Name: 저산소증 민감성 키메라 항원 수용체-T 세포의 생성 및 기능 검증 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: 배우세요 저산소증 민감성 CAR-T 세포의 렌티바이러스 기반 생성 및 기능 검증 방법을. 이 프로토콜은 종양 미세환경에서 선택적 세포독성을 연구하는 연구자들에게 도움이 됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 연구에서는 HER2(유전자 ID: 2064)를 표적으로 하는 저산소증 민감성 CAR인 HER2-BBz-ODD를 일반 CAR2-BBz와 비교했습니다. 두 CAR의 개략도는 그림 1A에 나와 있으며, 이는 HER2-BBz-ODD가 ODD 시퀀스를 CD3ξ의 C-터미널에 추가하여 HER2-BBz에서 파생됨을 보여줍니다. 두 CAR을 발현하는 렌티바이러스 벡터의 구축과 293T 세포 transfection에 의한 해당 렌티바이러스의 생성은 이전에 설명되었습니다31.
1. 렌티바이러스 감염에 의한 저산소증 민감성 CAR-T 세포 생성
<ol><li>냉동 보존된 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 수조에서 37°C에서 빠르게 해동합니다. 해동된 PBMC를 400IU의 IL-2, 5ng/mL IL-7 및 10ng/mL IL-15(인간 T 세포 성장 배지, 이후 TGM 이라고 함)가 보충된 9mL의 무혈청 림프구 배양 배지가 들어 있는 15mL 튜브에 넣습니다.</li>
	<li>세포 계수를 위해 부분 표본을 채취한 후 튜브를 300× g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 펠릿화된 PBMC를 4 × 106 cells/mL의 밀도에서 TGM으로 재현탁시키고 현탁액을 6웰 플레이트로 옮깁니다.</li>
	<li>항-hCD3/hCD28 코팅 면역비드를 준비합니다.<ol><li>100μL의 마우스 IgG 마그네틱 비드를 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브에 옮기고 PBS가 있는 마그네틱 스탠드를 사용하여 2회 세척합니다.</li>
		<li>비드를 100 μL의 PBS에 재현탁시키고 0.2 μg의 마우스 항-인간 CD3 항체와 2 μg의 마우스 -안티-휴먼 CD28 항체를 추가합니다. 피펫을 사용하여 혼합물을 부드럽게 혼합하고 4°C에서 밤새 흔들어 줍니다.</li>
		<li>PBS가 있는 마그네틱 스탠드를 사용하여 비드를 2번 세척하고 100μL의 PBS에 재현탁합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>1.2단계에서 1:1의 bead-to-cell 비율로 anti-hCD3/hCD28 코팅된 immunobeads를 플레이트에 추가합니다. 37 ° C에서 5 % CO2 가습 된 인큐베이터에 플레이트를 놓습니다.</li>
	<li>48시간 배양 후 세포를 피펫으로 부드럽게 혼합한 후 세포 현탁액을 15mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 튜브를 마그네틱 스탠드에 3분 동안 놓고 상층액을 새 15mL 튜브에 조심스럽게 옮겨 PBMC에서 면역비드를 제거합니다.</li>
	<li>세포 계수를 위해 부분 표본을 취한 다음 300μL의 TGM에서 5 × 105 세포/웰에서 PBMC를 48웰 평판에 파종합니다. 200 μL의 렌티바이러스 스톡을 해당 웰에 넣고 프로타민 설페이트를 최종 농도 10 μg/mL까지 첨가합니다.</li>
	<li>32°C에서 1,000×g으로 플레이트를 1.5시간 동안 원심분리하고 피펫을 사용하여 각 웰에서 300μL의 상층액을 조심스럽게 제거하고 버립니다. 그런 다음 피펫을 사용하여 1mL의 신선한 TGM을 추가하고 37°C에서 5% CO2 가 있는 가습 인큐베이터에 플레이트를 넣습니다.</li>
	<li>새로운 TGM을 추가하여 세포 밀도를 0.5-2 ×10-6 cells/mL로 2-3일마다 조정합니다. 먼저 세포를 12-웰 플레이트로 옮긴 다음 6-웰 플레이트로 옮깁니다. 4mL 부피에서 총 수가 6 × 106 에 도달할 때까지 세포를 계속 배양합니다. 참고: 이와 병행하여 TGM을 10% 소 태아 혈청(FBS)을 함유RPMI1640 배지로 교체하는 경우를 제외하고는 위에서 설명한 것과 동일한 절차에 따라 Jurkat T 세포의 CAR transduction을 수행합니다.</li>
</ol>2. 유세포 분석을 이용한 CAR-T 세포의 산소 의존성 CAR 발현 평가
<ol><li>1.8단계에서 CAR 형질주입된 T 세포를 TGM 2mL에서 2.5 × 106 cells/well의 밀도로 2개의 12웰 플레이트로 패팅합니다. 37 ° C에서 5 % CO2 (정상 산소 상태, 세포 배양의 표준 조건은 21 % O2 임)가습 된 인큐베이터에 한 플레이트를 직접 놓고 다른 플레이트를 O2 수준이 1 % (저산소 상태)로 사전 설정된 이동식 CO2 / O2 / N2 인큐베이터 챔버에 놓고 챔버를 가습 된 상태로 유지하십시오. 37 ° C에서 5 % CO2 / 94 % N2 인큐베이터.</li>
