Name: 암-면역 주기를 재현하기 위한 Co-Culture In Vitro 시스템 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: 배우세요 암-면역 주기를 재현하는 Co-Culture In Vitro 시스템을 통해 종양 미세환경에서 암세포와 면역세포의 상호작용을 분석하는 방법을. 이 프로토콜은 면역 감시와 회피 메커니즘 균형을 이해하는 데 활용됩니다.

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A.S.는 AIRC(IG #28807) 및 PRIN(#P2022YE2MX)에서 지원됩니다. M.M.은 AIRC-FIRC 펠로우십(#25558)의 지원을 받습니다. ADN은 혁신 생태계 로마 테크노폴(Innovation Ecosystem Rome Technopole)의 지원을 받ECS00000024 EU-Next Generation EU, PNRR Mission 4 Component 2 Investment 1.5의 자금 지원을 받습니다.

유세포분석 기반 암 면역 주기 모니터링 

<ol><li>Chen, D. S., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncology+meets+immunology%3A+the+cancer-immunity+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Oncology meets immunology: the cancer-immunity cycle.</a> Immunity. 39 (1), 1-10 (2013).</li>
<li>Mellman, I., Chen, D. S., Powles, T., Turley, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cancer-immunity+cycle%3A+Indication%2C+genotype%2C+and+immunotype%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The cancer-immunity cycle: Indication, genotype, and immunotype.</a> Immunity. 56 (10), 2188-2205 (2023).</li>
<li>Galassi, C., Musella, M., Manduca, N., Maccafeo, E., Sistigu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+privilege+of+cancer+stem+cells%3A+A+key+to+understanding+tumor+immune+escape+and+therapy+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">The immune privilege of cancer stem cells: A key to understanding tumor immune escape and therapy failure.</a> Cells. 10 (9), 2361(2021).</li>
<li>Dunn, G. P., Old, L. J., Schreiber, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+three+Es+of+cancer+immunoediting%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The three Es of cancer immunoediting.</a> Annu Rev Immunol. 22, 329-360 (2004).</li>
<li>Musella, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+IFNs+promote+cancer+cell+stemness+by+triggering+the+epigenetic+regulator+KDM1B%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immun%22%5BJournal%5D)">Type I IFNs promote cancer cell stemness by triggering the epigenetic regulator KDM1B.</a> Nat Immun. 23 (9), 1379-1392 (2022).</li>
<li>Anderson, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leveraging+immune+resistance+archetypes+in+solid+cancer+to+inform+next-generation+anticancer+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">Leveraging immune resistance archetypes in solid cancer to inform next-generation anticancer therapies.</a> J Immunother Cancer. 11 (6), e006533(2023).</li>
<li>Sharma, P., Hu-Lieskovan, S., Wargo, J. A., Ribas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary%2C+adaptive%2C+and+acquired+resistance+to+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Primary, adaptive, and acquired resistance to cancer immunotherapy.</a> Cell. 168 (4), 707-723 (2017).</li>
<li>Musella, M., Manduca, N., Maccafeo, E., Ruggiero, E., Sistigu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+evaluation+of+cancer+cell+immunogenicity+and+antigen-specific+T-cell+cytotoxicity+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro evaluation of cancer cell immunogenicity and antigen-specific T-cell cytotoxicity by flow cytometry.</a> Methods Mol Biol. 2748, 13-28 (2024).</li>
<li>Bonilla, D. L., Reinin, G., Chua, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full+spectrum+flow+cytometry+as+a+powerful+technology+for+cancer+immunotherapy+research%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Full spectrum flow cytometry as a powerful technology for cancer immunotherapy research.</a> Front Mol Biosci. 7, 612801(2020).</li>
<li>Danova, M., Torchio, M., Comolli, G., Sbrana, A., Antonuzzo, A., Mazzini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+automated+cytometry+in+the+new+era+of+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">The role of automated cytometry in the new era of cancer immunotherapy.</a> Mol Clin Oncol. 9 (4), 355-361 (2018).</li>
<li>Laskowski, T. J., Hazen, A. L., Collazo, R. S., Haviland, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rigor+and+reproducibility+of+cytometry+practices+for+immuno-oncology%3A+A+multifaceted+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Rigor and reproducibility of cytometry practices for immuno-oncology: A multifaceted challenge.</a> Cytometry A. 97 (2), 116-125 (2020).</li>
<li>Manduca, N., Maccafeo, E., De Maria, R., Sistigu, A., Musella, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+cancer+models%3A+One+step+closer+to+in+vitro+human+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">3D cancer models: One step closer to in vitro human studies.</a> Front Immunol. 14, 1175503(2023).</li>
<li>De Ninno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+co-culture+models+for+dissecting+the+immune+response+in+in+vitro+tumor+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Microfluidic co-culture models for dissecting the immune response in in vitro tumor microenvironments.</a> JoVE. (170), e61895(2021).</li>
<li>Mattei, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncoimmunology+meets+organs-on-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Oncoimmunology meets organs-on-chip.</a> Front Mol Biosci. 8, 627454(2021).</li>
<li>Businaro, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross+talk+between+cancer+and+immune+cells%3A+exploring+complex+dynamics+in+a+microfluidic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Cross talk between cancer and immune cells: exploring complex dynamics in a microfluidic environment.</a> Lab Chip. 13 (2), 229-239 (2013).</li>
<li>Vacchelli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapy-induced+antitumor+immunity+requires+formyl+peptide+receptor+1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chemotherapy-induced antitumor immunity requires formyl peptide receptor 1.</a> Science. 350 (6263), 972-978 (2015).</li>
<li>Maulana, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocompetent+cancer-on-chip+models+to+assess+immuno-oncology+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Immunocompetent cancer-on-chip models to assess immuno-oncology therapy.</a> Adv Drug Deliv Rev. 173, 281-305 (2021).</li>
<li>Lorenzi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+IFNs+control+antigen+retention+and+survival+of+CD8%CE%B1%28%2B%29+dendritic+cells+after+uptake+of+tumor+apoptotic+cells+leading+to+cross-priming%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immun%22%5BJournal%5D)">Type I IFNs control antigen retention and survival of CD8α(+) dendritic cells after uptake of tumor apoptotic cells leading to cross-priming.</a> J Immun. 186 (9), 5142-5150 (2011).</li>
<li>Musella, M., Manic, G., Galassi, C., Vitale, I., Sistigu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytofluorometric+assessment+of+dendritic+cell-mediated+uptake+of+cancer+cell+apoptotic+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Cytofluorometric assessment of dendritic cell-mediated uptake of cancer cell apoptotic bodies.</a> Methods Enzymol. 632, 39-54 (2020).</li>
<li>Lucarini, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+Type+I+Interferons+and+5-Aza-2%27-Deoxycitidine+to+improve+antitumor+response+against+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Combining Type I Interferons and 5-Aza-2'-Deoxycitidine to improve antitumor response against melanoma.</a> J Invest Dermatol. 137 (1), 159-169 (2017).</li>
<li>Gutiérrez-Martínez, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-presentation+of+cell-associated+antigens+by+MHC+Class+I+in+dendritic+cell+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cross-presentation of cell-associated antigens by MHC Class I in dendritic cell subsets.</a> Front Immunol. 6, 363(2015).</li>
<li>Joffre, O. P., Segura, E., Savina, A., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-presentation+by+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cross-presentation by dendritic cells.</a> Nat Rev Immunol. 12 (8), 557-569 (2012).</li>
<li>Hegde, P. S., Karanikas, V., Evers, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+where%2C+the+when%2C+and+the+how+of+immune+monitoring+for+cancer+immunotherapies+in+the+era+of+checkpoint+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The where, the when, and the how of immune monitoring for cancer immunotherapies in the era of checkpoint inhibition.</a> Clin Cancer Res. 22 (8), 1865-1874 (2016).</li>
<li>Lee, R. Y., Ng, C. W., Rajapakse, M. P., Ang, N., Yeong, J. P. S., Lau, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+and+challenge+of+spatial+omics+in+dissecting+tumour+microenvironment+and+the+role+of+AI%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">The promise and challenge of spatial omics in dissecting tumour microenvironment and the role of AI.</a> Front Oncol. 13, 1172314(2023).</li>
<li>Lewis, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+omics+and+multiplexed+imaging+to+explore+cancer+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Spatial omics and multiplexed imaging to explore cancer biology.</a> Nat Methods. 18 (9), 997-1012 (2021).</li>
<li>Wu, Y., Cheng, Y., Wang, X., Fan, J., Gao, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+omics%3A+Navigating+to+the+golden+era+of+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Spatial omics: Navigating to the golden era of cancer research.</a> Clin Transl Med. 12 (1), 696(2022).</li>
<li>Vandereyken, K., Sifrim, A., Thienpont, B., Voet, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+and+applications+for+single-cell+and+spatial+multi-omics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Methods and applications for single-cell and spatial multi-omics.</a> Nat Rev Genet. 24 (8), 494-515 (2023).</li>
<li>Cheung, M., Campbell, J. J., Whitby, L., Thomas, R. J., Braybrook, J., Petzing, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+trends+in+flow+cytometry+automated+data+analysis+software%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Current trends in flow cytometry automated data analysis software.</a> Cytometry A. 99 (10), 1007-1021 (2021).</li>
<li>Zitvogel, L., Pitt, J. M., Daillère, R., Smyth, M. J., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+in+oncoimmunology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Mouse models in oncoimmunology.</a> Nat Rev Cancer. 16 (12), 759-773 (2016).</li>
</ol>

