Name: Premixed and Freeze-dryed Reagents를 사용한 현장 진단 CRISPR 기반 진단 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-16T12:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: 학습하세요 동일온도 핵산 증폭과 CRISPR 기반 검출을 활용한 감염병 현장 진단 방법을. 동결건조된 프리믹스 시약을 사용하여 오염 위험을 줄이고 높은 민감도로 병원체를 신속하게 검출할 수 있습니다.

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<meta charset="utf8"></head><body>현장 진료(point-of-care) 사용을 위해 최적화된 CRISPR 기반 분자 진단 프로토콜

<ol><li>Gootenberg, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+detection+with+CRISPR-Cas13a%2FC2c2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2.</a> Science. 356 (6336), 438-442 (2017).</li>
<li>Kaminski, M. M., Abudayyeh, O. O., Gootenberg, J. S., Zhang, F., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-based+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">CRISPR-based diagnostics.</a> Nat Biomed Eng. 5 (7), 643-656 (2021).</li>
<li>Makarova, K. S., Koonin, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annotation+and+classification+of+CRISPR-Cas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Annotation and classification of CRISPR-Cas systems.</a> Methods Mol Biol. (1311), 47-75 (2015).</li>
<li>Chen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas12a+target+binding+unleashes+indiscriminate+single-stranded+DNase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity.</a> Science. 360 (6387), 436-439 (2018).</li>
<li>Arizti-Sanz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+Cas13-based+assays+for+the+fast+identification+of+SARS-CoV-2+and+its+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Simplified Cas13-based assays for the fast identification of SARS-CoV-2 and its variants.</a> Nat Biomed Eng. 6 (8), 932-943 (2022).</li>
<li>Broughton, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas12-based+detection+of+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas12-based detection of SARS-CoV-2.</a> Nat Biotechnol. 38 (7), 870-874 (2020).</li>
<li>Patchsung, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiplexed+Cas13-based+assay+with+point-of-care+attributes+for+simultaneous+COVID-19+diagnosis+and+variant+surveillance%5BTitle%5D)+AND+%22CRISPR+J%22%5BJournal%5D)">A multiplexed Cas13-based assay with point-of-care attributes for simultaneous COVID-19 diagnosis and variant surveillance.</a> CRISPR J. 6 (2), 99-115 (2023).</li>
<li>Patchsung, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+validation+of+a+Cas13-based+assay+for+the+detection+of+SARS-CoV-2+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Clinical validation of a Cas13-based assay for the detection of SARS-CoV-2 RNA.</a> Nat Biomed Eng. 4 (12), 1140-1149 (2020).</li>
<li>Gootenberg, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+and+portable+nucleic+acid+detection+platform+with+Cas13%2C+Cas12a%2C+and+Csm6%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6.</a> Science. 360 (6387), 439-444 (2018).</li>
<li>Lee, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+CRISPR-based+diagnostic+for+field-applicable+detection+of+Plasmodium+species+in+symptomatic+and+asymptomatic+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive CRISPR-based diagnostic for field-applicable detection of Plasmodium species in symptomatic and asymptomatic malaria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (41), 25722-25731 (2020).</li>
<li>Myhrvold, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field-deployable+viral+diagnostics+using+CRISPR-Cas13%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Field-deployable viral diagnostics using CRISPR-Cas13.</a> Science. 360 (6387), 444-448 (2018).</li>
<li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+detection+with+CRISPR%2FCas+system+from+applications+to+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Analyt+Chem%22%5BJournal%5D)">Versatile detection with CRISPR/Cas system from applications to challenges.</a> Trends Analyt Chem. 135, 116150(2021).</li>
<li>Yao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas13a-based+detection+for+bovine+viral+diarrhea+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Vet+Sci%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas13a-based detection for bovine viral diarrhea virus.</a> Front Vet Sci. 8, 603919(2021).</li>