	<li>24시간마다 저산소 또는 정상 산소 조건에서 플레이트에서 5 × 105 세포를 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에 수집합니다. 500× g 에서 5분 동안 튜브를 원심분리하고 상층액을 제거한 다음 피펫팅을 통해 PBS 1mL의 세포를 부드럽게 재현탁시킵니다. PBS 세척을 한 번 더 반복합니다.</li>
	<li>각 튜브에서 50μL의 FACS 완충액(PBS에 2% FBS가 보충됨)에 펠릿 셀을 재현탁시킵니다. 1:100 희석액의 PE 복합 항-플래그 항체 50μL(0.2μg/mL)를 추가하고 피펫팅으로 철저히 혼합합니다. 어두운 곳에서 실온에서 20분 동안 배양합니다.</li>
	<li>배양이 끝나면 각 튜브에 1mL의 FACS 완충액을 추가합니다. 피펫팅으로 완전히 혼합한 다음 500× g 에서 5분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거하고 버리고 2.4단계를 한 번 더 반복합니다.</li>
	<li>피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거하고 폐기합니다. 200 μL의 FACS 완충액에 세포를 재현탁시킨 다음 생성된 세포 현탁액을 5mL 유관으로 옮깁니다.</li>
	<li>2.6단계에서 세포 현탁액에 대한 유세포 분석을 수행하여 표면 CAR 발현을 확인합니다. transfection되지 않은 T 세포를 음성 대조군으로 포함합니다.<ol><li>FSC/SSC 및 FSC-A/FSC-H 게이트를 사용하여 살아있는 단일 세포를 스크리닝합니다. 모든 샘플에 대해 1 × 104 개의 라이브 단일 이벤트를 수집합니다. EGFP(성공적으로 transduction된 T 세포의 지표로 렌티바이러스 벡터에 포함된 구성 마커)에 양성인 세포를 게이트시킨 다음 피코에리트린(PE)(CAR 발현 세포)에 양성인 세포를 게이트하여 PE 양성률과 평균 형광 강도(MFI)를 측정합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 웨스턴 블롯에 의한 CAR 변형 Jurkat T 세포의 CAR 발현의 산소 의존성 분석
<ol><li>섹션 1의 CAR 형질주입된 Jurkat T 세포를 2개의 48웰 플레이트에 5 × 105 세포의 밀도(500μL 배양 부피)로 10% FBS가 있는 배지에서 플레이트RPMI1640 만듭니다.</li>
	<li>한 플레이트의 경우 CoCl2를 실험 웰에 0 μM, 50 μM 또는 200 μM의 최종 농도로 추가합니다. 그런 다음 플레이트를 37°C(정상 산소 상태)에서 가습된 5% CO2 인큐베이터에 넣습니다. 다른 플레이트의 경우 CoCl2를 추가하지 말고 동일한 인큐베이터로 옮기기 전에 O2 레벨이 1%(저산소 상태)로 사전 설정된 이동식 CO2/O2/N2 인큐베이터 챔버에 넣으십시오.</li>
	<li>24시간 배양 후 세포 현탁액을 1.5mL 미세 원심분리 튜브에 옮깁니다. 튜브를 500× g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 먼저 1mL 피펫을 사용한 다음 100μL 피펫을 사용하여 상층액을 완전히 제거하고 폐기한 다음 세포 펠릿을 50μL의 1x SDS-PAGE 샘플 버퍼에 재현탁시킵니다.</li>
	<li>끓는 물 욕조에서 샘플을 10분 동안 가열합니다. 즉시 튜브를 얼음 위에 30초 동안 놓은 다음 16,000× g 에서 30초 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>투명화된 샘플 30μL를 두께가 1.5mm인 10웰, 10% SDS PAGE 겔의 각 슬롯에 로드합니다. 겔을 80V에서 30분 동안 작동시킨 다음 전압을 100V로 높이고 1.5시간 동안 실행합니다.</li>
	<li>전기영동이 끝나면 표준 습식 전달 방법을 사용하여 겔에서 PVDF 멤브레인으로 단백질을 전달하며, 전류 및 지속 시간은 각각 400mA 및 1시간으로 설정됩니다.</li>
	<li>실온에서 1시간 동안 차단 완충액(PBST(PBS+0.05% Tween-20)의 5% 우유(w/v))로 멤브레인을 차단합니다. 그런 다음 GAPDH 하중 제어 검출을 위해 30kD에서 40kD 사이의 조각을 잘라내고 CAR 분자 검출을 위해 50kD에서 70k D 사이의 조각을 잘라냅니다.</li>
	<li>30-40 kD 및 50-70 kD 조각을 마우스 항-GAPDH 항체(1:2,000 희석) 및 마우스 항-플래그 항체(1:2,000 희석)와 함께 각각 3mL의 차단 완충액에 실온에서 2시간 동안 또는 4°C에서 밤새 배양합니다.</li>
	<li>플랫폼 로커에서 실온에서 PBST로 멤브레인을 3 x 5분 동안 세척합니다.</li>