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

항암 면역 반응을 모니터링하는 것은 TME에서 작용하고 패권을 위한 끊임없는 싸움을 지원하는 복잡한 분자 및 세포 상호 작용을 규명하고 이해하는 데 가장 중요합니다23. 여기에서는 암-면역 주기를 구성하는 단계의 모니터링 및 특성화를 위한 간단한 mFC 및 ToC 지원 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 쥐 세포주와 마우스 유래 면역 세포를 기반으로 하는 이 프로토콜은 약간의 변형을 통해 인간 불멸 암 및 원발성 암 계통 및 인간 말초 혈액 유래 면역 세포 모두에 적용할 수 있습니다. 또한, 특정 경로에 대한 유전적 또는 약리학적 억제와 이들의 동족에 적합한 제어를 결합한 이 프로토콜은 면역감시를 조절하는 바이오마커를 식별하여 면역원성 및 면역 요법에 대한 반응을 가능하게 합니다.
mFC는 다양한 면역 파라미터에 대한 고처리량 분석을 가능하게 하고, 짧은 시간에 수백만 개의 세포를 분석할 수 있는 능력과 희귀 이벤트를 식별하고, 세포 증식 및 세포 사멸을 평가하고, 소량의 샘플에서 한 번에 여러 파라미터를 검출할 수 있는 기능을 결합하고, 형광 기반 세포 분류 후 다운스트림 분자 및 기능 분석을 수행할 수 있습니다9. 이러한 기능은 저렴한 비용과 함께 mFC 접근성과 연구 및 임상 실험실에서 널리 사용되는 데 유리합니다. 그럼에도 불구하고 몇 가지 중요한 제한 사항이 남아 있습니다. 첫째, mFC 분석은 시료 전처리 중에 단일 세포 현탁액을 얻기 위해 조직 해리가 필요하며, 이로 인해 종양 조직의 공간 정보가 파괴됩니다. 지난 10년 동안 high-plex spatial transcriptomic, proteomic, epigenomic을 포함한 공간 기술의 출현으로 암, 면역 및 기질 세포의 위치와 상호 작용을 분석하여 TME를 프로파일링할 수 있는 능력이 확장되었습니다24. 둘째, mFC는 한 번에 최대 16개(또는 그 정도)의 파라미터를 검출할 수 있으므로 단일 샘플에서 모든 세포 식별, 성숙 및 활성화 상태 마커를 다루지 않습니다. 다시 말하지만, 위의 최첨단 기술을 사용하면25,26,27 이전과 같이 단일 세포 및 하위 세포 분해능에서 최대 100개의 매개변수를 동시에 감지할 수 있습니다. 셋째, 종단 및 비교 연구의 면역 모니터링에는 재현 가능한 프로토콜과 데이터 수집 및 분석을 포함한 워크플로우의 모든 단계에 대한 표준화가 필요합니다. 기존의 수동 게이팅은 주관적일 수 있으며 기기 유지 관리 및 품질 검사는 다를 수 있으며, 이는 데이터 마이닝 및 해석에 영향을 미칩니다. 데이터 분석을 구현하는 자동 수집 및 플러그인은 데이터 변동성을 최소화하는 데 도움이 됩니다28.
ToC는 TME의 여러 특징을 밀접하게 복제하고 적어도 일부 실험 환경에서 생체 내 종양을 대체할 수 있는 능력으로 인해 암 연구에서 엄청난 주목을 받고 있습니다12. ToC는 종양-조직 구조, 다세포 복잡성 및 TME의 세포 구성 요소 간의 동적 상호 작용에 대한 매우 현실적인 모델을 제공하지만, 전신 면역 반응의 복잡성, 특히 암-면역 주기의 각 단계에 대한 속도 제한 단계의 출현을 담당하는 일련의 메커니즘을 반영하는 측면에서 여전히 동물 연구를 완전히 대체할 수 없습니다12, 29. 이러한 측면을 넘어서서, 종양 면역학 분야는 라운드와 과학적 혁신의 속도로 인해 생체 내 모델12에 점점 더 가까워지고 있기 때문에 ToC의 사용으로부터 계속해서 이익을 얻고 이익을 얻을 것입니다.
결론적으로, 여기에 설명된 프로토콜은 TME의 동적 복잡성을 풀기 위한 강력하고 간단한 분석 및 발견 도구 역할을 합니다. 또한 이 프로토콜의 시간 및 비용 관련 기능으로 인해 대규모로 실현 가능합니다. 앞으로의 과제는 암 환자를 위한 치료 결정을 더 잘 알리고 안내하기 위해 임상적 사용을 위해 표준화하는 것입니다.