<li>Kellner, M. J., Koob, J. G., Gootenberg, J. S., Abudayyeh, O. O., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHERLOCK%3A+nucleic+acid+detection+with+CRISPR+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">SHERLOCK: nucleic acid detection with CRISPR nucleases.</a> Nat Protoc. 14 (10), 2986-3012 (2019).</li>
<li>Selvam, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RT-LAMP+CRISPR-Cas12%2F13-based+SARS-CoV-2+detection+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostics+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">RT-LAMP CRISPR-Cas12/13-based SARS-CoV-2 detection methods.</a> Diagnostics (Basel). 11 (9), 1646(2021).</li>
<li>Carter, C., Akrami, K., Hall, D., Smith, D., Aronoff-Spencer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lyophilized+visually+readable+loop-mediated+isothermal+reverse+transcriptase+nucleic+acid+amplification+test+for+detection+Ebola+Zaire+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Lyophilized visually readable loop-mediated isothermal reverse transcriptase nucleic acid amplification test for detection Ebola Zaire RNA.</a> J Virol Methods. 244, 32-38 (2017).</li>
<li>Bhardwaj, P., Kant, R., Behera, S. P., Dwivedi, G. R., Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+diagnostic+with+CRISPR%2FCas%3A+Beyond+nucleic+acid+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Next-generation diagnostic with CRISPR/Cas: Beyond nucleic acid detection.</a> Int J Mol Sci. 23 (11), 6052(2022).</li>
<li>Twistamp. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Twistamp%C2%AE+assay+design+manual%22">Twistamp® assay design manual</a>. , (2023).</li>
<li>Qian, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enhanced+isothermal+amplification+assay+for+viral+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">An enhanced isothermal amplification assay for viral detection.</a> Nat Commun. 11 (1), 5920(2020).</li>
<li>Ghouneimy, A., Mahas, A., Marsic, T., Aman, R., Mahfouz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-based+diagnostics%3A+Challenges+and+toward+point-of-care+applications%5BTitle%5D)+AND+%22ACSSynth+Biol%22%5BJournal%5D)">CRISPR-based diagnostics: Challenges and toward point-of-care applications.</a> ACSSynth Biol. 12 (1), 1-16 (2023).</li>
<li>Jones, K. L., Drane, D., Gowans, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+storage+of+DNA-free+RNA+for+use+in+vaccine+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Long-term storage of DNA-free RNA for use in vaccine studies.</a> Biotechniques. 43 (5), 675-681 (2007).</li>
<li>Fang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+strand-displacement+DNA+amplification+by+a+contactless+electrochemical+microsystem+using+interdigitated+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of strand-displacement DNA amplification by a contactless electrochemical microsystem using interdigitated electrodes.</a> Lab Chip. 12 (17), 3190-3196 (2012).</li>
<li>Mok, E., Wee, E., Wang, Y., Trau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+evaluation+of+molecular+enhancers+of+the+isothermal+exponential+amplification+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Comprehensive evaluation of molecular enhancers of the isothermal exponential amplification reaction.</a> Sci Rep. 6 (1), 37837(2016).</li>
<li>Wan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+test+kit+for+visual+loop-mediated+isothermal+amplification+of+Salmonella+in+spiked+ready-to-eat+fruits+and+vegetables%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of a test kit for visual loop-mediated isothermal amplification of Salmonella in spiked ready-to-eat fruits and vegetables.</a> J Microbiol Methods. 169, 105830(2020).</li>
<li>Curti, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+lyophilized+CRISPR-Cas12+assay+for+a+ensitive%2C+specific%2C+and+rapid+detection+of+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a lyophilized CRISPR-Cas12 assay for a ensitive, specific, and rapid detection of SARS-CoV-2.</a> Viruses. 13 (3), 420(2021).</li>
<li>Joung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+SARS-CoV-2+with+SHERLOCK+one-pot+testing%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Detection of SARS-CoV-2 with SHERLOCK one-pot testing.</a> N Engl J Med. 383 (15), 1492-1494 (2020).</li>
</ol>