	<li>HRP-conjugated goat anti-mouse 항체 (1:5,000 희석)로 멤브레인을 3mL의 차단 완충액에 넣고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 PBST로 멤브레인을 5 x 10분 동안 세척합니다.</li>
	<li>HRP 기질로 배양하여 멤브레인을 개발한 다음 발광 이미지 분석기를 사용하여 검출된 단백질 띠를 시각화합니다.</li>
</ol>4. 저산소증 민감성 CAR-T 세포에 의해 매개되는 세포독성의 산소 의존성에 대한 시험관 내 평가
<ol><li>0일차에 2개의 검은색 평면 바닥 96웰 조직 배양 플레이트에 10% FBS가 포함된 200μL의 DMEM에 실험 웰당 1 × 10개의4 표적 세포(SKOV3-Luc 세포)를 파종합니다.</li>
	<li>1일차에 각 웰 상단에서 상층액 100μL를 조심스럽게 제거합니다. 10% FBS를 함유한 100μL의 DMEM 배지에 1:1, 2:1 및 4:1의 effector-to-target 비율로 CAR-T 세포 또는 non-transducted T 세포를 추가합니다.</li>
	<li>21단계에서 설명한 대로 이동식 CO2/O2/N 2 인큐베이터 챔버를 사용하여 한 플레이트를 21% O2 분위기에 놓고 다른 플레이트를 1% O2 분위기에 놓습니다. 참고: 이동식 CO2/O2/N2 인큐베이터 챔버를 사용할 수 없는 경우 배양 배지에 CoCl2 를 추가하여 저산소 상태를 모방할 수 있습니다.</li>
	<li>2일차, 24시간의 공동 배양 후 피펫을 사용하여 모든 상층액(약 150-200μL)을 새로운 U-바닥 96웰 플레이트에 조심스럽게 옮깁니다. 나중에 사이토카인을 검출할 수 있도록 -20°C에서 보관하고 섹션 5에 설명된 절차에 따라 보관합니다.</li>
	<li>60 μL의 1x 수동 용해 완충액을 4.4단계에서 검은색 평평한 바닥 96웰 플레이트의 각 실험 웰에 추가합니다. 그런 다음 플레이트를 셰이커에 놓고 효율적인 세포 용해를 위해 30분 동안 흔듭니다.</li>
	<li>각 실험 웰에 60μL의 반딧불이 루시페라아제 기질을 추가하고 마이크로플레이트 리더를 사용하여 루시페라아제 활성을 즉시 측정합니다.</li>
	<li>방정식 (1)을 사용하여 정규화된 세포독성(%)을 계산합니다. 정규화 된 세포 독성 (%) = 100 - <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66697/66697eq01.jpg" style="margin: auto;"> ×100 (1)</li>
</ol>5. 저산소증 민감성 CAR-T 세포에 의한 IL-2 및 IFN-γ 분비 검출
<ol><li>0일차에 코팅 완충액에서 IL-2 또는 IFN-γ 포획 항체를 1:250 희석하여 준비합니다. 희석된 항체 100μL를 96웰 ELISA 플레이트의 각 웰에 추가하고 플레이트를 4°C에서 밤새 배양합니다. 참고 : 코팅 완충액은 증류수 1L에 NaHCO3 7.13g 과 Na2CO3 1.59g을 용해시키고 pH를 9.5로 조정하여 만듭니다.</li>
	<li>1일차에 플레이트를 세게 뒤집어 흡착되지 않은 포획 항체를 제거한 다음 200μL의 세척 완충액(0.05% Tween 20 함유 PBS)으로 웰을 3회 세척합니다.</li>
	<li>각 웰에 200μL의 분석 희석제(10% FBS를 함유한 PBS)를 추가하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>접시를 세게 뒤집어 용액을 버리십시오. 그런 다음 200μL의 세척 버퍼로 웰을 3번 세척합니다.</li>
	<li>4.4단계에서 얼어붙은 상층액 샘플/플레이트를 실온에서 해동합니다. 완전히 해동되면 샘플과 표준물질을 Assay Diluent로 희석합니다. 100μL의 희석된 샘플 또는 표준물질을 코팅된 ELISA 플레이트의 각 웰에 추가하고 실온에서 2시간 동안 배양합니다. 참고: IL-2 검출의 경우 10배 희석이 권장되는 반면 IFN-γ 검출의 경우 50배 희석이 선호됩니다.</li>
	<li>플레이트를 세게 뒤집어 샘플과 표준물질을 제거한 다음 웰당 200μL의 세척 버퍼로 웰을 5번 세척합니다.</li>
	<li>IL-2 검출 항체 또는 IFN-γ 검출 항체/Streptavidin-HRP(SAv-HRP)를 분석 희석액에서 1:250 비율로 희석하여 작동하는 검출 솔루션을 준비합니다. 각 웰에 100 μL의 작업 검출 용액을 추가하고 플레이트를 실온에서 1시간 동안 부드럽게 흔들어 배양합니다.</li>
	<li>용액을 버리고 200μL의 세척 완충액으로 웰을 7번 세척합니다.</li>
	<li>각 웰에 100 μL의 기질 시약을 추가하고 어두운 곳에서 30분 동안 실온에서 플레이트를 배양합니다.</li>
	<li>각 웰에 50μL의 정지 용액(1 M H2SO4)을 추가합니다. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450nm에서 흡광도를 즉시 판독합니다.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>선택적 종양에 대한 저산소증 민감성 CAR-T 세포의 기능적 검증