지난 수십 년 동안 면역 요법은 암 치료를 위한 최첨단 옵션의 최전선에 있었습니다. 항종양 목적으로 면역 체계를 활용하면 역사적으로 예후가 좋지 않은 다양한 혈액 및 고형 악성 종양에 걸쳐 환자에게 혜택을 줄 수 있는 강력한 개념 증명을 제공했습니다. 면역 요법이 다른 방법으로는 치료하기 어려운 암에 대한 기회를 제공함에 따라 놀라울 정도로 빠른 진행 속도를 경험하고 있습니다. 이러한 발전은 적어도 부분적으로는 암세포와 면역세포 사이의 상호 작용에 대한 정교한 이해에 기인할 수 있습니다. 이러한 상호 작용은 면역 체계가 암세포를 파괴하기 위해 점화하는 피드포워드 "엔진", 이른바 암-면역 주기와 유사합니다. 이 항암 면역 반응은 인식, 처리 및 반응의 세 가지 주요 수준에 걸쳐 진행됩니다. 첫째, 인식 단계에서 종양 형성 중에 생성된 종양 항원(Ag)은 종양 미세환경(TME, 1단계)에서 죽어가는 암세포에 의해 방출되고 종양 침투 수지상 세포(DC, 2단계)에 의해 삼켜집니다. 다음으로, 처리 단계에서 DC는 주요 조직적합성 복합체(MHC) 분자를 통해 포획된 종양 Ag의 에피토프를 제시하고, 표면에 더 높은 수준의 늑골 분자를 발현하고(3단계), 종양 배출 림프절(dLN)로 이동하여 화물을 미성숙 CD8 T 세포에 교차 제시합니다(CD8N, 4단계). 이러한 모든 단계는 종양 Ag 특이적 교차 프라임 CD8 T 세포(CD8C-P)가 활성화되고 effector CD8 T(CD8E) 세포로 성숙한 후 클론 확장(단계 5)을 거치는 최종 반응 과정에서 수렴됩니다. 그런 다음 CD8E 세포는 dLN과 혈액을 통해 TME로 이동하며(6단계) T 세포 수용체(TCR)와 동족 종양 Ags 사이의 상호 작용을 통해 암세포를 특이적으로 인식하고 결합하고, 세포독성 분자[즉, 인터페론(IFN)-γ, 퍼포린 및 그랜자임(Grzs)]을 방출하고, 암세포를 죽이고(단계 7)1, 2. 암세포 사멸은 암-면역 주기에 연료를 공급하기 위해 추가 종양 Ags의 방출로 이어집니다. 사실, 이 모든 단계를 통해 면역 체계는 예상보다 훨씬 더 자주 암세포를 파괴하고 거부합니다. 그러나 암 환자의 경우 이러한 단계 중 적어도 하나가 제대로 작동하지 않습니다. 우리와 다른 연구자들은 암세포가 더 공격적이고 면역 특권을 가진 변이체로 진화하거나 3,4,5 또는 T-세포 효과를 방해함으로써 면역 반응을 지연시키려고 한다는 것을 보여주었다 6,7.
암 연구와 항암제 개발은 모두 암과 면역 세포 간의 관계를 연구할 수 있는 실험 모델, 이른바 종양 면역학(onco-immunology)에 의존합니다. 여기에는 종양 면역학 주기의 각 단계를 종합적으로 재현하는 빠르고 신뢰할 수 있으며 재현 가능하고 저렴한 in vitro 모델에 대해 설명하고 있으며, 면역 감시 및 궁극적으로 면역 편집의 표현형 및 기능적 특징 세트에 대한 빠르고 명확한 관점을 제공합니다.
다매개변수 유세포 분석(mFC)은 암 임상 시험의 기초 암 연구, 진단 및 중개 연구에서 가장 성공적인 단일 세포 분석 도구 중 하나입니다. 각 세포에서 더 많은 특징을 동시에 캡처할 수 있기 때문에 mFC는 종양 면역학에서 최고의 표준 분석 플랫폼으로 자리매김했습니다. TME8,9,10과 같은 이종 및 이형 세포 현탁액의 단일 세포 수준에서 여러 단백질 발현 패턴 및 기능적 특성을 빠르고 재현성 있게 측정할 수 있는 가능성과 높은 감도 및 특이성을 결합합니다. 표현형 및 기능적 발현 패턴은 모두 시간에 민감하기 때문에 실험 설계, 적합한 패널, 대조군 및 적정 항체의 선택, 적절한 시료 처리 및 기기 사용에 세심한 주의를 기울이는 것이 결과의 신뢰성, 비교 가능성 및 재현성을 위해 그리고 실험 결과를 자신 있게 해석하는 데 매우 중요하다11.
Tumor-on-a-chip 미세유체 장치(ToC)는 암 및 면역 세포 역학의 시험관 내 마이크로 스케일 생체 모방을 허용하여 TME를 모델링하고 12,13,14,15를 상호 작용합니다. 구체적으로, ToC는 2차원(2D) 또는 3차원(3D) 배양 설정으로 구성된 다양한 세포 유형을 호스팅할 수 있는 다채널 미세유체 세포 배양 장치로서, 높은 충실도로 모델링할 수 있으며, TME(12)에서 생리학적으로 발생하는 이형 세포 상호 작용 및 화학적 구배의 흐름과 같은 주요 구조 및 기능 단위를 높은 정밀도로 제어할 수 있습니다. 13,14,15. 특히, 면역 화학인력 및 궤적뿐만 아니라 면역 세포와 암세포의 상호 작용을 실시간으로 모니터링하고 타임 랩스 현미경 및 자동 추적 분석을 통해 정량화할 수 있습니다 5,12,13,14,15,16. 또한, ToC는 암의 발병과 진행 및 치료에 대한 반응을 조절하는 중요한 과정을 분석하고 조작할 수 있는 가능성을 제공한다17.
이 기사에서는 mFC와 ToC를 결합하여 암 Ags의 DC 매개 식세포작용(단계 1-3), T 세포 교차 프라이밍(단계 4), 활성화 및 클론 확장(마지막은 5-ethynyl-2'-deoxyuridine(EdU) 및 Cu(I) 촉매 사이클로첨가 [클릭] 기술을 통해 항암 면역 반응의 모든 수준을 연구합니다. 5단계), CD8E 세포가 TME로 귀환(6단계), 마지막으로 CD8E-세포 매개 암세포 사멸(단계 7, 그림 1).
이 연구는 암-면역 주기를 연구하기 위한 간단하고 빠르며 신뢰할 수 있는 표준 프로토콜을 수립하기 위한 노력에 기여합니다. 암 연구, TME 역학 및 치료에 대한 mFC 및 ToC 모델의 개선 및 통합은 이러한 모델이 실험 제어와 함께 생물학적 충실도를 제공하기 때문에 큰 잠재력을 가지고 있습니다. 따라서 이 프로토콜은 자연 및 후천적 면역 감시에 대한 개별 세포 플레이어의 역할과 상호 상호 작용을 특성화, 모니터링 및 적시에 조작할 수 있도록 함으로써 암-면역 주기를 단계적으로 재현하는 데 도움이 됩니다. 이는 궁극적으로 동물 연구를 개선, 축소 및 대체하는 데 도움이 되는 동시에 종양을 능가하고 임상 치료를 안내하는 데 중요한 통찰력을 제공할 것입니다. 마지막으로, mFC 및 ToC의 장점과 한계에 대해 비판적으로 논의하고 최첨단 기술(예: 단일 세포 및 세포 내 분해능에서의 고플렉스 공간 분석)과 비교하여 종양 면역학 연구 및 치료를 발전시킵니다.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 마이크로튜브&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>100 kV e-beam litography</td><td>Vistec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mm 페트리 접시&nbsp;</td><td>Greiner Bio One</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>12웰 플레이트</td><td>유로클론</td><td>&nbsp; ET3012</td><td></td></tr><tr><td>15 및 50 mL 튜브</td><td>Corning&nbsp;</td><td>352096; 352070</td><td></td></tr><tr><td>40 &뮤; M 세포 스트레이너&nbsp;</td><td>코닝&nbsp;</td><td></td><td></td>CLS431750</tr><tr><td>5 mL 폴리스티렌 튜브&nbsp;</td><td>Greiner 바이오 원</td><td>120180</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; M 세포 스트레이너&nbsp;</td><td>코닝&nbsp;</td><td></td><td></td>CLS431751</tr><tr><td>75 cm2 세포 배양 처리 플라스크</td><td>Euroclone</td><td>&nbsp; ET7076</td><td></td></tr><tr><td>흡착제 물티슈</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Allumin 호일</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>안티 마우스 CD107a (LAMP-1) 항체</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-111-319</td><td></td></tr><tr><td>안티 마우스 CD25 (7D4) 항체&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-118-678</td><td></td></tr><tr><td>안티 마우스 CD3 (17A2) 항체</td><td>BioLegend</td><td>100206</td><td></td></tr><tr><td>Aptes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>440140</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm Plus 고정/투과화 솔루션 키트(BD GolgiPlug</td><td>포함) BD Biosciences</td><td>555028</td><td></td></tr><tr><td>BD GolgiPlug 단백질 수송 억제제(Brefeldin A 포함)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td>555029</tr><tr><td>BD GolgiStop 단백질 수송 억제제(모넨신 함유)</td><td>BD Biosciences</td><td>554724</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td>US Biological, Salem</td><td>A1312</td><td></td></tr><tr><td>CD11c 단클론 항체(N418)</td><td>eBioscience</td><td>12-0114-81</td><td></td></tr><tr><td>CD137 (4-1BB) 단클론 항체(17B5)</td><td>eBioscience</td><td>17-1371-82</td><td></td></tr><tr><td>CD3 단클론 항체 (17A2)</td><td>eBioscience</td><td>25-0032-82</td><td></td></tr><tr><td>CD44 단클론 항체 (IM7)</td><td>eBioscience</td><td>11-0441-82</td><td></td></tr><tr><td>CD45 단클론 항체 (30-F11)</td><td>Invitrogen</td><td>MCD4528</td><td></td></tr><tr><td>CD69 단클론 항체 (H1.2F3)</td><td>eBioscience</td><td>48-0691-82</td><td></td></tr><tr><td>CD8a 단클론 항체 (53-6.7)</td><td>eBioscience</td><td>11-0081-82</td><td></td></tr><tr><td>CD8a 단클론 항체 (53-6.7)</td><td>eBioscience</td><td>17-0081-82</td><td></td></tr><tr><td>CD95 (APO-1/Fas) 단클론 항체 (15A7)</td><td>eBioscience</td><td>53-0951-82</td><td></td></tr><tr><td>세포 계수 슬라이드</td><td>Kova International</td><td>87144E</td><td></td></tr><tr><td>크롬 석영 마스크</td><td>MB W& A, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647 유세포 분석 키트</td><td>Invitrogen</td><td>C10635</td><td></td></tr><tr><td>CytoFLEX 유세포 분석기</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>사체 제거 키트</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-101</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco의 인산염 완충 식염수(D-PBS)</td><td>EuroClone</td><td>ECB4053L</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>EuroClone</td><td>ECS0180L</td><td></td></tr><tr><td>Flowjo v10.0.7</td><td>Flowjo, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Granzyme B Monoclonal 항체 (NGZB)</td><td>eBioscience</td><td>12-8898-82</td><td></td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>H2SO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>핫플레이트</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Humified cell culture incubator (37°, 5% CO2)</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>제빙기</td><td>Brema Ice Makers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IFN gamma Monoclonal Antibody (XMG1.2)</td><td>eBioscience</td><td>11-7311-82</td><td></td></tr><tr><td>Illustrator CC 2015</td><td>어도비 시스템즈</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institute of Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incucyte 2022A 소프트웨어</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incucyte Cytotox Dye</td> for <td>Counting Dead Cells Sartorius</td><td>4632</td><td></td></tr><tr><td>Incucyte SX5 Live-Cell Analysis System&nbsp;</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JuLi 스마트 형광 라이브 셀 이미징 현미경</td><td>불독 바이오</td><td></td><td></td></tr><tr><td>실험실 벤치</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>실험실 냉장고 (4&deg; C)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>실험실 안전 캐비닛 (Class II)</td> <td>Angelantoni</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민 200 mM</td><td>EuroClone</td><td>ECB3004D</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD 고정식 아쿠아 데드 셀 염색 키트</td><td>Invitrogen</td><td>L34957</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD 고정 가능한 근적외선 데드 셀 염색 키트</td><td>Invitrogen</td><td>L10119</td><td></td></tr><tr><td>MACS 컬럼</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201; 전화: 130-042-401&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MACS 분리기</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-10; 130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>MCA205 마우스 섬유육종 세포주</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SCC173</td><td></td></tr><tr><td>Class II 안전 캐빈</td><td></td><td></td><td></td>을 갖춘 미생물 제어 동물 시설</tr><tr><td>MicroCL 21R Microcentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002552</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel&nbsp;</td><td>마이크로소프트, 레드몬드&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>마우스: C57BL/6J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Naive CD8a+ T 세포 분리 키트, 마우스</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-543</td><td></td></tr><tr><td>Nikon ECLIPSE Ts2</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements BR 5.30.0064-BIT</td><td>니콘 인스트루먼트 Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>광학 리토그래</td>피 <td>EVG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>페니실린 G 나트륨 염 및 스트렙토마이신 황산염</td><td>EuroClone</td><td>ECB3001D/1</td><td></td></tr><tr><td>피펫 에이드</td><td>Drummond Scientific Co., Broomall, PA</td><td>&nbsp; 4-000-201</td><td></td></tr><tr><td>피펫</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PKH67 형광 세포 링커 키트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PKH67GL-1KT</td><td>형광 세포 링커&nbsp; 키트</td></tr><tr><td>플라스틱 커버슬립</td><td>IBIDI</td><td>10812</td><td></td></tr><tr><td>Propidium Iodide</td><td>Thermo Scientific</td><td>P1304MP</td><td></td></tr><tr><td>반응성 이온 에칭 시스템</td><td>Oxford plasmalab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640)</td><td>EuroClone</td><td>ECB9006L</td><td></td></tr><tr><td>혈청 피펫 (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL)</td><td>Corning- Millipore-Sigma; 세인트루이스, MO</td><td>CLS4486; CLS4487; CLS4488; </td><td></td>CLS4489</tr><tr><td>SL 16 원심분리기 시리즈</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004031</td><td></td></tr><tr><td>멸균 메스, 수술용 집게, 가위 및 플라이어</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>멸균 팁 (1&ndash; 10 &뮤; L, 20&ndash; 200 &뮤; L, 1000 &뮤; L)</td><td>EuroClone Spa, 이탈리아 밀라노</td><td>ECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; </td><td></td>ECTD01005</tr><tr><td>SU-8 3000 시리즈</td><td>MicroChem corp, Newton, (MA)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>피부 생검 펀치</td><td>제품군 Kai Medical, Tedpella</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Dowsil, Dow Corning</td><td>101697</td><td></td></tr><tr><td>TCR 베타 단클론 항체 (H57-597)</td><td>eBioscience</td><td>12-5961-82</td><td></td></tr><tr><td>온도 조절 수조</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>타이머</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TMCS&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>92360</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain (0.4%)</td><td>Thermo Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA w/ Phenol Red</td><td>EuroClone</td><td>ECM0920</td><td></td></tr><tr><td>진공 건조제</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

