Name: 산화아연 나노입자의 제조 및 항균 효과 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T13:05:00.000+00:00
Duration: 6 min 42 s
Description: 배우세요 침전법을 이용한 산화아연 나노입자 합성 및 MRSA와 Pseudomonas aeruginosa에 대한 항균 효과 평가 방법을. 이 기술은 항생제 내성균 대응 및 생물의학적 응용에 활용됩니다.

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이 연구에 사용된 시약 및 장비는 재료 표에 나열되어 있습니다.
1. 산화 아연 나노 입자의 제조
<ol><li>200mL의 절대 에틸 알코올을 측정하여 둥근 바닥 플라스크에 붓습니다.</li>
	<li>둥근 바닥 플라스크를 가열 맨틀에 놓고 25-40 °C에서 교반을 유지합니다.</li>
	<li>50mL 바이알에서 500mg의 CTAB를 측정하고 플라스크의 에틸 알코올에 추가합니다. CTAB가 완전히 녹을 때까지 저어줍니다.</li>
	<li>용액에 아연 아세테이트 1.4g을 넣고 완전히 녹을 때까지 저어줍니다.</li>
	<li>가열 맨틀 온도를 70 °C로 설정하여 용액의 온도를 높입니다.</li>
	<li>혼합물에 25mL의 0.5M NaOH 용액을 넣고 투명 용액이 흰색이 될 때까지 1시간 동안 반응시킵니다.</li>
	<li>용액을 50mL 코니컬 튜브에 분취하고 실온에서 15분 동안 15000× g 으로 원심분리한 다음 상층액을 버립니다.</li>
	<li>원뿔형 튜브 중 하나에 증류수 10mL를 추가하고 용액을 초음파 처리하여 나노 입자를 재현탁시킵니다. 현탁액을 ZnO 펠릿이 들어있는 다른 원추형 튜브로 옮기고 모든 ZnO 용액이 하나의 원뿔형 튜브에 수집될 때까지 반복합니다.</li>
	<li>15000× g 에서 원심분리를 통해 나노입자를 15분(실온) 동안 세척하고 상층액을 제거하고 증류수에 재현탁시킵니다. pH 시험지를 사용하여 상층액 용액의 pH를 확인하고 용액의 pH가 중성이 될 때까지 반복합니다. 알림: 상층액 용액의 pH가 중성(pH = 7)이 되면 상층액 용액을 버리고 증류수로 재현탁하지 마십시오.</li>
	<li>샘플 팔레트를 60°C에서 24시간 동안 진공 건조하고 ZnO NP 분말을 얻습니다.</li>
</ol>2. MRSA와 녹농균을 이용한 항균 시험
<ol><li>세균 배양 참고: 임상 MDR 박테리아 균주는 한국 서울의 중앙대학교병원에서 획득했습니다.<ol><li>TSB(Tryptic Soy Broth)에 비축된 MRSA 및 녹농균 박테리아 균주를 급속 냉동고에서 꺼냅니다.</li>
		<li>박테리아 용액을 해동한 후 일회용 접종 루프를 사용하여 TSA(Tryptic Soy Agar) 플레이트에 용액을 줄무늬 줄무늬를 만듭니다. 줄무늬가 있는 한천 플레이트를 인큐베이터에 넣고 24시간 동안 배양합니다. 참고: TSA 플레이트에서 채취한 단일 콜로니를 박테리아 접종 루프를 사용하여 50mL 원추형 튜브에 있는 10mL의 TSB 배지에 첨가했습니다. 박테리아를 24시간 동안 배양하였다. 박테리아는 37°C의 호기성 배양 조건에서 배양하였다.</li>
		<li>박테리아 용액의 농도를 측정하려면 증류수를 사용하여 10배 연속 희석을 사용하여 배양 용액을 10-6 으로 희석합니다. 그런 다음 희석된 용액 50μL를 TSA 플레이트에 놓고 L자형 스프레더를 사용하여 용액을 펴 바릅니다.</li>
		<li>인큐베이터에서 플레이트를 24시간 동안 배양합니다. 참고: 콜로니는 광학적으로 계수되었으며, 배양된 용액의 농도는 희석 인자에 계수된 콜로니의 수를 곱하여 계산되었습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>세균 샘플링<ol><li>광범위한 ZnO 농도를 테스트하려면 Dulbecco의 DPBS(Phosphate-Buffered Saline)를 사용하여 2mg/mL ZnO NP 용액을 준비하고 2배 연속 희석을 수행하여 다른 농도를 만듭니다. 참고: 1000 μg/mL, 500 μg/mL, 250 μg/mL, 125 μg/mL 및 62.5 μg/mL를 테스트했습니다.</li>
		<li>테스트된 ZnO NP 농도 각각에 대해 100μL를 96웰 플레이트에 추가합니다. 참고: 웰의 각 샘플은 100μL의 박테리아 배양액을 추가하여 희석되므로 최종 원하는 ZnO NP 농도의 두 배(2x)를 사용합니다. 2% 항생제-항진균제(A/A) 용액을 양성 대조군으로 사용하고 DPBS를 음성 대조군으로 사용합니다. A/A는 페니실린과 스트렙토마이신 항생제 복합체로 각각 그람 양성 및 그람 음성 박테리아에 효과적입니다.</li>
		<li>TSB 배지를 사용하여 박테리아 배양액을 1 × 106 CFU/mL로 희석하고 서로 다른 농도의 ZnO NP를 포함하는 각 웰에 100μL를 추가합니다. 참고: 초기 MRSA 및 녹농균 배양 용액 농도는 3 x 109 CFU/mL였습니다. 박테리아 배양 농도 1 x 106 CFU/mL는 배양 용액을 1/20 및 1/150 희석하여 만들었습니다. 100 μL의 ZnO NP와 혼합 한 후 박테리아의 최종 농도는 5 × 105 CFU / mL가됩니다.</li>