<ol><li>Boardman, A. P., Salles, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR+T-cell+therapy+in+large+B+cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">CAR T-cell therapy in large B cell lymphoma.</a> Hematol Oncol. 41 (S1), 112-118 (2023).</li>
<li>Chen, Y. -J., Abila, B., Mostafa Kamel, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR-T%3A+What+is+next%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">CAR-T: What is next.</a> Cancers. 15 (3), 663(2023).</li>
<li>Barsan, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tisagenlecleucel+utilisation+and+outcomes+across+refractory%2C+first+relapse+and+multiply+relapsed+B-cell+acute+lymphoblastic+leukemia%3A+A+retrospective+analysis+of+real-world+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22eClinicalMedicine%22%5BJournal%5D)">Tisagenlecleucel utilisation and outcomes across refractory, first relapse and multiply relapsed B-cell acute lymphoblastic leukemia: A retrospective analysis of real-world patterns.</a> eClinicalMedicine. 65, 102268(2023).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncolytic+herpes+simplex+virus+delivery+of+dual+CAR+targets+of+CD19+and+BCMA+as+well+as+immunomodulators+to+enhance+therapeutic+efficacy+in+solid+tumors+combined+with+CAR-T+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Oncolytic herpes simplex virus delivery of dual CAR targets of CD19 and BCMA as well as immunomodulators to enhance therapeutic efficacy in solid tumors combined with CAR-T cell therapy.</a> Front Oncol. 12, 1037934(2022).</li>
<li>Liu, C., Qi, T., Milner, J. J., Lu, Y., Cao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Speed+and+location+both+matter%3A+Antigen+stimulus+dynamics+controls+CAR-T+cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Speed and location both matter: Antigen stimulus dynamics controls CAR-T cell response.</a> Front Immunol. 12, 748768(2021).</li>
<li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+anti-solid+tumor+efficacy+of+CAR-T+cells+by+inhibiting+adenosine+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Improving the anti-solid tumor efficacy of CAR-T cells by inhibiting adenosine signaling pathway.</a> Oncoimmunology. 9 (1), 1824643(2020).</li>
<li>Derenzo, C., Gottschalk, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+modification+strategies+to+enhance+CAR+T+cell+persistence+for+patients+with+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Genetic modification strategies to enhance CAR T cell persistence for patients with solid tumors.</a> Front Immunol. 10, 218(2019).</li>
<li>Fu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+techniques+for+enhancing+CAR+T+cell+therapy+against+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">Delivery techniques for enhancing CAR T cell therapy against solid tumors.</a> Advanced Functional Materials. 31 (44), 2009489(2021).</li>
<li>Johnson, A., Townsend, M., O'Neill, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+microenvironment+immunosuppression%3A+A+roadblock+to+CAR+T-cell+advancement+in+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Tumor microenvironment immunosuppression: A roadblock to CAR T-cell advancement in solid tumors.</a> Cells. 11 (22), 3626(2022).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunosuppression+in+tumor+immune+microenvironment+and+its+optimization+from+CAR-T+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Immunosuppression in tumor immune microenvironment and its optimization from CAR-T cell therapy.</a> Theranostics. 12 (14), 6273-6290 (2022).</li>
<li>Luo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulating+tumor+physical+microenvironment+for+fueling+CAR-T+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Modulating tumor physical microenvironment for fueling CAR-T cell therapy.</a> Adv Drug Deliv Rev. 185, 114301(2022).</li>
<li>Martinez, M., Moon, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR+T+cells+for+solid+tumors%3A+New+strategies+for+finding%2C+infiltrating%2C+and+surviving+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">CAR T cells for solid tumors: New strategies for finding, infiltrating, and surviving in the tumor microenvironment.</a> Front Immunol. 10, 128(2019).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunosuppressive+microenvironment+and+immunotherapy+in+human+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">The immunosuppressive microenvironment and immunotherapy in human glioblastoma.</a> Front Immunol. 13, 1003651(2022).</li>
<li>Tie, Y., Tang, F., Wei, Y. Q., Wei, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunosuppressive+cells+in+cancer%3A+Mechanisms+and+potential+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Immunosuppressive cells in cancer: Mechanisms and potential therapeutic targets.</a> J Hematol Oncol. 15 (1), 61(2022).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+CAR+T+cells+for+enhanced+efficacy+and+safety%5BTitle%5D)+AND+%22APL+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Engineering CAR T cells for enhanced efficacy and safety.</a> APL Bioeng. 6 (1), 011502(2022).</li>
<li>Al-Haideri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cell+combination+therapy%3A+The+next+revolution+in+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+Int%22%5BJournal%5D)">cell combination therapy: The next revolution in cancer treatment.</a> Cancer Cell Int. 22 (1), 365(2022).</li>
<li>Fuca, G., Reppel, L., Landoni, E., Savoldo, B., Dotti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+chimeric+antigen+receptor+T-cell+efficacy+in+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Enhancing chimeric antigen receptor T-cell efficacy in solid tumors.</a> Clin Cancer Res. 26 (11), 2444-2451 (2020).</li>
<li>Neelapu, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+-+assessment+and+management+of+toxicities%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T-cell therapy - assessment and management of toxicities.</a> Nat Rev Clin Oncol. 15 (1), 47-62 (2018).</li>
