Name: Light Sheet Microscopy Imaging and Mounting Strategies for Early Zebrafish Embryos (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-19T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: 배우세요 라이트 시트 현미경을 이용한 초기 제브라피쉬 배아의 고해상도 실시간 이미징 및 샘플 마운팅 전략입니다. 세포 수준 해상도로 배아 발달 과정을 관찰하며 광독성을 최소화합니다.

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<meta charset="utf8"></head><body>제브라피시 배아를 위한 개선된 Multiview Light Sheet Microscopy 프로토콜

<ol><li>Wan, Y., McDole, K., Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+microscopy+and+its+potential+for+understanding+developmental+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Light sheet microscopy and its potential for understanding developmental processes.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 35, 655-681 (2019).</li>
<li>Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+zebrafish+early+embryonic+development+by+scanned+light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy.</a> Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).</li>
<li>Keller, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((high-contrast+imaging+of+animal+development+with+scanned+light+sheet-based+structured-illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">high-contrast imaging of animal development with scanned light sheet-based structured-illumination microscopy.</a> Nat Methods. 7 (8), 637-642 (2010).</li>
<li>Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+morphogenesis%3A+Technological+advances+and+biological+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging morphogenesis: Technological advances and biological insights.</a> Science. 340 (6137), 1234168(2013).</li>
<li>Schmid, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+panoramic+Light+sheet+microscopy+reveals+global+endodermal+cell+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">High-speed panoramic Light sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics.</a> Nat Commun. 4 (1), 2207(2013).</li>
<li>Strnad, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inverted+Light+sheet+microscope+for+imaging+mouse+pre-implantation+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Inverted Light sheet microscope for imaging mouse pre-implantation development.</a> Nat Methods. 13 (2), 139-142 (2016).</li>
<li>McDole, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+toto+imaging+and+reconstruction+of+post-implantation+mouse+development+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">In toto imaging and reconstruction of post-implantation mouse development at the single-cell level.</a> Cell. 175 (3), 859-876 (2018).</li>
<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li>
<li>Krzic, U., Gunther, S., Saunders, T. E., Streichan, S. J., Hufnagel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiview+Light+sheet+microscope+for+rapid+in+toto+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Multiview Light sheet microscope for rapid in toto imaging.</a> Nat Methods. 9 (7), 730-733 (2012).</li>
<li>Preibisch, S., Saalfeld, S., Schindelin, J., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Software+for+bead-based+registration+of+selective+plane+illumination+microscopy+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Software for bead-based registration of selective plane illumination microscopy data.</a> Nat Methods. 7 (6), 418-419 (2010).</li>
<li>Swoger, J., Verveer, P., Greger, K., Huisken, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiview+image+fusion+improves+resolution+in+three-dimensional+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Multiview image fusion improves resolution in three-dimensional microscopy.</a> Opt Express. 15 (13), 8029-8042 (2007).</li>
<li>Swoger, J., Huisken, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+imaging+axis+microscopy+improves+resolution+for+thick-sample+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Lett%22%5BJournal%5D)">Multiple imaging axis microscopy improves resolution for thick-sample applications.</a> Opt Lett. 28 (18), 1654-1656 (2003).</li>
<li>Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilayer+mounting+enables+long-term+imaging+of+zebrafish+development+in+a+light+sheet+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope.</a> Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).</li>