		<li>96웰 플레이트를 37°C 인큐베이터에 넣고 24시간 동안 배양합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>세균 확산<ol><li>각 웰에서 100μL를 피펫팅하고 10-6까지 다양한 10배 연속 희석액을 준비합니다. 알림: 박테리아 용액이 포함된 ZnO NP 100μL를 멸균 증류수 900μL에 넣고 6회 반복합니다.</li>
		<li>4개의 희석된 용액에서 50μL를 피펫팅하고 TSA 배지 플레이트에 추가합니다. L자형 세포 스프레더를 사용하여 박테리아 현탁액을 한천 플레이트에 펴 바릅니다. 참고: 100, 10-2, 10-4 및 10-6 희석액을 사용합니다. 모든 실험을 삼중으로 수행하십시오. 모든 박테리아 용액이 한천 플레이트에 흡수될 때까지 펴 바릅니다.</li>
		<li>한천 플레이트를 37°C 인큐베이터에 넣고 24시간 동안 배양합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>세균 CFU 계수<ol><li>각 그룹에 대해 계산할 수 있는 희석 계수를 선택합니다. 계산 가능한 희석 플레이트에 모든 콜로니를 표시하고 농도가 CFU/mL의 #이 되도록 다시 계산합니다. 알림: 계산 가능한 희석 계수는 개별 플레이트에 20-100 CFU가 있는 플레이트를 나타냅니다. 초기에 계수된 농도 결과 # 계수 CFU/50 μL. 희석되지 않은 박테리아 용액과 함께 스프레드 플레이트를 사용하여 잠재적인 최소 살균 농도를 결정합니다.</li>
		<li>얻은 데이터를 사용하여 음성 대조군에 있는 박테리아에 대한 살아있는 박테리아의 비율을 나타냅니다. 참고: 살아있는 박테리아의 비율(%) =<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66725/66725eq01.jpg" style="margin: auto;"></li>
	</ol></li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body> 산화 아연 나노 입자 합성 및 항균 효과 분석

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<li>Bazaid, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+infections+among+patients+with+chronic+diseases+at+a+tertiary+care+hospital+in+Saudi+Arabia%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Bacterial infections among patients with chronic diseases at a tertiary care hospital in Saudi Arabia.</a> Microorganisms. 10 (10), 1907(2022).</li>
<li>Miller, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+penicillins%3A+A+review+and+update%5BTitle%5D)+AND+%22J+Midwifery+Women%27s+Health%22%5BJournal%5D)">The penicillins: A review and update.</a> J Midwifery Women's Health. 47 (6), 426-434 (2002).</li>
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<li>Lee, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lateral+flow+assay+for+nucleic+acid+detection+based+on+rolling+circle+amplification+using+capture+ligand-modified+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22BioChip+J%22%5BJournal%5D)">A lateral flow assay for nucleic acid detection based on rolling circle amplification using capture ligand-modified oligonucleotides.</a> BioChip J. 16 (4), 441-450 (2022).</li>
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<li>Tieu, M. -V., Pham, D. T., Le, H. T. N., Hoang, T. X., Cho, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+ultrasensitive+detection+of+Staphylococcus+aureus+using+a+gold-interdigitated+single-wave-shaped+electrode+%28AU-ISWE%29+electrochemical+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22BioChip+J%22%5BJournal%5D)">Rapid and ultrasensitive detection of Staphylococcus aureus using a gold-interdigitated single-wave-shaped electrode (AU-ISWE) electrochemical biosensor.</a> BioChip J. 17, 1-10 (2023).</li>