<li>Mi, J., Ye, Q., Min, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+nanotechnology+development+to+overcome+current+roadblocks+in+CAR-T+therapy+for+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Advances in nanotechnology development to overcome current roadblocks in CAR-T therapy for solid tumors.</a> Front Immunol. 13, 849759(2022).</li>
<li>Sterner, R. C., Sterner, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR-T+cell+therapy%3A+Current+limitations+and+potential+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cancer+J%22%5BJournal%5D)">CAR-T cell therapy: Current limitations and potential strategies.</a> Blood Cancer J. 11 (4), 69(2021).</li>
<li>Yu, S., Yi, M., Qin, S., Wu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+generation+chimeric+antigen+receptor+T+cells%3A+Safety+strategies+to+overcome+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Next generation chimeric antigen receptor T cells: Safety strategies to overcome toxicity.</a> Mol Cancer. 18 (1), 125(2019).</li>
<li>Dana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR-T+cells%3A+Early+successes+in+blood+cancer+and+challenges+in+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharm+Sin+B%22%5BJournal%5D)">CAR-T cells: Early successes in blood cancer and challenges in solid tumors.</a> Acta Pharm Sin B. 11 (5), 1129-1147 (2021).</li>
<li>Van Der Schans, J. J., Van De Donk, N., Mutis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+targeting+to+overcome+current+challenges+in+multiple+myeloma+CAR+T-cell+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Dual targeting to overcome current challenges in multiple myeloma CAR T-cell treatment.</a> Front Oncol. 10, 1362(2020).</li>
<li>Andrea, A. E., Chiron, A., Bessoles, S., Hacein-Bey-Abina, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+next-generation+car-t+cells+for+better+toxicity+management%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Engineering next-generation car-t cells for better toxicity management.</a> Int J Mol Sci. 21 (22), 8620(2020).</li>
<li>Flugel, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+on-target%2C+off-tumour+toxicity+of+CAR+T+cell+therapy+for+solid+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Overcoming on-target, off-tumour toxicity of CAR T cell therapy for solid tumours.</a> Nat Rev Clin Oncol. 20 (1), 49-62 (2023).</li>
<li>Rababah, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T+cells+therapy+in+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transl+Oncol%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T cells therapy in solid tumors.</a> Clin Transl Oncol. 25 (8), 2279-2296 (2023).</li>
<li>Masoud, G. N., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hif-1alpha+pathway%3A+Role%2C+regulation+and+intervention+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharm+Sin+B%22%5BJournal%5D)">Hif-1alpha pathway: Role, regulation and intervention for cancer therapy.</a> Acta Pharm Sin B. 5 (5), 378-389 (2015).</li>
<li>Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+hif-1+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting hif-1 for cancer therapy.</a> Nat Rev Cancer. 3 (10), 721-732 (2003).</li>
<li>Harris, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia--a+key+regulatory+factor+in+tumour+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Hypoxia--a key regulatory factor in tumour growth.</a> Nat Rev Cancer. 2 (1), 38-47 (2002).</li>
<li>Juillerat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+oxygen+sensitive+self-decision+making+engineered+CAR+T-cell%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">An oxygen sensitive self-decision making engineered CAR T-cell.</a> Sci Rep. 7, 39833(2017).</li>
<li>Liao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+T+cells+with+hypoxia-inducible+chimeric+antigen+receptor+%28HiCAR%29+for+selective+tumor+killing%5BTitle%5D)+AND+%22Biomark+Res%22%5BJournal%5D)">Engineering T cells with hypoxia-inducible chimeric antigen receptor (HiCAR) for selective tumor killing.</a> Biomark Res. 8 (1), 56(2020).</li>
<li>Ivan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hif%CE%B1+targeted+for+vhl-mediated+destruction+by+proline+hydroxylation%3A+Implications+for+o2+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hifα targeted for vhl-mediated destruction by proline hydroxylation: Implications for o2 sensing.</a> Science. 292 (5516), 464-468 (2001).</li>
<li>Wang, G. L., Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+hypoxia-inducible+factor+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of hypoxia-inducible factor 1.</a> J Biol Chem. 270 (3), 1230-1237 (1995).</li>
<li>D'alonzo, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+noninvasive+preclinical+tumor+hypoxia+imaging+methods%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo noninvasive preclinical tumor hypoxia imaging methods: A review.</a> Int J Radiat Biol. 97 (5), 593-631 (2021).</li>
<li>He, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditioned+car-t+cells+by+hypoxia-inducible+transcription+amplification+%28hita%29+system+significantly+enhances+systemic+safety+and+retains+antitumor+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">Conditioned car-t cells by hypoxia-inducible transcription amplification (hita) system significantly enhances systemic safety and retains antitumor efficacy.</a> J Immunother Cancer. 9 (10), e002755(2021).</li>
<li>Barsoum, I. B., Smallwood, C. A., Siemens, D. R., Graham, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+of+hypoxia-mediated+escape+from+adaptive+immunity+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A mechanism of hypoxia-mediated escape from adaptive immunity in cancer cells.</a> Cancer Res. 74 (3), 665-674 (2014).</li>