<li>Weber, M., Mickoleit, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilayer+mounting+for+long-term+light+sheet+microscopy+of+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Multilayer mounting for long-term light sheet microscopy of zebrafish.</a> J Vis Exp. (84), e51119(2014).</li>
<li>Naganathan, S. R., Popović, M., Oates, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Left-right+symmetry+of+zebrafish+embryos+requires+somite+surface+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Left-right symmetry of zebrafish embryos requires somite surface tension.</a> Nature. 605 (7910), 516-521 (2022).</li>
<li>Shah, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-scale+imaging+and+analysis+identify+pan-embryo+cell+dynamics+of+germlayer+formation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Multi-scale imaging and analysis identify pan-embryo cell dynamics of germlayer formation in zebrafish.</a> Nat Commun. 10 (1), 5753(2019).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Hörl, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BigStitcher%3A+Reconstructing+high-resolution+image+datasets+of+cleared+and+expanded+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">BigStitcher: Reconstructing high-resolution image datasets of cleared and expanded samples.</a> Nat Methods. 16 (9), 870-874 (2019).</li>
<li>Behrndt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forces+driving+epithelial+spreading+in+zebrafish+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Forces driving epithelial spreading in zebrafish gastrulation.</a> Science. 338 (6104), 257-260 (2012).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+A+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish+%28Danio+Rerio%29%22">The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio)</a>. , University of Oregon Press. (2000).</li>
<li>Icha, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+light+sheet+fluorescence+microscopy+to+image+zebrafish+eye+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Using light sheet fluorescence microscopy to image zebrafish eye development.</a> J Vis Exp. (110), e53966(2016).</li>
<li>Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+high-speed+imaging+of+entire+developing+embryos+with+simultaneous+multiview+Light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview Light sheet microscopy.</a> Nat Methods. 9 (7), 755-763 (2012).</li>
<li>Aigouy, B., Prud'homme, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmentation+and+quantitative+analysis+of+epithelial+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Segmentation and quantitative analysis of epithelial tissues.</a> Methods Mol Biol. 2540, 387-399 (2022).</li>
<li>Mancini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apical+size+and+deltaA+expression+predict+adult+neural+stem+cell+decisions+along+lineage+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Adv%22%5BJournal%5D)">Apical size and deltaA expression predict adult neural stem cell decisions along lineage progression.</a> Science Adv. 9, 7519(2023).</li>
<li>Piscitello-Gomez, R., Mahmoud, A., Dye, N., Eaton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+of+the+timing+of+Drosophila+pupal+wing+morphogenesis+to+external+perturbations%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Sensitivity of the timing of Drosophila pupal wing morphogenesis to external perturbations.</a> bioRxiv. , (2023).</li>
<li>Tsuboi, A., Fujimoto, K., Kondo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+remodeling+of+extracellular+matrix+orients+epithelial+sheet+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Adv%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal remodeling of extracellular matrix orients epithelial sheet folding.</a> Science Adv. 9, 2154(2023).</li>
<li>Fu, Q., Martin, B. L., Matus, D. Q., Gao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+multicellular+specimens+with+real-time+optimized+tiling+Light+sheet+selective+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Imaging multicellular specimens with real-time optimized tiling Light sheet selective plane illumination microscopy.</a> Nat Commun. 7 (1), 11088(2016).</li>
<li>Chen, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lattice+Light+sheet+microscopy%3A+imaging+molecules+to+embryos+at+high+spatiotemporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lattice Light sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution.</a> Science. 346 (6208), 1257998(2014).</li>