핵산 바이오마커 검출을 위한 CRISPR 기반 진단은 2017년 1,2,3,4에 처음 보고되었으며, 그 이후 여러 국가에서 특히 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2) RNA 검출을 위한 식품의약국(FDA) 승인 테스트를 통해 차세대 진단으로 입증되었습니다 5,6,7,8 . 코로나바이러스감염증-19(COVID-19)를 넘어 다양한 바이러스 및 박테리아 9,10,11,12,13, 유전성 질환 돌연변이 및 결실을 감지하는 데 효과적인 것으로 입증되었으며, 단백질 및 소분자 바이오마커 2,12를 감지하도록 엔지니어링할 수 있습니다. CRISPR 기반 진단은 종종 재조합 효소 중합효소 증폭(RPA) 또는 루프 매개 등온 증폭(LAMP)14,15과 같은 등온 증폭 방법을 RNA 유도 CRISPR 연관(Cas) 효소를 사용하는 CRISPR 기반 검출과 표적 인식 후 "부수적" 엔도뉴클레아제 활성을 결합합니다3. 등온 증폭과 CRISPR 기반 검출의 이중 사용은 기술에 몇 가지 바람직한 속성, 특히 골드 스탠다드 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 근접하는 높은 진단 정확도와 단일 뉴클레오티드 다형성 1,9을 포함한 작은 염기서열 차이를 다중화 및 검출할 수 있는 기능을 제공합니다.
그러나 CRISPR 기반 진단의 가장 정확한 버전에는 여러 구성 요소와 단계가 포함되어 있으며 비전문가 또는 현장 진료(POC)에서 수행하기가 복잡할 수 있습니다. 매우 정확한 CRISPR 기반 진단의 사용을 POC 설정으로 확장하는 이러한 문제를 해결하기 위해 당사는 사용하기 쉽고 저장이 용이한 premixed, 동결건조, 재조합 효소 기반 등온 증폭 및 CRISPR 기반 검출 반응을 준비하기 위한 프로토콜을 개발했습니다7. 이러한 프로토콜은 CRISPR기반 진단(CRISPR-based diagnostics)14에 필요한 생화학적 성분의 생산에 대한 추가 정보, 설계 가이드라인(design guidelines)1 및 대체 등온 증폭 기법(isothermal amplification techniques) 2,14,15,16 및 Cas 효소(Cas enzymes)12를 사용하는 제형에 대한 추가 정보를 포함하는 CRISPR 기반 진단법(CRISPR-based diagnostics)14에 대한 기존의 우수한 프로토콜(protocol)을 보완해야 한다. 궁극적으로, CRISPR 기반 진단이 휴대용 및 기기가 필요 없는 분석이 필요한 환경에서 빠르고 저렴하며 민감한 핵 검출을 실현하는 데 도움이 될 수 있기를 바랍니다 1,9,17.
우리는 주로 프로토콜에서 RPA와 Cas13 기반 탐지의 조합을 사용합니다. RPA는 주변 온도(37-42°C)에 가까운 온도에서 작동하므로 에너지 및 장비 요구 사항이 적습니다. 다른 등온 증폭 반응에는 더 높은 온도가 필요합니다(LAMP, 60-65°C, 가닥 변위 증폭(SDA), 60°C, 지수 증폭 반응(EXPAR), 55°C, 헬리카제 종속 증폭(HDA), 65°C)2. RPA 프라이머의 설계도 LAMP 프라이머와 달리 복잡하지 않으며 다중증폭 7,9,14로 확장할 수 있습니다. RPA로 두 개 이상의 대상을 다중화하는 것은 실제로 어렵지만, 간섭을 최소화하기 위해 다중화 RPA 프라이머를 설계하는 방법에 대한 명확한 지침이 있다18.
캐리오버 오염은 2단계 워크플로우에서 여전히 큰 문제로 남아 있지만, RPA에서 생성된 앰플리콘은 LAMP14의 대형 연결 앰플리콘에 비해 크기가 작고 캐리오버 오염을 일으킬 가능성이 적습니다. RPA 프라이머는 표준 가이드라인14에 따라 설계할 수 있으며, 일반적으로 뉴클레오티드 길이가 25-35이고 용융 온도는 54-67°C입니다. 앰플리콘 크기는 200 염기쌍보다 작아야 합니다. 역전사효소(RT)를 RPA에 첨가하여 RNA로부터 증폭을 가능하게 할 수 있으며, 역전사-RPA(RT-RPA)에서는 생성된 RNA(DNA hybrid)를 분해하고증폭 반응을 촉진하기 위해 일반적으로 다른 효소 Ribonuclease H(RNase H)를 소량으로 첨가합니다. Cas13 기반 검출을 위한 T7 전사를 허용하기 위해 T7 RNA 중합효소 프로모터를 전방 RPA 프라이머의 5' 말단에 배치할 수 있습니다.
RPA에서 앰플리콘을 생성한 후 crRNA 프로그래밍된 Cas 효소로 검출할 수 있습니다. 앰플리콘 검출에 사용할 수 있는 다양한 Cas 효소 중에서, 당사는 높은 절단 활성1 및 잘 특성화된 폴리뉴클레오티드 절단 선호도 7,9로 인해 RNA 표적화 Cas13 변이체를 선호하며, 후자는 다중 검출에 사용할 수 있습니다. Cas13에 대한 crRNA 염기서열은 spacer 및 direct repeat(DR) 염기서열을 사용하여 생산된 RNA의 표적 부위에 상보(역보체)하도록 설계되었습니다. crRNA 염기서열과 RPA 프라이머는 배경 및 위양성을 증가시키는 off-target 증폭 산물의 원치 않는 Cas 기반 검출을 피하기 위해 겹치지 않아야 합니다14.