<li>Kroemer, G., Pouyssegur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cell+metabolism%3A+Cancer%27s+achilles%27+heel%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor cell metabolism: Cancer's achilles' heel.</a> Cancer Cell. 13 (6), 472-482 (2008).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1.5mL 원심분리기 튜브</td><td>QSP</td><td>509-GRD-Q</td><td>상등액 및 세포 Cellection 프로토콜 단계 2,3,4</td></tr><tr><td>10% ExpressCast PAGE</td><td>NCM biotech</td><td>P2012</td><td>Immunoblotting 프로토콜 Step 3</td></tr><tr><td>10x</td><td>PBS NCM 생명공학</td><td>20220812</td><td>세포 배양 프로토콜 Step 4</td></tr><tr><td>10mL 피펫</td><td>Yueyibio</td><td>YB-25H</td><td>Pipetting 프로토콜 Step 1</td></tr>: <tr><td>10xTRIS-Glycine-SDS 전기영동 완충액</td><td>에피자임</td><td>3673020</td><td>Immunoblotting 프로토콜 Step 3</td></tr>: <tr><td>15mL 원심분리기 튜브</td><td>, Thermo Scientific</td><td>339650</td><td>상등액 및 세포 cellection 프로토콜 Step 1</td></tr>: <tr><td>25cm2 EasYFlask</td><td>Thermo Scientific</td><td>156367</td><td>세포 배양 프로토콜 Step 3,4</td></tr><tr><td>4x 단백질 SDS 페이지 로딩 버퍼</td><td>Takara</td><td>9173</td><td>Immunoblotting 프로토콜 Step 3</td></tr><tr><td>6웰 평면 조직 배양 플레이트</td><td>Thermo Scientific</td><td>140675</td><td>T 세포 배양 프로토콜 Step 1</td></tr><tr><td>96웰 검은색 평면 바닥 조직 배양 플레이트</td><td>Greiner</td><td>655090</td><td>세포 독성 분석 프로토콜 Step 4</td></tr><tr><td>96웰 ELISA 플레이트</td><td>Corning</td><td>3590</td><td>ELISA 프로토콜 단계 5</td></tr>: <tr><td>96웰 플레이트 쉐이커</td>, <td>QILINBEIER</td><td>MH-2</td><td>쉐이크 프로토콜 단계 4</td></tr>: <tr><td>96웰 U-하단 조직 배양 플레이트</td><td>: Thermo Scientific</td><td>268200</td><td>상층액 cellection 프로토콜 단계 4,5</td></tr>: <tr><td>항-FLAG 항체</td><td>Sigma</td><td>F1804-50UG</td><td>Immunoblotting 프로토콜 3단계</td></tr>: <tr><td>카르비놀</td><td>Sinopharm</td><td>10010061</td><td>Immunoblotting 프로토콜 Step 3</td></tr><tr><td>이산화탄소 인큐베이터</td><td>Thermo Scientific</td><td>360</td><td>세포 배양 프로토콜 Step 1,2,3,4</td></tr><tr><td>세포 계수판</td><td>Hausser Scientific</td><td>1492</td><td>세포 계수 프로토콜 Step 1,3,4</td></tr><tr><td>CELLection Pan Mouse IgG Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>11531D</td><td>Mouse IgG magnetic beads 프로토콜 Step 1</td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002432</td><td>세포 배양 프로토콜 Step 1,3,4</td></tr><tr><td>Chemiluminescence gel imaging system</td><td>BIO-RAD</td><td>12003154</td><td>Immunoblotting 프로토콜 Step 3</td></tr><tr><td>Cobalt chloride solution (0.5 M)</td><td>bioleaper</td><td>BR4000203</td><td>저산소 상태 프로토콜 Step 2,3,4</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-103- CV</td><td>세포 배양 프로토콜 단계 4</td></tr><tr><td>전자 저울</td><td>Sartorius</td><td>PRACTUM612-1CN</td><td>무게 프로토콜 단계 5</td></tr><tr><td>FBS</td><td>BI</td><td>04-001-1ACS</td><td>세포 배양 프로토콜 단계 3,4</td></tr><tr><td>GAPDH 마우스 mAb</td><td>ABclonal</td><td>AC002</td><td>면역 블로팅 프로토콜 단계 3</td></tr><tr><td>겔 전기 영동 장치</td><td>BIO-RAD</td><td>1645070</td><td>Immunoblotting 프로토콜 단계 3</td></tr><tr><td>GloMax Microplate Readers</td><td>Promega</td><td>GM3000</td><td>루시페라제 활성 측정 프로토콜 단계 4</td></tr><tr><td>염소 항-마우스 IgG (H+L)</td><td>Yeasen</td><td>P1126151</td><td>면역 블로팅 프로토콜 단계 3</td></tr><tr><td>고속 마이크로프리징 원심분리기</td><td>eppendorf</td><td>5810&nbsp; R</td><td>세포 배양 프로토콜 단계 1</td></tr><tr><td>인간 IFN-&감마; ELISA 세트</td><td>BD</td><td>555142</td><td>ELISA 프로토콜 단계 5 항목: 재조합 인간 IFN-&감마; 동결 건조 표준, 검출 항체 비오틴 안티 인간 IFN-&감마; , 캡처 항체 정제 항 인간 IFN-&감마;, 효소 시약 Streptavidin-horseradish peroxidase conjugate (SAv-HRP)</td></tr> <tr><td>Human IL-2 ELISA Set</td><td>BD</td><td>555190</td><td>ELISA 프로토콜 단계 5 항목 : 재조합 인간 IL-2 동결 건조 표준, 검출 항체 비오틴 항 인간 IL-2 , 캡처 항체 정제 항 인간 IL-2, 효소 시약 Streptavidin-horseradish peroxidase conjugate (SAv-HRP)</td></tr> <tr><td>IL-15</td><td>R& D 시스템</td><td>P40933</td><td>T 세포 배양 프로토콜 단계</td></tr><tr><td>1 IL-21</td><td>노보단백질</td><td>GMP-CC45</td><td>T 세포 배양 프로토콜 1단계</td></tr><tr><td>IL-7</td><td>R& D 시스템</td><td>P13232</td><td>T 세포 배양 프로토콜 단계 1</td></tr><tr><td>도립 현미경</td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td>세포 배양 프로토콜 단계 1,3,4</td></tr><tr><td>Jurkat</td><td></td><td>ATCC TIB-152</td><td>CAR-Jurkat 구성 프로토콜 3단계</td></tr><tr><td>LSRFortessa</td><td>BD</td><td>LSRFortessa</td><td>유세포 분석 프로토콜 2단계</td></tr><tr><td>루시페라제 분석 시스템</td><td>Promega</td><td>E1501</td><td>루시페라제 리포터 분석 프로토콜 단계 4 항목: 수동 용해 버퍼, 반딧불이 루시페라제 기판</td></tr><tr><td>마이크로플레이트 리더</td><td>BioTek</td><td>HTX</td><td>ELISA 프로토콜 단계 5</td></tr><tr><td>모바일 CO2/O2/N2 인큐베이터 챔버</td><td>China Innovation Instrument Co., 주식 회사.</td><td>Smartor118</td><td>저산소 상태 프로토콜 단계 2, 3, 4</td></tr><tr><td>마우스 안티 헥사 히스티딘 태그</td><td>시그마</td><td>SAB2702218</td><td>면역 블로팅 프로토콜 3단계</td></tr><tr><td>NcmBlot Rapid Transfer Buffer</td><td>NCM 생명공학</td><td>WB4600</td><td>면역 블로팅</td></tr><tr><td>NcmECL 울트라</td><td>NCM 생명공학</td><td>P10300</td><td>면역블로팅 프로토콜 단계 3 항목: NcmECL 울트라 루미놀/인핸서 시약(A), NcmECL 울트라 안정화 과산화물 시약(B)&nbsp;</td></tr><tr><td>NovoNectin 코팅 48웰 평판</td><td>Novoprotein</td><td>GMP-CH38</td><td>CAR-T 세포 구조 프로토콜 단계 1</td></tr><tr><td>OPD(o-phenylenediamine dihydrochloride) 정제 세트</td><td>Sigma</td><td>P9187</td><td>기질 시약 프로토콜 단계 5 항목: OPD 정제(은박), 요소 과산화수소 정제(금박)</td></tr><tr><td>PE 접합 항-DYKDDDDK</td><td>Biolegend</td><td>637310</td><td>유세포 분석 프로토콜 단계 2</td></tr><tr><td>프로타민 설페이트</td><td>시그마</td><td>P3369-1OG</td><td>렌티바이러스 감염 프로토콜 단계 1</td></tr><tr><td>단백질 마커 10 Kda-250 KDa</td><td>에피자임</td><td>WJ102</td><td>면역블로팅 프로토콜 단계 3</td></tr><tr><td>&nbsp; Purifed NA/LE Mouse Anti-Human CD3</td><td>BD</td><td>566685</td><td>T Cells 배양 프로토콜 Step 1</td></tr><tr><td>정제된 NA/LE Mouse Anti-Human CD28</td><td>BD</td><td>555725</td><td>T 세포 배양 프로토콜 Step 1</td></tr><tr><td>PVDF membrane</td><td>Millipore</td><td>168627</td><td>Immunoblotting Protocol Step 3</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>10-040-CVRC</td><td>Cell culture Protocol Step 3</td></tr><tr><td>탈지 분유</td><td>Yeasen</td><td>S9129060</td><td>Immunoblotting 프로토콜 단계 3</td></tr><tr><td>SKOV3-Luc</td><td>ATCC</td><td>HTB-77</td><td>세포 독성 분석 프로토콜 단계 4</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>NCM 생명공학</td><td>C125C1</td><td>세포 배양 프로토콜 단계 4</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sinopharm</td><td>30189328</td><td>Immunoblotting 프로토콜 단계 3</td></tr><tr><td>수조</td><td>keelrein</td><td>NB014467</td><td>Heating 프로토콜 단계 1</td></tr><tr><td>X-VIVO 15&nbsp;</td><td>LONZA</td><td>04-418Q</td><td>무혈청 림프구 배양 배지 프로토콜 Step 1</td></tr></tbody></table>