암-면역 주기를 재현하기 위한 co-culture in vitro 시스템

Co-Culture In Vitro Systems to Reproduce the Cancer-Immunity Cycle

근본적인 암 연구와 효과적인 반격 요법의 개발은 모두 암과 면역 세포 간의 상호 작용, 이른바 암-면역 주기를 자세히 설명하는 실험적 연구에 의존합니다. mFC(Multiparametric Flow Cytometry) 및 ToC(tumor-on-a-chip microfluidic devices)와 결합된 체외 공동 배양 시스템은 암 면역 주기의 각 단계에 대한 간단하고 빠르며 신뢰할 수 있는 모니터링 및 특성 분석을 가능하게 하며 암 면역 감시와 면역 회피 간의 균형을 유지하는 메커니즘을 식별할 수 있도록 합니다. 암과 면역 세포 간의 역동적인 상호 작용에 대한 철저한 이해는 종양을 능가하는 데 중요한 통찰력을 제공하고 환자의 치료 개인화 및 최적화 속도를 가속화할 것입니다. 특히, 여기에서는 쥐 암 세포주와 마우스 유래 면역 세포에서 암 면역 주기의 각 단계의 동적 복잡성을 밝히고 면역 감시에 중점을 두기 위한 간단한 mFC 및 ToC 지원 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 이 프로토콜의 시간 및 비용 관련 기능을 고려할 때 대규모로 확실히 실현 가능합니다. 더욱이, 약간의 변형을 통해 이 프로토콜은 인간 암 세포주와 인간 말초 혈액 유래 면역 세포에 모두 적용할 수 있으며, 면역 반응의 바이오마커를 식별하기 위해 특정 경로의 유전적 및/또는 약리학적 억제와 결합될 수 있습니다.