Cas 기반 검출은 리포터 핵산 분자(Cas13 기반 반응의 경우 RNA 리포터)1,2,14의 절단을 모니터링하기 위해 다양한 검출 방식에 의존합니다. 다양한 검출 방식에는 비색계, 전기화학적 판독, 형광, 염기서열분석 판독 및 측면 플로우 스트립이 포함됩니다2. 우리는 단일 청색 LED 광원을 사용하여 효과적으로 여기시킬 수 있는 시아닌 5(Cy5), 로다민 X(ROX) 및 카르복시플루오레세인(FAM)과 같은 다양한 형광단 및 리포터를 고려한 형광 판독값과 마이크로플레이트 리더 또는 실시간 열 순환기 7,14로 분석한 형광 판독에 중점을 둡니다. 또한 형광 판독은 설정이 쉽고 지속적인 모니터링이 가능하여 실시간 정량 분석이 가능합니다. Cas 효소를 사용한 다중화 RPA 전증폭 및 다중화 Cas13 기반 검출은 여러 유전자 표적의 동시 검출을 위해 다색 형광 판독과 결합될 수 있습니다 2,7.
당사의 프로토콜에서는 먼저 RNA 샘플을 동결건조된 형태의 RT-RPA 시약에 추가하여 RT-RPA로 RNA를 등온 증폭합니다(그림 1). RT-RPA 동안, T7 프로모터는 생성된 이중 가닥 DNA 앰플리콘에 첨가됩니다. 그 후, RPA 제품은 T7 RNA 중합효소를 포함하는 동결건조된 Cas13 기반 검출로 전송됩니다. 이 검출 반응은 DNA 앰플리콘을 RNA(T7 RNA 중합효소를 통해)로 변환하며, 이는 crRNA 프로그래밍된 Cas13으로 쉽게 검출할 수 있습니다. 표적 활성화 Cas13은 리포터 분자를 절단하여 감지 가능한 형광 신호 2,7,14를 생성합니다. 여기의 프로토콜은 Leptotrichia wadei(LwaCas13a)에 의한 검출과 관련이 있지만, 직교 Cas13 및 Cas12 효소 7,9를 사용하여 최대 4개의 표적을 동시에 다중 검출하도록 확장할 수 있습니다. RPA 및 Cas 기반 검출 반응은 감도 손실이 있더라도 단일 튜브로 결합할 수 있습니다14.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66703/66703fig01v2.jpg"> 그림 1: CRISPR 기반 검출 워크플로우. 워크플로우는 두 개의 표적 유전자 검출을 보여줍니다. 첫째, DNA 타겟 내의 관심 영역은 RPA로 등온 증폭됩니다. RNA 표적을 검출할 때 역전사(RT-RPA)로 반응을 수행할 수 있습니다. 그 후, T7 전사는 dsDNA 앰플리콘을 RNA로 변환하고, 이는 다시 표적 결합 시 부수적 RNase 활성을 유도할 수 있는 Cas13-crRNA 복합체에 의해 인식됩니다. 소멸된 형광 리포터의 절단은 마이크로플레이트 리더를 사용하여 모니터링하거나, LED 투광 기기로 시각화하거나, 실시간 열 순환기와 함께 사용할 수 있는 형광 신호를 생성합니다. 약어: CRISPR = Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats; RT = 역전사; RPA = 재조합 효소 중합효소 증폭; Cas = CRISPR 관련 단백질; LED = 발광 다이오드. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66703/66703fig01largev2.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
여기에 제시된 프로토콜의 주요 특징은 동결건조를 위한 프리믹스 제형입니다. 프리믹싱은 반응 사용을 단순화하고 재현성을 향상시키지만, RPA 및 Cas 기반 검출 내의 많은 구성 요소, 특히 역전사 및 ATP와 같은 일부 불안정한 보조 인자는 용액에서 안정적이지 않습니다. 그러므로, 우리는 장기 저장을 위해 동결 건조될 수 있고 쉬운 수송 및 배치 1,9,20 할 수 있는 미리 혼합된 해결책을 공식화합니다. 또한 사전 혼합된 동결 건조 시약은 더 많은 샘플 부피(따라서 더 높은 DNA/RNA 입력)를 추가하여 반응을 재구성할 수 있으므로 검출 감도를 개선하는 데 도움이 됩니다10. 당사의 제형에서는 주로 trehalose21을 동결건조된 RPA 및 Cas 기반 검출 반응에서 동결 보호제로 사용합니다7. 시약 보존 외에도 트레할로스는 효소 안정화 16,22,23,24를 증가시키고 dsDNA23의 용융 온도를 감소시킴으로써 반응을 촉진합니다. 트레할로스 이외의 다른 안정제(5,7,21,25,26)를 탐색하면 다양한 사용 시나리오에 대해 훨씬 더 최적화된 제형을 얻을 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Betaine 해결책</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0300-1VL</td><td></td></tr><tr><td>DEPC-Treated water</td><td>Invitrogen</td><td>AM9915G</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Merck</td><td>3870-25GM</td><td></td></tr><tr><td>EpiScript reverse transcriptase</td><td>Lucigen</td><td>ERT12925K</td><td></td></tr><tr><td>Gly-Gly-Gly& 주의;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SIA-50239-1G</td><td></td></tr><tr><td>LwaCas13a</td><td>자체</td><td></td> 생산 <td>균주 이름 : Leptotrichia wadei, 약어 : Lwa, 단백질 이름 : LwaCas13a</td></tr><tr><td>염화 마그네슘 용액, 1M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028-10X1ML</td><td></td></tr><tr><td>NxGenT7 