저산소증 민감성 키메라 항원 수용체-t 세포의 생성 및 기능 검증

Generation and Functional Verification of Hypoxia-Sensitive Chimeric Antigen Receptor-T Cells

HIF-1α의 ODD 도메인을 CAR 부분에 융합하는 것은 저산소증에 민감한 CAR을 생성하기 위한 주요 전략입니다. 이 연구에서 분석된 저산소증 민감성 HER2 표적 CAR인 HER2-BBz-ODD는 ODD 염기서열을 기존 HER2-BBz에 통합하여 이 전략을 사용하여 구성되었습니다(그림 1A). 이 연구에서는 렌티바이러스 형질도입을 사용하여 HER2-BBz-ODD CAR 또는 HER2-BBz CAR을 발현한 후 인간 PBMC와 Jurkat T 세포의 두 가지 세포 유형에서 산소 민감도를 조사했습니다.
첫 번째 검사는 저산소 조건과 정상 산소 조건에서의 CAR 발현으로, 유세포 분석에 의한 CAR 형질도입 PBMC 유래 T 세포와 웨스턴 블로팅에 의한 CAR 형질도입 Jurkat T 세포 모두에서 수행되었습니다. CAR 형질도입된 PBMC 유래 T 세포의 설정에서, HER2-BBz-ODD CAR은 CAR 양성 세포의 비율과 형광 강도(MFI) 중앙값 모두에서 21%O2 미만보다 1%O2 미만에서 유의하게 더 많이 발현되는 것을 관찰했다(그림 1B). CAR-transduced Jurkat T 세포의 면역블로팅 분석에서도 HER2-BBz-ODD의 저산소증 의존성 유도가 확인되었습니다.
이러한 맥락에서 저산소증의 화학적 유도제인 CoCl2를 배양 배지에 첨가하여 저산소 상태를 편리하게 모방할 수 있다는 점은 주목할 가치가 있습니다. 그림 1C에서 볼 수 있듯이, 당사의 면역블로팅 결과는 50 또는 200 μM CoCl2에 대한 노출이 1%O2에 대한 노출의효과를 재현하여 HER2-BBz-ODD CAR의 발현을 현저하게 유도하지만 HER2-BBz CAR의 발현을 유도하지는 않음을 보여주었습니다. 저산소증 민감성 CAR의 기능적 특성 분석은 PBMC 유래 CAR-T 세포로 수행되었습니다. 이 연구에서는 반딧불이 루시페라아제 운반 SKOV-3 세포주를 표적 세포주로 활용했습니다. 이 설정을 통해 공동 배양된 CAR-T 세포에 의해 매개되는 세포 독성을 평가하기 위한 대리물로서 표적 세포 관련 루시페라아제 활성을 측정할 수 있었습니다.
그림 1D에서 볼 수 있듯이 측정 결과 HER2-BBz CAR-T 세포는 대기가 정상산소 상태인지 저산소 상태인지에 관계없이 표적 세포를 효과적으로 죽이는 것으로 나타났습니다. 대조적으로, HER2-BBz-ODD CAR-T 세포는 조사된 세 가지 E:T 비율 모두에 대해 정상 산소 조건에서 훨씬 약한 세포 독성을 나타냈습니다. 그러나, 그들의 cytotoxicity는 저산소 상태에 드러낼 때 두드러지게 강화되었습니다. IL-2 및 IFN-γ의 상층액 수준은 CAR-T 세포와 표적 세포를 24시간 동안 공동 배양한 후 ELISA로 측정했습니다. 두 사이토카인 모두에 대해 HER2-BBz-ODD CAR-T 세포에서 21%O2에 비해 1%O2 미만에서 더 높은 분비가 관찰되었으며, 이는 세포독성 데이터와 일치합니다. 대조적으로, HER2-BBz CAR-T 세포는 21%O2에 비해 1%O2 미만으로 두 사이토카인의 분비가 더 낮았으며, 이는 저산소증이 세포 활성에 부정적인 영향을 미친다는 것을 나타냅니다(그림 1E). 이러한 결과를 종합해 볼 때, HER2-BBz-ODD CAR의 저산소증 민감성을 설득력 있게 입증했습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66697/66697fig01.jpg"> 그림 1: 저산소증에 민감한 CAR-T 세포의 구성 및 특성화. (A) 저산소증에 민감한 CAR HER2-BBz-ODD 및 기존 대응 제품인 HER2-BBz의 설계를 개략적으로 나타낸 것입니다. 두 CAR 모두 N-말단 CD8α 신호 펩타이드, FLAG 태그, 인간 HER2 표적 scFv, CD8 힌지 및 막관통 도메인, 4-1BB의 costimulatory domain, CD3ξ signaling domain, IRES 및 EGFP로 구성된 세포 내 부분으로 구성됩니다. HER2-BBz-ODD는 ODD 도메인을 CD3ξ 신호 도메인의 C-말단에 융합한다는 점에서 HER2-BBz와 다르며, 정상 상태에서 유비퀴틴 의존적 분해를 촉진하여 저산소 의존적 발현을 허용합니다. (나,씨) HER2-BBz-ODD CAR의 산소 의존성 발현 평가. (B) 유세포분석을 사용하여 24시간, 48시간 또는 72시간 동안 1% 또는 21%O2 미만으로 배양한 후 인간 PBMC 유래 CAR-T 세포로 한 가지 평가를 수행했습니다. (C) 다른 평가는 CAR-transduced Jurkat T cell을 사용한 것으로, 21%O2, 50 또는 200 μM CoCl2 또는 1%O2 미만으로 배양한 후 24시간 후에 세포 용해물을 수확하고 HER2-BBz CAR-transducted 세포를 대조군으로 포함하여 western blotting을 사용하여 CAR 발현을 분석했습니다. (D,E) 다양한 산소 조건에서 CAR-T 세포의 시험관 내 세포 독성 및 사이토카인 분비. (D) CAR-T 세포는 1% 또는 21% O2 미만의 표시된 E:T 비율로 반딧불 루시페라아제 발현 SKOV3 세포와 공동 배양하였다. 24시간의 공동 배양 후, 비형질도입된 T 세포와 비교하여 세포 관련 반딧불이 루시페라아제 활성의 변화를 측정하여 표적 세포 사멸 효율을 측정했습니다. (E) 분비된 IL-2 및 IFN-γ의 검출을 위해 상층액을 수집하였다. 결과는 평균 ± SEM(n = 건강한 기증자 3명)(****p &lt; 0.0001)으로 표시됩니다. 약어: scFv = 단일 사슬 단편 변수; CAR = 키메라 항원 수용체. 패널 C와 D는 Liao et al.31에서 발췌한 것입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66697/66697fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