mFC는 cross-presentation21,22에 특화되고 그림 2A와 같이 gated된 널리 알려진 phagocyte subset인 CD11c+ DC가 이전에 PKH67 형광 세포 링커로 표지된 UV 방사선 조사된 MCA205 암세포의 자가사멸체를 집어삼킬 수 있는 능력을 평가했습니다. 예상대로 CD11c+ DC는 4°C가 아닌 37°C에서 시험관 내에서 세포사멸 MCA205 세포를 효율적으로 캡처했습니다(그림 2B, 암-면역 주기의 1-3단계). 종양 Ag 흡수 후 DC 성숙을 추가로 특성화하기 위해 늑골 및 면역 관문 리간드 분자의 표면 발현을 확인하고 DC의 식균작용 전후(각각 DCN 및 DCPHAGO)에서 비교했습니다. DCPHAGO 세포는 PDL1 수치 감소와 함께 CD86 및 MHC-II 수치가 유의하게 증가한 것으로 나타났습니다(그림 2C, 암-면역 주기의 4단계). 더욱이, DCPHAGO(CD8C-P)에 의해 교차 프라이밍된 CD8 T 세포의 클론 확장은 EdU 티미딘 유사체의 통합(암-면역 주기의 5단계)을 평가하여 평가되었습니다. 살아있는 CD3+CD8+ T 세포(그림 3A)를 적절하게 게이팅함으로써, CD95 분자를 발현하고 종양 Ag 특이적 TCR을 지닌 클론을 대표하는 CD8C-P의 ~20%(보충 그림 1)가 순진한 CD8 T 세포(CD8N, 그림 3B)에 비해 증식을 겪었다는 것이 밝혀졌습니다. ToC 모델(그림 3C)을 사용하여 암세포에서 방출되는 알람민에 의한 화학인력을 감지하고 반응하는 CD8C-P의 능력을 평가하여 종양 특이적 CD8 T 세포가 TME로 귀환하는 것을 반영했습니다(암-면역 주기의 6단계). 특히, 면역 챔버에서 종양 챔버로 이동하고 종양 챔버에서 휴착 암세포로 이동하는 비부착 면역 세포 간의 화학적, 물리적 인력과 상호 작용을 허용하고 추적하기 위해 ToC가 사용되었습니다. 공동 배양 후 다른 시점에서 촬영한 현미경 사진은 CD8C-P가 미세채널을 교차하여 암세포 쪽으로 점진적으로 이동하는 것을 보여주었습니다(그림 3C). 흥미로운 것은 면역 세포에 접근하면 24시간, 48시간, 72시간 동안 암세포와 안정적이고 효율적으로 상호 작용할 수 있다는 것이었습니다(그림 3D). 마지막으로, mFC를 통해 초기 CD69(보충 그림 2A) 및 후기 CD44, CD25(그림 4A) 활성화 마커의 표면 발현 수준과 CD8N 및 CD8 C-P와 비교하여 CD137(그림 4B) 및 CD107a(보충 그림 2B) 종양 반응성 마커의 막 발현을 평가함으로써 TME에 홈을 두고 암으로 제시된 Ags(CD8E)에 의해 재자극된 CD8C-P의 반응을 분석했습니다 (암-면역 주기의 7단계). 또한 세포독성 분자 Grz-B(그림 5A) 및 IFN-γ(그림 5B)의 세포 내 생산을 평가했습니다. 흥미롭게도, 이러한 모든 마커 수준은 점진적이고 유의하게 증가하여 공동 배양 72시간에서 발현 선택에 도달했으며, 따라서 늦고 효과적인 활성화를 반영합니다. 그 결과, 동족 공동 배양된 MCA205 세포는 살아있는 세포 분석 시스템 및 mFC 분석에 의해 밝혀진 바와 같이 상당한 수준의 CD8E 매개 사멸을 겪었습니다(그림 6).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66729/66729fig01.jpg"> 그림 1: 암-면역 주기를 연구하기 위한 실험 프로토콜의 개요. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/66729fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66729/66729fig02.jpg"> 그림 2: DC 매개 암세포 Ag 흡수 및 표현. (A) DC mFC 분석을 위한 게이팅 전략. mFC 수집 및 데이터 분석 중에, 샘플은 FSC-A 및 SSC-A를 플로팅하여 형태학을 위해 (1) 순차적으로 게이트되었습니다. (2) FSC-A 및 FSC-H를 플로팅하여 단일항의 경우; (3) Near-IR 및 SSC-A를 플로팅하여 실행 가능성을 위해. 생존 가능한 세포는 최종적으로 특정 표면 마커 CD11c에 대해 분석되었습니다. (B) 37°C 및 4°C(암-면역 주기의 1-3단계)에서 PKH67 표지, UV 방사선 조사된 MCA205 암세포의 자가사멸체를 삼키는 CD11c+ DC의 능력에 대한 mFC 분석. 대표적인 이중파라미터 플롯 및 CD11c+PKH67+ 세포 백분율을 보여주는 히스토그램(개별 데이터 포인트가 있는 평균 ± s.e.m., 3개 중 1개의 대표 실험이 표시됨). (C) 식균작용 전후 DC에서 늑골 및 면역 관문 리간드 표면 분자의 mFC 분석(각각 DCN 및 DCPHAGO, 암-면역 주기의 4단계). 히스토그램은 CD11c+CD86+, CD11c+MHC-II+ 및 CD11c+PDL1+ 세포의 백분율(평균 ± s.e.m. 및 개별 데이터 포인트, n = 3개의 독립적인 실험)을 나타냅니다. (B) Welch의 보정을 사용한 쌍을 이루지 않은 양측 스튜던트 t-검정과 4°C. (C) 쌍을 이루지 않은 양측 스튜던트 t-검정과 DCN을 비교한 이 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/66729fig02large.jpg" target="_blank">그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66729/66729fig03.jpg"> 그림 3: CD8 T 세포 증식 및 교차 프라이밍 후 암세포로의 이동. (A) CD3+CD8+ T 세포 분석을 위한 게이팅 전략. mFC 수집 및 데이터 분석 중에, 샘플은 FSC-A 및 SSC-A를 플로팅하여 형태학을 위해 (1) 순차적으로 게이트되었습니다. (2) FSC-A 및 FSC-H를 플로팅하여 단일항의 경우; (3) Aqua 및 SSC-A를 플로팅하여 생존력을 위해. 특이적 증식 EdU 염색을 위해 생존 가능한 세포를 최종적으로 분석했습니다. (B) EdU 기술을 이용한 CD8 T 세포의 클론 확장에 대한 mFC 분석(암-면역 주기의 5단계). 단일모수 히스토그램은 증식하는 EdU+ naive 및 cross-primed CD8 T 세포(각각 CD8N 및 CD8C-P)의 비율(개별 데이터 포인트의 경우 3개 중 하나의 대표 실험이 표시됨)의 백분율(개별 데이터 포인트의 평균 ± s.e.m.)