RNA 중합 효소</td><td>Lucigen</td><td>30223-2</td><td></td></tr><tr><td>폴리 (에틸렌 글리콜)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>81300-1KG</td><td></td></tr><tr><td>칼륨 아세테이트 용액, 5M</td><td>시그마-알드리치</td><td>95843-100ML-F</td><td></td></tr><tr><td>리오뉴클레오티드 용액 믹스</td><td>NEB</td><td>N0466L</td><td></td></tr><tr><td>RNase H</td><td>NEB</td><td>M0297L</td><td></td></tr><tr><td>자당</td><td>TCI</td><td>TCI-S0111-500G</td><td></td></tr><tr><td>트레할로스 이수화물</td><td>시그마-알드리치</td><td>SIA-90210-50G</td><td></td></tr><tr><td>트리즈마 염산염 용액, 1M, pH 7.4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2194-100ML</td><td></td></tr><tr><td>TwistAmp 기본 키트</td><td>TwistDx</td><td>TABAS03KIT</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BluPAD 듀얼 LED 블루/화이트 라이트 트랜스루미네이터</td><td>Bio-Helix</td><td>BP001CU</td><td></td></tr><tr><td>Dry Bath 듀얼 블록</td><td>ELITE</td><td>4-2-EL-02-220</td><td>모델: EL-02</td></tr><tr><td>형광 마이크로플레이트 </td><td>리더 Tecan</td><td>30050303</td><td>모델: Infinite 200 Pro</td></tr><tr><td>동결 건조기</td><td>LABCONCO</td><td>794001030</td><td>FreeZone Triad 벤치탑 동결 건조기</td></tr><tr><td>마이크로플레이트 384-well</td><td>Greiner</td><td>GDE0784076</td><td>F-Bottom, 소량, Hibase, Med. 바인딩, 블랙</td></tr><tr><td>실시간 열 순환기(CFX Connect Real-Time PCR 시스템)</td><td>Bio-Rad</td><td>185-5201</td><td>모델: CFX Connect 광학 모듈</td></tr><tr><td>Oligonucleotide</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>s-gene forward RPA 프라이머</td><td>IDT</td><td></td><td>GAAATTAATACGACTCAC TATAGGGAGGTTTCAAAC TTTACTTGCTTTACATAGA</td></tr><tr><td>s-유전자 리버스 RPA 프라이머</td><td>IDT</td><td></td><td>TCCTAGGTTGAAGA TAACCCACATAATAAG</td></tr><tr><td>n-유전자 포워드 RPA 프라이머</td><td>IDT</td><td></td><td>GAAATTAATACGACTC ACTATAGGAACTTCTC CTGCTAGAATGGCTG</td></tr><tr><td>n-유전자 역 RPA 프라이머</td><td>IDT</td><td></td><td>CAGACATTTTGCTCTC AAGCTGGTTCAATC</td></tr><tr><td>LwaCas13a-crRNA s 유전자</td><td>Synthego</td><td></td><td>GAUUUAGACUACCCCAAAAAC GAAGGGGACUAAAACGCAGCA CCAGCUGUCCAACCUGAAGAAG</td></tr><tr><td>LwaCas13a-crRNA n 유전자</td><td>Synthego</td><td></td><td>GAUUUAGACUACCCCAAAAACG AAGGGGCAQUAACAAAGCAAG AGCAGCAUCACCGCCAUUGC</td></tr><tr><td>FAM-polyU-IABkFQ reporter</td><td>IDT</td><td></td><td>56-FAM/rUrUrUrU/3IABkFQ</td></tr><tr><td>O-hannah_cytb_F RPA primer</td><td>IDT</td><td></td><td>GAAATTAATACGACTCACTA TAGGGTACGGATGAACCATA CAAAACCTTCACGCAATCG</td></tr><tr><td>O-hannah_cytb_R RPA primer</td><td>IDT</td><td></td><td>AAGATCCATAGTAGATTC CTCGTGCGATGTGGATA</td></tr><tr><td>synT7crRNA13a_ O_hannah&nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td>GCGCATCCATATTCTTCAT CTGCATTTAGTTTTAGTCC CCTTCGTTTTTGGGGTA GTCTAAATCCCCTATAGT GAGTCGTATTAATTTC</td></tr></tbody></table>