<li>York, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deterministic+early+endosomal+maturations+emerge+from+a+stochastic+trigger-and-convert+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Deterministic early endosomal maturations emerge from a stochastic trigger-and-convert mechanism.</a> Nat Commun. 14 (1), 4652(2023).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Melançon, E., Liu, D. W. C., Westerfield, M., Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathfinding+by+identified+zebrafish+motoneurons+in+the+absence+of+muscle+pioneers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pathfinding by identified zebrafish motoneurons in the absence of muscle pioneers.</a> J Neurosci. 17 (20), 7796(1997).</li>
<li>Rohde, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-autonomous+timing+drives+the+vertebrate+segmentation+clock%27s+wave+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Cell-autonomous timing drives the vertebrate segmentation clock's wave pattern.</a> eLife. , 13:RP93764 (2024).</li>
<li>Haynes, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KLC4+shapes+axon+arbors+during+development+and+mediates+adult+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">KLC4 shapes axon arbors during development and mediates adult behavior.</a> eLife. 11, e74270(2022).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>아가로스, 저겔화 온도</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘 이수화물</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12022</td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td></td><td></td><td>버전: ImageJ 1.54f</td></tr><tr><td>라텍스 비드, 카르복실레이트 변성 폴리스티렌, 형광 적색, 0.5 &mu; m mean particle size, aqueous suspension</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3280</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate heptahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2773</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription kit</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>AM1340</td><td>For in vitro transccription of H2A-mCherry plasmid</td></tr><tr><td>Potassium Chhloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>PTFE 슬리브 AWG 15L - 1.58 mm ID x 0.15 mm 벽 +/-0.05&nbsp;</td><td>Adtech, 불소수지</td><td>STW15</td><td>PTFE 튜브</td></tr><tr><td>, 염화나트륨</td>, <td>시그마-알드리치</td>, <td>S3014</td><td></td></tr>, <tr><td>인산나트륨, 이염기성</td><td>시그마-알드리치</td>, <td>71640</td><td></td></tr>, <tr><td>초음파 세척기</td>, <td>Labman,</td><td>LMUC3</td>, <td>초음파기</td></tr><tr><td>, Zeiss, LightSheet 7, 시스템</td><td>, Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

light sheet microscopy imaging and mounting strategies for early zebrafish embryos

Light Sheet Microscopy Imaging and Mounting Strategies for Early Zebrafish Embryos

정확한 방식으로 샘플의 방향을 지정하는 것은 현미경 설정을 효율적으로 사용하는 데 있어 중요한 부분입니다. 그러나 튜브에서 샘플을 준비해야 하는 요구 사항을 감안할 때 멀티뷰 라이트 시트 시스템을 사용할 때 샘플의 방향을 수동으로 지정하는 것이 불가능한 경우가 많습니다. 따라서 배아가 융모막 내에서 차지하는 정형화된 위치가 있는지 확인하기 위해 제브라피시 배아를 70% 에피볼리(수정 후 약 7시간)로 이미징했는데, 이는 위축에서 초기 소마이트 단계까지의 타임랩스 이미징이 이 연구의 초점이었기 때문입니다. 70% epiboly에서 이미징하기 직전에 샘플을 준비했을 때, 배아는 샘플에서 자주 관찰되는 특정 방향이 나타나지 않았습니다. 이는 종종 바람직하지 않기 때문에 샘플은 위형성 훨씬 전에 준비하고 이미징이 시작될 때까지 적절한 온도의 미세 원심분리기 튜브에 보관했습니다. 이러한 조건 하에서, 70%의 에피볼리(epiboly)에서(N=3; n=87 배아), 배아 배향은 (1) 배아의 동물-식물(AV) 축이 고분자 튜브의 장축에 직교하는 경우, (2) AV 축이 고분자 튜브의 장축에 평행할 때 수직(Vertical), 및 (3) 비스듬한 배아(Oblique)로 분류할 수 있으며, AV 축이 예각일 때(그림 3A). 수평 위치는 가장 적게 나타났지만 수직 및 경사 위치는 동일하게 관찰되었습니다(그림 4).
배아가 튜브에 남아 있을 때, 배아는 90%의 에피볼리(epiboly)가 될 때까지 각각의 위치에서 안정적이었으며, 그 후에는 대부분의 배아가 방향을 변경했습니다. 따라서, 변화된 배향을 설명하기 위해 배아 발생의 새싹 단계(약 10 hpf)에서의 배향에 대한 두 번째 문서화가 필요했습니다. 이것은 독립적으로 준비된 샘플에 대해 수행되었습니다. 초기 소마이트 단계를 이미징하기 위해, 폴리머 튜브의 장축에 직교하는 notochord를 가진 배아가 축(15)을 따라 형성되는 여러 양측 소마이트를 시각화할 수 있기 때문에 이상적인 방향이라고 이전에 보고되었습니다. 위축(gastrulation) 전에 샘플을 준비했을 때(N = 3, n = 93 배아), 약 25%의 배아가 이러한 배향을 보였으며(그림 4), 이들 배아는 이전 보고와 일치하는 적어도 8-솜 단계까지 이 배향에서 안정적으로 유지되었다15. 나머지 배아는 새싹 단계에서 다양한 다른 방향을 나타냈다( 그림 3B 및 그림 4로 분류됨). 그러나 그들 중 많은 사람들이 초기 소마이트 형성 동안 수평 위치로 방향을 바꿨습니다. 흥미롭게도, 비슷한 비율의 배아가 샘플이 위암 형성 전에 준비되었는지, 70% 에피볼리에서 준비되었는지, 또는 새싹 단계 직전에 준비되었는지에 관계없이 새싹 단계에서 수평 방향을 나타냈습니다. 따라서, 시료 전처리 시기는 70% epiboly에서 이미징에서 관찰된 것과 달리 somite stages를 이미징하기 위한 관심의 수평 방향에 덜 중요한 것으로 보입니다.