을 나타냅니다. (씨,디) TME로 귀환하는 CD8 T 세포의 ToC 미세유체 모델(암-면역 주기의 6단계). (C) 목차의 개략적인 평면도. 면역 세포와 암 세포를 수용하는 두 개의 측면 배양 챔버는 미크론 크기의 채널(너비 = 12μm, 길이 = 10μm, 높이 = 10μm)로 연결되어 있습니다. 세포 배양 구획은 너비 1mm, 길이 8mm, 높이 100μm입니다. 타임랩스 기록 중에 생성된 현미경 사진은 서로 다른 시점(0-72시간, 눈금 막대, 100μm)에서 CD8C-P 가 암세포로 이동하는 것을 나타냅니다. (D) 24-72시간 이내에 표적 암세포(검은 반점)를 향한 개별 CD8C-P (n = 조건당 100개 세포)의 궤적을 나타내는 플롯이 표시됩니다(눈금 막대, 10μm). (A) Welch의 보정을 사용한 쌍을 이루지 않은 양측 스튜던트 t-검정과 CD8N. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/66729fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66729/66729fig04.jpg"> 그림 4: 살아있는 암세포로 재자극한 후 CD8 T 세포 종양 반응성. (A) 최대 72시간까지 암에 의해 제시된 Ags(CD8E)(암-면역 주기의 7단계)에 의해 재자극된 CD8 T 세포에서 CD44, CD25 활성화 마커의 표면 발현 수준에 대한 mFC 분석. 48시간 및 72시간에서 CD8 N, CD8 C-P, CD8 E의 CD44+CD25+ CD8 T 세포 백분율을 보여주는 대표적인 이중파라미터 플롯 및 히스토그램(평균 ± s.e.m. 및 개별 데이터 포인트, n = 3개의 독립적인 실험). (B) CD8E에서 종양 반응성 마커 CD137의 막 발현에 대한 mFC 분석. 대표적인 이중파라미터 플롯 및 48시간 및 72시간에서 CD8N, CD8C-P, CD8E의 CD137+ CD8 T 세포 백분율을 보여주는 히스토그램(평균 ± s.e.m. 및 개별 데이터 포인트, 3개 중 1개의 대표 실험이 표시됨). (ᅡ,나) 일반 일원 분산 분석 검사 후 CD8N과 비교한 Bonferroni의 보정. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/66729fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66729/66729fig05.jpg"> 그림 5: Grz-B 및 IFN-γ의 CD8 T 세포 생산 (A) CD8E에서 Grz-B의 세포 내 발현 수준에 대한 mFC 분석(암-면역 주기의 7단계). 48시간 및 72시간에서 CD8N, CD8C-P, CD8E의 Grz-B+ CD8 T 세포 MFI를 보여주는 대표 히스토그램 플롯(평균 ± s.e.m. 및 개별 데이터 포인트, n = 3개의 독립적인 실험). (B) CD8E에 대한 세포 내 IFN-γ의 mFC 분석. 48시간 및 72시간에서 CD8N, CD8C-P, CD8E의 IFN-γ+ CD8 T 세포 백분율을 보여주는 대표 히스토그램 플롯(평균 ± s.e.m. 및 개별 데이터 포인트, n = 3개의 독립적인 실험). (A,B)입니다. 일반 일원 분산 분석 검사 후 CD8N과 비교한 Bonferroni의 보정. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/66729fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66729/66729fig06.jpg"> 그림 6: CD8 T 세포 매개 종양 사멸. (A) 72시간의 공동 배양 후 CD8E에 의해 유도된 CD45- 세포 사멸의 mFC 분석(암-면역 주기의 7단계). 히스토그램은 죽어가는 PI+CD45− 세포의 백분율(평균 ± s.e.m. 및 개별 데이터 포인트, n = 3개의 독립 실험)을 나타냅니다. (B) CD8E 매개 암세포 사멸의 생세포 분석. 대표적인 사진과 죽어가는 암세포와 죽은 암세포에 의한 Cytotox Red의 통합을 보여주는 플롯(3개 중 1개의 대표적인 실험이 표시됨). (A) 암세포 단독(CTR)과 비교한 쌍을 이루지 않은 양측 학생 t-검정. (B) 양측 Mann-Whitney 검정과 CTR 비교. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/66729fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 1: 히스토그램 플롯은 CD95+TCR-β+ CD8N 및 CD8C-P의 MFI를 나타냅니다. 쌍을 이루지 않은 양측 스튜던트 t-검정과 CD8N. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/Suppl.%20Figure%201_revised.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 2: CD8 T 세포 활성화. (A) CD8E에서 초기 CD69 활성화 마커의 표면 발현 수준에 대한 mFC 분석(암-면역 주기의 7단계). 대표적인 이중파라미터 플롯 및 48시간 및 72시간에서 CD8N, CD8C-P, CD8E의 CD69+ CD8 T 세포 백분율을 보여주는 히스토그램(평균 ± s.e.m. 및 개별 데이터 포인트, 3회 중 1회 실험). (B) CD8E에서 CD107a 리소좀 관련 단백질의 막 발현에 대한 mFC 분석. 48시간 및 72시간에서 CD8 N, CD8 C-P, CD8 E의 CD107a+ CD8 T 세포 백분율을 보여주는 대표적인 이중파라미터 플롯 및 히스토그램(평균 ± s.e.m. 및 개별 데이터 포인트, 3개 중 1개의 대표 실험이 표시됨). (A,B)입니다. 일반 일원 분산 분석 검사 후 CD8N과 비교한 Bonferroni의 보정. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/Suppl.%20Figure%202_revised%20.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 표 1 : 항체의 혼합 단계 3.3.2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/Supplementary%20Table%201.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