premixed and freeze-dryed reagents를 사용한 현장 진단 crispr 기반 진단

Point-of-care CRISPR-based Diagnostics with Premixed and Freeze-dried Reagents

SARS-CoV-2의 s 및 n 유전자의 결합 검출을 통한 FAM 형광 신호 생성의 역학과 이 정보가 동결건조된 사전 혼합 반응 제형을 위한 최적의 조건을 결정하는 데 어떻게 사용되었는지 강조합니다. 모든경우에 Ct값이 결정된 검출한계(LoD) 내에 있는 샘플(CT~31-33)과 LoD(CT~35-37)7 내에 있는 샘플과C-t가 있는 샘플을 포함하여 더 나은 감도로 프로토콜을 구별할 수 있도록 했습니다.
동결건조된 사전 혼합 RT-RPA의 경우, 사전 혼합 반응에 KOAc를 포함하면 반응 민감도에 부정적인 영향을 미치는 것으로 나타났습니다(그림 2A). 따라서 사전 혼합 반응에서 KOAc를 생략하고 RNA 샘플이 첨가된 후 반응 개시제인 Mg(OAc)2와 함께 첨가했습니다. 또한 동결 보호제 트레할로스의 최적 농도(그림 2B)와 동결건조된 RT-RPA 반응(그림 2C)에서 트리글리신7의 효과를 결정하기 위해 유사한 분석을 사용했습니다. 따라서, 최적의 동결건조, 사전 혼합된 RT-RPA 반응을 6% 트레할로스, KOAc가 없는 상태로 준비하고(그러나 RNA 샘플 후에 나중에 추가됨) 프로토콜 섹션 1에 설명된 대로 트리글리신을 보충했습니다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66703/66703fig02.jpg"> 그림 2: 동결건조되고 미리 혼합된 RT-RPA 반응 최적화. RT-RPA 반응은 SAR-CoV-2의 n 유전자를 타겟으로 하는 프라이머를 사용하여 제조하였다. Mg(OAc)2 는 모든 예비혼합 반응에서 제외되었습니다. 예비혼합 반응에 첨가된 (A) KOAc, (B) 트레할로스 및 (C) 트리글리신의 효과를 평가하였다. 생성된 FAM 형광을 통한 반응 모니터링은 실시간 열 순환기 또는 형광 마이크로플레이트 리더를 사용하여 수행되었습니다. 삼중 측정의 개별 데이터가 표시됩니다. 약어: RT = 역전사; RPA = 재조합 효소 중합효소 증폭; CRISPR = 군집, 규칙적, 간격적, 짧은 회문 반복; Cas = CRISPR 관련 단백질; SAR-CoV-2 = 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2; CT = 사이클 임계값; FAM = 카르복시플루오르세인. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66703/66703fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
동결건조된 사전 혼합된 Cas13a 기반 반응의 경우, 올바른 동결 보호제를 사용하는 것이 중요하다는 것을 확인했습니다: 6% 트레할로스 또는 2% 수크로스19 가 잘 작동한 반면, 1% 또는 5% w/v PEG20000에서 더 낮은 자당은 동결건조 후 반응 효율을 보존하지 못했습니다(그림 3). MgCl2 는 모든 반응에서 생략하고, 재수화 단계에서 첨가하였다. 최적의 동결건조된 Cas13 기반 검출 반응은 프로토콜 섹션 2에 나타난 바와 같이 6% 트레할로스로 제조하였다.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66703/66703fig03.jpg"> 그림 3: 동결건조되고 미리 혼합된 Cas13 기반 검출 반응 최적화. 검출 반응은 SARS-CoV-2 n 유전자의 RPA 산물을 사용하여 37°C에서 수행되었습니다. 테스트는 동결 건조 전후에 수행되었습니다. MgCl2는 모든 예비혼합 반응에서 제외되었다. (A) 트레할로스, (B) PEG20000 및 (C) 슈크로스가 동결건조 후 반응 효율을 보존하는 능력을 평가하였다. 생성된 FAM 형광을 통한 반응 모니터링은 실시간 열 순환기를 사용하여 수행되었습니다. "동결건조 후" 조건에 대한 삼중 측정의 개별 데이터와 "동결건조 전" 조건의 1회 반복 데이터가 표시됩니다. 그림 3A,B는 Patchsung et al.7에서 발췌한 것입니다. 약어: RPA = recombinase polymerase amplification; SAR-CoV-2 = 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2; FAM = 카르복시플루오르세인. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66703/66703fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
RT-RPA 및 Cas13 기반 반응을 위한 동결건조된 사전 혼합 시약은 -20°C에서 최소 8개월 동안 안정적입니다[그림 4].
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66703/66703fig06.jpg"> 그림 4: -20°C에서 동결건조되고 사전 혼합된 RPA 및 CRISPR-Cas13a 시약의 안정성 테스트. (A) 30일, (B) 45일, (C) 3개월, (D) 5개월, (E) 8개월에 안정성 테스트. 삼중 측정의 개별 데이터가 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66703/66703fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
SARS-CoV-2의 s 및 n 유전자 검출을 위한 동결건조된 RT-RPA 및 Cas13 기반 반응의 LoD는 그림 5에 나와 있습니다. 신호 생성의 동역학은 하나의 유전자만 검출되는 경우와 비교하여 이중 유전자 검출 시 개선될 수 있습니다.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66703/66703fig04.jpg"> 그림 5: 단일 유전자 대 이중 유전자 검출의 분석 민감도. (A) SAR-CoV-2의 s 유전자를 표적으로 하는 동결건조된 singleplex RT-RPA 및 Cas 기반 검출의 LoD. (B) SAR-CoV-2의 n 유전자를 표적으로 하는 동결건조 단일플렉스 RT-RPA 및 Cas 기반 검출의 LoD. (C) s 및 n 유전자를 표적으로 하는 동결건조 멀티플렉스 RT-RPA 및 이중 Cas 기반 검출의 LoD. LoD는 직렬로 희석된 SARS-CoV-2 RNA를 사용하여 측정하였으며, 그 CT 값은 n 유전자를 표적으로 하는 RT-qPCR 분석을 사용하여 측정되었습니다. 3-6회 반복 측정의 개별 데이터가 표시됩니다. 약어: LoD = 검출 한계; RT = 역전사; RPA = 재조합 효소 중합효소 증폭; CRISPR = 군집, 규칙적, 간격적, 짧은 회문 반복; Cas = CRISPR 관련 단백질; SAR-CoV-2 = 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2; CT = 사이클 임계값; qPCR = 정량적 중합효소 연쇄 반응. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66703/66703fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