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<li>Xie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+ZnO+nanomaterial-mediated+biological+applications+and+action+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomaterials%22%5BJournal%5D)">Recent advances in ZnO nanomaterial-mediated biological applications and action mechanisms.</a> Nanomaterials. 13 (9), 1500(2023).</li>
<li>Chawla, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+on+ZnO-based+targeted+drug+delivery+system%5BTitle%5D)+AND+%22Lett+Drug+Des+Discov%22%5BJournal%5D)">A review on ZnO-based targeted drug delivery system.</a> Lett Drug Des Discov. 21 (3), 397-420 (2024).</li>
<li>Alavi, M., Nokhodchi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+on+antimicrobial+and+wound+healing+properties+of+ZnO+nanobiofilms%2C+hydrogels%2C+and+bionanocomposites+based+on+cellulose%2C+chitosan%2C+and+alginate+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr+Polym%22%5BJournal%5D)">An overview on antimicrobial and wound healing properties of ZnO nanobiofilms, hydrogels, and bionanocomposites based on cellulose, chitosan, and alginate polymers.</a> Carbohydr Polym. 227, 115349(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>DLS</td><td>Zetasizer Pro</td><td></td><td></td></tr><tr><td>에틸 알코올, 절대</td><td>대정</td><td>4023-2304</td><td></td></tr><tr><td>마이크로플레이트 리더&nbsp;</td><td>BioTeck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>시그마-알드리치</td><td>221465</td><td></td></tr><tr><td>TEM</td><td>JEOL JEM-F200</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TSA</td><td>DB 디프코</td><td>236950</td><td></td></tr><tr><td>TSB</td><td>DB 디프코</td><td>211825</td><td></td></tr><tr><td>XRD</td><td>NEW D8-어드밴스</td><td></td><td></td></tr><tr><td>아연 아세테이</td><td>트 시그마-알드리치</td><td>383317</td><td></td></tr></tbody></table>

산화아연 나노입자의 제조 및 항균 효과 평가

Preparation of Zinc Oxide Nanoparticles and the Evaluation of their Antibacterial Effects

ZnO NP의 성공적인 합성은 그림 1A와 같이 투과 전자 현미경(TEM)을 사용하여 확인되었습니다. 얻어진 ZnO NP는 평균 입자 크기가 35.35nm이고 표준 편차가 6.81nm인 둥근 모양으로 관찰되었습니다. 이러한 나노 입자의 침전은 아연 아세테이트에 NaOH 용액을 첨가하여 이중 변위 반응을 통해 관찰되었으며, 여기서 Zn2 + 이온은 가수 분해를 거쳤습니다.
동적 광 산란(DLS)을 사용하여 합성된 나노 입자의 평균 크기와 제타 전위는 그림 1B와 같이 각각 130.4nm 및 28.92mV로 측정되었습니다. TEM 이미지에서 얻은 것과 비교하여 DLS를 사용하여 측정한 ZnO NP의 크기 불일치는 베어 나노 입자의 응집에 기인합니다. 양성 제타 전위는 박테리아 세포 표면과 정전적으로 상호 작용하여 잠재적으로 물리적 손상을 일으킬 수 있는 ZnO NP의 획득을 간접적으로 확인했습니다. 제타 전위의 크기는 콜로이드 시스템의 잠재적 안정성을 나타냅니다. 현탁액의 모든 입자가 큰 양의 또는 음의 제타 전위를 가질 때, 입자가 서로 밀어내는 경향이 있어 응집을 방지합니다. 제타 전위가 +30mV보다 크거나 -30mV 미만인 입자는 일반적으로 안정적인 것으로 간주됩니다. 합성된 ZnO NP는 +28.92mV의 제타 전위를 나타냈으며, 이는 물에서 상대적 안정성을 나타낸다(20).