여기에서는 암-면역 주기를 구성하는 단계를 모니터링하고 특성화하기 위한 간단하고 빠르며 신뢰할 수 있는 다중 파라메트릭 유세포 분석 및 종양 온 칩 지원 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 실제로, 암과 면역 세포 간의 상호 작용에 대한 철저한 이해는 종양을 능가하고 임상 치료를 안내하는 데 중요한 통찰력을 제공합니다.

암-면역 주기를 재현하기 위한 Co-Culture In Vitro 시스템

Fundamental cancer research and the development of effective counterattack therapies both rely on experimental studies detailing the interactions between ...

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암 연구

Bryostatin의 1/Ionomycin에 의해 종양 반응 T 세포의 생체내 전 확장 및 일반 감마 체인 크린 시토킨 제제

이 비디오에서는 종양 세포 부하가 높은 동안 CAR T 세포의 반복적인 종양 사멸 가능성을 평가하기 위한 반복 종양 챌린지 분석을 시연합니다. 또한, 유세포 분석을 사용하여 CAR T 세포를 분석하여 샘플에서 CAR T 세포의 다양한 하위 집단을 결정할 수 있습니다.

반복성 종양 챌린지 분석: 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포의 반복적 종양 사멸 가능성을 평가하기 위한 체외 배양 분석

종양 개시 세포(TIC)는 재발성이 높고 치명적인 질병인 난소암 치료를 위한 실행 가능한 치료 표적이 될 수 있습니다. 우리는 이 고도의 종양 형성 세포 집단을 풍부하게 하는 배양 조건에 대한 프로토콜을 제시합니다.

난소 암 종양 시작 세포의 생체 농축에

종양 미세환경(TME)을 모방하기 위해 투과성 미다공성 멤브레인 삽입물을 조정했습니다. 이 모델은 혼합 세포 배양으로 구성되며, 형광 태깅 또는 세포 분류를 사용하지 않고 고도로 농축된 개별 세포 집단을 간단하게 생성할 수 있으며, 정상 또는 스트레스 조건에서 TME 내 세포 간 통신을 연구할 수 있습니다.

종양 미세 환경의 모방 : 세포 간 통신을 농축 세포 인구를 생성 및 조사를위한 간단한 방법

여기, 생체 외에서 공동 문화 메서드를 재귀적으로 도전 종양 표적으로 T 세포, antitumor T 세포 활동의 phenotypic 및 기능 분석에 대 한 수 있습니다 설명 합니다.

체 외 종양 세포 Rechallenge 공상 항 원 수용 체 T 세포 Antitumor 기능 예측 평가

제시된 접근은 3D 스페로이드 ascy 및 T 세포 세포 독성에 있는 암 세포 침략을 동시에 평가합니다. 스페로이드는 비계가 없는 아가로즈 멀티 마이크로웰 캐스트에서 생성됩니다. I형 콜라겐 매트릭스에 공동 배양 및 포함은 암세포 침입 및 T세포 중재 세포 독성을 모니터링할 수 있는 동일한 장치 내에서 수행된다.

3D 배양에서 암 세포 침략 및 T 세포 세포 독성 을 감시

면역 요법 및 단일 세포 게놈 프로파일링 시대에 암 생물학은 적절한 시공간 맥락에서 종양-면역 인터페이스를 조사하기 위한 새로운 시험관 내 및 전산 도구를 필요로 합니다. 우리는 2D 및 3D 설정에서 종양 면역 미세유체 공동 배양을 활용하기 위한 프로토콜을 설명하며, 세포 기능의 동적 다중 매개변수 모니터링과 호환됩니다.

in vitro 종양 미세환경에서 면역 반응을 해부하기 위한 미세유체 공동 배양 모델

본 프로토콜은 전처리된 종양 세포를 사용한 동종 공동 배양 시스템에서 인간 T 세포 자극의 생체 외 분석을 가능하게 하는 실험 워크플로우를 설명합니다.

전처리된 종양 세포의 동종 공동 배양 환경에서의 인간 T 세포 활성 분석

이 프로토콜은 종양 침윤 림프구(TIL)와 공동 배양된 환자 유래 대장암(CRC) 오가노이드 모델을 만들어 이들의 상호 작용과 치료 잠재력을 연구하는 방법을 설명합니다. 이 모델은 종양 미세환경에서 면역 반응을 탐색하고 맞춤형 CRC 치료를 위한 TIL 기반 요법의 효능을 예측할 수 있는 전임상 플랫폼을 제공합니다.

환자 유래 대장직장 종양 오가노이드(Patient-derived Colorectal Tumor Organoids)와 종양 침윤 림프구(TIL)의 공동 배양 시스템 구축

이 프로토콜은 전사 인자 PU.1, IRF8 및 BATF3의 강제 발현을 통해 마우스 암세포를 종양 미세 환경 내에서 유형 1 수지상 유사 세포로 생 체 내 재프로그래밍하는 것을 설명합니다.

종양 세포를 제1형 기존의 수지상 세포 유사 세포로 다루기 쉬운 생체 내 재프로그래밍

배우세요 암-면역 주기를 재현하는 Co-Culture In Vitro 시스템을 통해 종양 미세환경에서 암세포와 면역세포의 상호작용을 분석하는 방법을. 이 프로토콜은 면역 감시와 회피 메커니즘 균형을 이해하는 데 활용됩니다.

암-면역 주기를 재현하기 위한 Co-Culture In Vitro 시스템

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