바이러스 검출 외에도 CRISPR 진단을 기반으로 하는 POC 유전형 분석 도구의 프로토타입을 선보이며 태국 고유종의 독사를 식별하는 데 도움을 줍니다(그림 6). 물린 상처에서 채취한 DNA 샘플을 통해 뱀 종을 빠르고 정확하게 식별하면 해독제를 신속하게 투여하여 환자의 생존 가능성을 높일 수 있습니다. 우리는 Ophiophagus hannah (King cobra)를 포함한 8 종의 뱀 종의 미토콘드리아 cytochrome b (cytb) 유전자 내 영역을 표적으로 삼았고 O. hannah cytb 유전자의 합성 DNA 대리자 검출이 민감도 수준에 도달 할 수 있음을 보여주었습니다 (그림 6B, C).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66703/66703fig05.jpg"> 그림 6: 뱀에 물린 부위로부터 뱀 종을 식별하기 위한 CRISPR 기반 검출을 위한 프로토타입. (A) Ophiophagus hannah의 cytb 유전자 검출을 위한 RPA 프라이머 및 LwaCas13a crRNA 설계. T7 프로모터(T7 오버행)는 전방 RPA 프라이머의 5' 말단에 배치되었습니다. (B) 60분 동안 FAM 신호 생성의 역학 및 (C) O. hannah의 cytb 유전자 세그먼트에 해당하는 합성 dsDNA 입력의 LwaCas13a 매개 검출에서 종점 FAM 형광. 다양한 입력 농도(0, 10-9, 10-12, 10-15 및 10-18M)가 사용되었습니다. 데이터는 삼중 측정의 평균 ± s.d.입니다. 약어: RPA = recombinase polymerase amplification; CRISPR = 군집, 규칙적, 간격적, 짧은 회문 반복; Cas = CRISPR 관련 단백질; FAM = 카르복시플루오르세인. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66703/66703fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="5">CRISPR-Cas13a premixed 검출 시약의 동결건조</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">걸음</td>
			<td>램프 속도</td>
			<td>선반 온도</td>
			<td rowspan="2">시간(hh:mm)</td>
			<td>진공</td>
		</tr><tr><td>(°C/분)</td>
			<td>(°C)</td>
			<td>(mbar)</td>
		</tr><tr><td>동결 1</td>
			<td>3</td>
			<td>-30</td>
			<td>끄기</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>드라이 1</td>
			<td>3</td>
			<td>-30</td>
			<td>끄기</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>드라이 2</td>
			<td>3</td>
			<td>4</td>
			<td>01:00</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>드라이 3</td>
			<td>3</td>
			<td>20</td>
			<td>∞</td>
			<td>0</td>
		</tr></tbody></table>표 1: 사전 혼합된 RT-RPA 및 CRISPR-Cas13a 검출 시약의 동결건조기 설정. 약어: RT = 역전사; RPA = 재조합 효소 중합효소 증폭; CRISPR = 군집, 규칙적, 간격적, 짧은 회문 반복; Cas = CRISPR 관련 단백질.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2">매개 변수</td>
			<td>설정</td>
		</tr><tr><td colspan="2">온도</td>
			<td>37 캜</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">키네틱 사이클</td>
			<td>소요 시간</td>
			<td>02:00 (mm:ss)</td>
		</tr><tr><td>인터벌 시간</td>
			<td>02:30 (mm:ss)</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">흔들어</td>
			<td>소요 시간</td>
			<td>1초</td>
		</tr><tr><td>모드</td>
			<td>선형</td>
		</tr><tr><td>진폭</td>
			<td>1의 mm</td>
		</tr><tr><td>Fluorescence intensity(형광 강도)</td>
			<td>여기 파장</td>
			<td>488 nm의</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>방출 파장</td>
			<td>520 nm의</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>모드</td>
			<td>맨 위로</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Z-위치</td>
			<td>24470</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>이득</td>
			<td>71</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>통합 시간</td>
			<td>20 마이크로초</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>깜박임 횟수</td>
			<td>25</td>
		</tr></tbody></table>표 2: 핵산 검출을 위한 형광 마이크로플레이트 리더 프로그램.

