seq (GSE128565)37에 의해 검출된 C57BL6 마우스의 섬 EC에서 Cdh5 및 Pecam1 발현을 보여주는 UMAP(Uniform Manifold Approximation and Projection). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66690/66690fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>효소</td>
			<td>쓰다</td>
			<td>온도와 시간</td>
			<td>참조</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>콜라겐분해효소 I</td>
			<td>단일 세포 해리, 전체 췌장 EC 농축</td>
			<td>37°C, 20분</td>
			<td>이 프로토콜</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>콜라겐분해효소 IV</td>
			<td>Islet Isolation 및 비효소적 해리</td>
			<td>37°C, 20분</td>
			<td>46</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>콜라겐분해효소 + 트립신</td>
			<td>쥐 췌장의 관 세포 검사</td>
			<td>37°C, 30분</td>
			<td>47</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>콜라겐분해효소 B</td>
			<td>췌장의 단세포 현탁액</td>
			<td>37°C, 30분</td>
			<td>48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>콜라겐분해효소 NBI</td>
			<td>섬 격리</td>
			<td>37°C, 30분</td>
			<td>49</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>콜라겐 분해 효소 P</td>
			<td>Acinar 실행 가능한 현탁액</td>
			<td>37 °C, 15 분</td>
			<td>45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>콜라겐분해효소 XI</td>
			<td>섬 격리</td>
			<td>37 °C, 15 분</td>
			<td>35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>디스플레이</td>
			<td>단일 세포 현탁액</td>
			<td>37 °C, 45 분</td>
			<td>24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>리베아제</td>
			<td>단일 세포 현탁액</td>
			<td>37 °C, 10 분</td>
			<td>25, 48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>트립신</td>
			<td>단세포 해리, 전체 췌장</td>
			<td>4 °C, O/N</td>
			<td>28</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 1: 쥐 췌장 샘플을 처리하는 데 사용되는 다양한 프로토콜 요약.

The pancreas is a vital organ for maintaining metabolic balance within the body, in part due to its production of metabolic hormones such as insulin and ...

isolation-of-mouse-pancreatic-endothelial-cells

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

랑게르한스 섬이라고도 불리는 췌장 섬은 포도당 조절 및 기타 중요한 생물학적 기능을 위한 호르몬을 생산하는 내분비 세포의 클러스터입니다. 이 프로토콜은 먼저 Vater의 Ampulla를 통해 콜라겐 분해 효소를 관류하여 외분비 췌장 조직을 소화하고 단순화 된 밀도 구배 원심 분리를 통해 췌장 섬을 분리하는 방법을 설명합니다.

콜라겐분해효소 관류를 통한 췌장섬 분리: 췌장섬 세포를 분리하는 효소 방법

이 문서에서는, 우리는 분리와 생쥐 췌장에서 배양 기본 췌장 포상 세포에 대한 신속하고 편리하게 절차를 설명합니다. 이 방법은 신선한 차 변환되지 않은 정상 / 외분비 췌장 세포의 생리학을 연구하는 귀중한 방법을 구성합니다.

마우스 기본 췌장 포상 세포의 분리 및 문화

우리는 여기에서 제2형 당뇨병의 마우스 모델, Leprdb에서 섬을 분리하기 위한 프로토콜과 2개의 광자 현미경을 사용하는 온전한 섬에서 인슐린 분비를 측정하기 위한 라이브 셀 분석의 세부 정보를 제시합니다.

Lepr<sup&gt; DB</sup&gt; 2 형 당뇨병의 마우스 모델 : 본래 독도 췌장 섬 세포의 분리 및 라이브 셀 2 광자 이미징

이 프로토콜은 이미징 또는 분자 생물학 실험을 수행하기 위해 마우스 관상 동맥 내피 세포를 분리하는 방법을 공유하기 위해 준비되었습니다.

마우스 관상 내피 세포의 분리

우리는 신생아 쥐에서 그대로 섬을 분리 본원 프로토콜을 설명합니다. Pancreata 부분적으로 세척하고 손을 따기 다음, 콜라게나로 소화했다. 20-80 아일렛 클러스터 여러 섬 연구에 적합한 새로 태어난 쥐의 췌장에 따라 얻을 수있다.

신생아 마우스 췌장의 기능 독도의 효과적인 분리

이 섬 격리 프로토콜은 외분비 조직을 소화하기 위해 콜라게나아제 주사의 새로운 경로를 설명하고 마우스로부터 섬을 정화하기 위한 단순화된 그라데이션 절차를 설명했다. 효소 소화, 그라데이션 분리/정제, 그리고 아일렛 수작업 피킹이 포함됩니다. 성공적인 절연은 마우스당 250~350개의 고품질 및 완전한 기능을 갖춘 아일렛을 생성할 수 있습니다.

마우스에서 췌장 췌도 격리를 위한 간단한 고효율 프로토콜

여기 우리는 잠재적인 diabetogenic xenobiotic 화학 물질 식별는 xenobiotics에 의해 선생님 inductions을 심사에 대 한 마우스 췌 장 섬 세포 격리 프로토콜을 제시.

Diabetogenic 환경 화학 물질에 대 한 Murine 췌 장 섬 세포 기반 검사

여기에서, 우리는 췌도 세포와 같은 이기종 세포 집단에 있는 칼슘 역학을 화상 진찰 그리고 정량화하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 형광 기자는 그 때 고정화되고 심상되는, 그리고 형광 강렬의 역학의 세포 당 분석이 수행되는 작은 틀 내의 세포의 말초 층으로 전달됩니다.

마우스 췌도 세포의 하위 집단에 있는 화상 진찰 칼슘 역학

여기서 우리는 원발성 마우스 간 정현파 내피 세포 (LSEC) 분리를위한 프로토콜을 개략적으로 설명하고 시연합니다. 이 프로토콜은 간 콜라게나제 관류, 저속 원심분리에 의한 비실질 세포 정제 및 CD146 마그네틱 비드 선택을 기반으로 합니다. 우리는 또한 표현형과 유세포 분석기 및 주사 전자 현미경을 사용하여 이러한 분리 된 LSEC를 특성화합니다.

마우스 일차 간 정현파 내피 세포의 분리 및 특성화

이 기사에서는 신생아 마우스에서 일차 폐 내피 세포를 분리하고 배양했습니다.

일차 마우스 폐 내피 세포의 분리

이 연구는 마우스 췌장에서 기능성 원차 섬과 선반세포를 효율적으로 추출하는 단순화된 방법을 개발하여, 급성 췌장염 유발 당뇨병의 발병 기전에서 세포 간 소통을 연구하는 귀중한 도구를 제공하였습니다.

마우스에서 1차 섬과 1차 췌장 아시나세포를 동시에 분리하는 간단하고 신속한 방법

배우세요 마우스 췌장 내피 세포 분리 방법을 통해 췌장 혈관계의 정상 생물학 및 질병 발달 메커니즘을 이해하세요. 이 프로토콜은 부드러운 해리 기법과 자기 세포 분류를 사용하여 높은 생존율로 내피 세포를 풍부하게 합니다.

마우스 췌장 내피 세포의 분리

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