마이크로플레이트 리더를 사용하여 ZnO NP의 흡수 스펙트럼을 검사하여 360nm에서 ZnO에 대한 특정 흡수 피크를 나타냈습니다(그림 1C). 전구체 아연 아세테이트는 고유한 피크가 없는 반면 ZnO NP는 360-370nm에서 고유한 피크를 갖는 것으로 알려져 있습니다. 합성은 합성된 ZnO NP(21)에서 360nm 고유 피크의 존재에 의해 확인되었다. 이러한 특정 UV 흡수 특성은 ZnO NP의 직접 합성을 확인했습니다. 또한 X선 회절(XRD) 분석(그림 1D)을 통해 ZnO의 특징인 뚜렷한 결정질 피크가 나타났습니다. ZnO NPs의 대표적인 wurtzite 구조(JCPDS No. 36-1415)와 비교할 때, 모든 평면 (1, 0, 0), (0, 0, 2), (1, 0, 1), (1, 0, 0), (1, 0, 3), (2, 0, 0), (1, 1, 2) 및 (2, 0, 1)이정렬(22)에 있는 것으로 관찰되었습니다.
합성된 ZnO NP의 항균 효능은 한국 서울의 중앙대학교병원에서 얻은 녹농균 및 MRSA의 임상 샘플에 대한 미세 브로스 희석 테스트를 사용하여 평가되었습니다. 분석을 위해 박테리아 배양 이미지를 캡처했습니다. 동일한 희석 인자를 사용하여 나노 입자의 항균 효능을 육안으로 평가하기 위해 희석되지 않은 박테리아 용액이 있는 스프레드 플레이트를 사용했습니다(그림 2A, B). 원래의 용액이 있는 스프레드 플레이트를 사용하여 잠재적인 최소 살균 농도를 측정했습니다. 박테리아 콜로니는 두 균주 모두에 대해 가장 높은 농도에서도 관찰되었기 때문에 완전한 살균 효과가 달성되지 않았습니다. 각 그룹의 박테리아 농도는 계산 가능한 희석 계수를 사용하여 계산되었습니다. 각 치료군의 생존율을 음성 대조군과 비교했을 때, ZnO NP의 항균 효과는 녹농균 및 MRSA 균주 모두에서 분명했습니다. ZnO NP의 연구된 세포 독성 범위를 고려하여 독성을 유발하는 것으로 알려진 가장 높은 농도인 1000μg/mL에서 시작하여 연속 희석을 통해 62.5μg/mL의 무독성 범위인23,24까지 다양한 ZnO 농도를 테스트했습니다. 녹농균(P. aeruginosa)의 경우, ZnO NPs의 항균 활성은 농도 의존적 방식으로 증가하였다(그림 2A). 그러나, 시작의 희석되지 않은(10:0) 세균 배양으로부터 녹농균 세균 콜로니의 수가 눈에 띄게 감소하는 것은 분명하지 않았다.
반대로, ZnO NP는 그람 양성 박테리아 MRSA에 대해 높은 항균 활성을 나타냈으며, 희석된 박테리아 배양물의 이미지를 시작 비희석(100) 박테리아 배양의 이미지와 비교함으로써 확인된 바와 같이 박테리아 콜로니 형성 단위(CFU)가 눈에 띄게 감소했습니다. 이 결과는 합성된 ZnO NP가 두 박테리아 균주에 대해 항균 활성을 나타냈으며, 특히 MRSA균주에 대해 향상된 효능을 나타냈다는 것을 확인했습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66725/66725fig01.jpg"> 그림 1: 산화아연 나노입자의 특성화. (A) 다양한 배율에서 ZnO NP의 투과 전자 현미경 이미지. (B) DLS 분석에 의한 크기(왼쪽) 및 제타 전위 분포(오른쪽). (C) 마이크로플레이트 리더를 사용한 ZnO NP의 흡광도 스펙트럼. (D) ZnO NP 및 그 결정 피크의 XRD 분석. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66725/66725fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66725/66725fig02.jpg"> 그림 2: 5 x 105 CFU/mL 박테리아 균주에 대해 테스트한 ZnO NP의 항균 특성. (A) 녹농균 균주에 대한 항균 테스트. (B) MRSA 균주에 대한 항균 테스트. N = 네거티브 컨트롤(DPBS), P = 포지티브 컨트롤(A/A). 별표는 대조군과 비교하여 통계적으로 유의한 차이(****p ≤ 0.0001)를 나타냅니다. 세 번에 걸쳐 수행된 3개의 독립적인 실험의 평균 ± SD로 제시된 데이터. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66725/66725fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Nosocomial bacterial infections have become increasingly challenging due to their inherent resistance to antibiotics. The emergence of multidrug-resistant ...

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