Premixed and Freeze-dryed Reagents를 사용한 현장 진단 CRISPR 기반 진단

Molecular diagnostics by Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-based detection have high diagnostic accuracy and attributes ...

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

ampliPHOX colorimetric 감지 기술은 microarrays에 대한 형광 검출하는 저렴한 대안으로 제공됩니다. photopolymerization에 따라 ampliPHOX 단지 몇 분 이내에 육안으로 보이는 고체 고분자 명소를 생산하고 있습니다. 결과는 간단하면서도 강력한 소프트웨어 패키지로 다음 몇 군데 자동으로 해석됩니다.

인플루엔자에의 DNA Microarray에 ampliPHOX Colorimetric 검색

현재 다중화 Zika, chikungunya, 뎅 그 열 바이러스 복잡 한 샘플 준비 및 비싼 장비를 요구 하 고 저 리소스 환경에서 사용 하기 어려운 검출 하는 진단. 우리는 감지 하 여 높은 감도와 특이성이이 바이러스를 차별화 대상 특정 가닥 displaceable 프로브 등온 증폭을 사용 하는 진단을 보여줍니다.

멀티플렉스 등온 증폭 Zika, Chikungunya, 뎅 그 열의 1 감지 진단 플랫폼을 기반으로

여기, 우리는 정확 하 게 계량 드롭 ddPCR 독특한 가수분해 프로브 쌍을 사용 하 여 단일 반응에서 대상 지역의 여러 유전 변경 하는 프로토콜을 제시.

하나의 물방울 디지털 연쇄 반응 핫스팟 지역에서 돌연변이의 포괄적이 고 동시 검색

이 원고에서 급성 골수성 백혈병 (AML) 세포 증식에 여러 후보 유전자의 역할의 간단 하 고 신속 하 게 조사에 대 한 클러스터 정기적으로 Interspaced 짧은 구조 반복 (CRISPR) CRISPR-Cas9-기반 방법을 설명 합니다. 병렬입니다. 이 기술은 확장성 이며 다른 암 세포 라인에 적용 될 수 있습니다.

CRISPR-Cas9-기반 경쟁 분석 실험을 사용 하 여 유전 종속성의 조사

이 연구에서는 CRISPR-Cas12a와 결합된 재조합 중합효소 증폭을 기반으로 하는 칸디다투스 리베리박터 아시아티쿠스에 대한 빠르고 민감하며 휴대 가능한 검출 방법이 개발되었습니다.

CRISPR-Cas12a와 결합된 재조합 중합효소 증폭을 사용한 현장 배치 가능 칸디다투스 리베리박터 아시아티쿠스 검출

DNA 바이러스의 미량 검출을 위한 CRISPR/Cas12a 시스템과 재조합 중합효소 증폭을 결합한 프로토콜을 제시하고, 현장 진단 DNA 바이러스 검출을 위한 인공 지능 지원 분류를 통해 휴대용 스마트폰 현미경을 구축합니다.

RPA-CRISPR/Cas12a-SPM 및 딥러닝 기반의 DNA 바이러스 검출 시스템

여기에서는 RT-LAMP(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification)를 통해 인간 샘플에서 SARS-CoV-2 바이러스를 검출하는 방법을 표준화하고 구현하기 위한 완전한 프로토콜을 제공합니다. 60분 이내에 완료되는 이 방법은 저렴한 비용과 저렴한 장비를 사용하여 모든 실험실이나 현장 진료에 적용할 수 있습니다.

역전사 루프 매개 등온 증폭을 통한 SARS-CoV-2 바이러스 검출

이 프로토콜은 종양 관련 단백질 분해 효소 활성의 생체 외 분석을 통해 현장 암 진단을 가능하게 하는 CRISPR-Cas 매개 다중 분석물 합성 소변 바이오마커 검사에 대해 설명합니다.

휴대용 진단을 위한 CRISPR-Cas 매개 다중분석물 합성 소변 바이오마커 검사

Acinetobacter baumannii의 빠르고 정확한 검출을 촉진하기 위해 A. baumannii 감염을 식별하기 위해 LbaCas12a 엔도뉴클레아제와 함께 Recombinase Polymerase Amplification(RPA)을 사용하는 프로토콜을 제시합니다.

Recombinase Polymerase Amplification/Cas12a 기반 시스템을 사용한 Acinetobacter Baumannii 감염의 빠르고 특이적 검출

여기에서는 증폭 준비 세포 용해, 재조합효소 중합효소 증폭 및 CRISPR/Cas12a 분석을 사용하여 Lotmaria passim 및 Nosema ceranae 와 같은 꿀벌 병원체에서 DNA를 검출하는 간단하고 빠른 절차를 설명합니다.

RPA/CRISPR/Cas12a 시스템과 결합된 알칼리 용해를 통한 트리파노소마티드 기생충 및 노세마 세라네 의 현장 DNA 검출

학습하세요 동일온도 핵산 증폭과 CRISPR 기반 검출을 활용한 감염병 현장 진단 방법을. 동결건조된 프리믹스 시약을 사용하여 오염 위험을 줄이고 높은 민감도로 병원체를 신속하게 검출할 수 있습니다.

Premixed and Freeze-dryed Reagents를 사용한 현장 진단 CRISPR 기반 진단

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