저산소증 민감성 키메라 항원 수용체-T 세포의 생성 및 기능 검증

Extensive studies have proven the promise of chimeric antigen receptor T (CAR-T) cell therapy in treating hematological malignancies. However, treating ...

generation-functional-verification-hypoxia-sensitive-chimeric-antigen

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

이 비디오는 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포를 생체 외에서 제조하는 기술을 보여줍니다. 인간 T 세포는 인터루킨-2(IL-2)가 보충된 배지와 함께 항-CD3 및 항-CD28 항체로 코팅된 자기 비드로 배양되어 T 세포의 활성화 및 증식을 유도합니다. 형질전환 렌티바이러스 벡터가 도입되어 형질전환 RNA가 숙주 게놈에 통합되고 전이유전자를 발현할 수 있습니다. 그 결과 형질도입된 T 세포가 표면에서 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현합니다. T 세포는 CAR 발현 및 동결 보존을 평가하기 위해 정의된 시점에 수확됩니다.

키메라 항원 수용체 T 세포를 제조하기 위한 생체 외 기술

이 비디오는 종양 항원 특이적 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포의 생체 외 생성 기술을 보여줍니다. 형질전환 RNA를 운반하는 레트로바이러스 벡터는 인터루킨-2가 보충된 배지에서 비장 세포와 혼합되어 T 세포의 생존과 증식을 촉진합니다. 그런 다음 혼합물을 재조합 인간 피브로넥틴 단편으로 코팅된 플레이트로 옮기고 원심분리하여 바이러스와 세포의 융합을 촉진함으로써 RNA가 숙주 게놈에 통합되고 종양 항원을 표적으로 하는 표면 결합 CAR을 생산할 수 있도록 합니다.

종양 특이적 키메라 항원 수용체 T 세포를 생성하기 위한 생체 외 기술

우리는 액체 및 고체 종양 세포를 표적으로 하는 키메라 항원 수용체 T 세포의 효능을 평가하기 위해 시험관내 세포분석 시스템을 정량적으로 실시간으로 기술한다. 이 프로토콜은 다른 면역 이펙터 세포뿐만 아니라 조합 치료를 평가하기 위해 확장 될 수있다.

고체 및 혈액암 세포를 표적으로 하는 키메라 항원 수용체 T 세포를 위한 실시간 힘 분석

이 프로토콜은 임상적으로 이용가능한 플랫폼으로 생체내에서 키메라 항원 수용체를 발현하도록 유전적으로 조작된 T 세포를 비침습적으로 추적하는 방법론을 기술한다.

키메라 항원 수용체 T 세포의 동적 이미징 [18F]테트라플루오로보레이트 양전자 방출 단층 촬영/컴퓨터 단층 촬영

이 프로토콜은 관심 유전자를 가진 일차 인간 T 세포를 형질도입하는 과정을 간략하게 설명하여 GMP(Good Manufacturing Practice) 표준과의 호환성을 보장합니다.

유전자 변형 T 세포 생성을 위한 GMP 준수 절차

이 기사에서는 임상용 키메라 항원 수용체 T 세포의 제조 공정, 특히 T 세포의 바이러스 transduction 및 배양을 수행할 수 있는 자동 세포 프로세서를 사용하는 공정에 대해 자세히 설명합니다. 우리는 권장 사항을 제공하고 초기 단계 임상 시험의 프로세스 개발 및 구현 중에 고려해야 할 함정을 설명합니다.

자동화된 세포 프로세서에서 키메라 항원 수용체 T 세포 제조

이 프로토콜은 레트로바이러스 벡터 생산과 쥐 T 세포 transduction을 간소화하여 마우스 CAR-T 세포의 효율적인 생성을 촉진합니다.

Murine Chimeric Antigen Receptor (CAR)-T cell의 효율적인 생성

이 프로토콜은 인간 키메라 항원 수용체 조절 T 세포(CAR Tregs)를 생성하고 테스트하기 위한 간소화된 워크플로우를 제공합니다.

인간 키메라 항원 수용체 조절 T 세포의 생성

이 프로토콜은 암 면역 요법을 위한 비통합 mRNA를 사용하여 일시적 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포를 생성하는 자세한 절차를 설명하고 CAR-T 세포 및 세포 독성 기능을 평가하기 위한 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다.

암 면역 요법을 위해 mRNA를 사용하여 일시적인 키메라 항원 수용체 T 세포를 생성하는 비바이러스 접근법

이수성 게놈 불안정성, 결국 복잡 한 karyotypes 셀 세포 주기 검거를 이끌어 낸다. 이 문서 분할 중단 복잡 한 karyotypes aneuploid 셀을 간단 하 고 편리한 방법을 제공 합니다.

생성 및 복잡 한 Karyotypes 셀 세포 주기 검거의 절연

배우세요 저산소증 민감성 CAR-T 세포의 렌티바이러스 기반 생성 및 기능 검증 방법을. 이 프로토콜은 종양 미세환경에서 선택적 세포독성을 연구하는 연구자들에게 도움이 됩니다.

저산소증 민감성 키메라 항원 수용체-T 세포의 생성 및 기능 검증

더 많은 동영상 탐색