멀티뷰 시스템의 장점은 동일한 샘플을 여러 각도에서 볼 수 있다는 것입니다. 그러나, 언급된 단계에 있는 제브라피시 배아의 경우, 전체 배아에 걸쳐 세포 해상도를 얻기 위해 필요한 뷰의 수는 명확하지 않습니다. 이를 특성화하기 위해 검출 암에서 줌 팩터 1의 20x/1 NA 대물렌즈를 사용하여 제브라피시 배아를 이미지화했으며, 이는 4.57μm의 광시트 두께에 해당합니다. 이러한 설정에서 배아는 6.5μm의 픽셀 크기와 1920 x 1920 픽셀의 영역으로 sCMOS 카메라의 전체 시야를 커버했습니다. 액틴 필라멘트(Utr-GFP)를 표시한 형질전환 라인에서 얻은 1세포 단계 배아에서 히스톤 태그 형광단(H2A-mCherry)에 대한 mRNA를 미세주입하면 배아의 핵과 세포막을 모두 시각화할 수 있습니다. 각도 간격이 다른 배아의 멀티뷰 융합을 수행하기 위해, 이중 형질전환 배아와 튜브 내 비드의 360° 획득을 각 각도에서 약 100개의 절편과 2μm의 절편 간격으로 30°(n = 70% epiboly에서 3개의 배아, n = 3개의 배아) 간격으로 수행했습니다. 이미지 처리 중 다른 각도를 건너뛸 수 있기 때문에 30° 및 45° 획득은 60° 및 90° 데이터 세트를 추가로 제공했습니다.
그런 다음 획득된 이미지를 비드 정보를 사용하여 등록하고, 등록 세부 정보를 프로토콜 섹션에 설명된 대로 배아 데이터 세트로 전송했습니다. BigStitcher 플러그인을 사용한 성공적인 정합은 90° 데이터 세트를 제외한 다양한 수집에 대해 달성되었는데, 이는 각 각도에서 샘플의 적용 범위가 적기 때문일 수 있습니다. 이를 극복하기 위해 배아를 각 각도에서 약 400개의 절편과 2μm의 절편 간격으로 90°마다 이미징했으며, 70% 에피볼리 단계와 새싹 단계 모두에서 성공적으로 등록되었습니다(각 단계에 대해 n = 3개의 배아).
다음 단계는 등록된 데이터 세트의 멀티뷰 융합 및 디콘볼루션을 수행하는 것이었습니다. 이 작업은 계산 속도를 높이기 위해 4배 다운샘플링으로 수행되었습니다. 개별 보기와 다중 보기로 재구성된 배아의 핵 표현에서 볼 수 있듯이(그림 5), 개별 보기는 더 작은 시야를 커버하며, 융합 시 전체 배아의 이미지를 산출합니다. 표현을 위해 피지 기반 플러그인인 Mastodon(https://github.com/mastodon-sc/mastodon)을 사용하여 핵을 감지했으며, 이는 피지의 "도움말" 메뉴의 "업데이트 사이트 관리" 섹션에 추가할 수 있으며 추가된 플러그인 메뉴에서 액세스할 수 있습니다. 탐지를 위해 먼저 각 이미지를 XML/hdf5 형식으로 변환한 다음 DoG 검출기(직경 6μm 및 품질 임계값 80)와 함께 Mastodon의 '탐지' 플러그인을 사용하여 핵 탐지를 수행했습니다.
다양한 융합 이미지 중에서 90° 데이터 세트는 샘플 깊숙한 곳에서 매우 높은 배경을 보여 정량화를 수행하기에 적합하지 않았습니다. 따라서,다른 연구에서 90° 간격으로 자주 이미징된 Drosophila 배아와 같은 작은 샘플과 달리9,22, 20x/1 NA objective를 사용하여 초기 제브라피시 배아를 이미징하는 데는 동일한 것이 권장되지 않습니다. 30°, 45° 및 60° 융합 데이터 세트 간에 정성적으로 핵 정보에는 큰 차이가 없었습니다(그림 6B, 상단 행). 그러나 세포 경계와 같은 더 미세한 구조는 나머지 부분에 비해 30° 융합 데이터 세트에서 훨씬 더 잘 해결된 것으로 나타났습니다(그림 6C, 상단 행).
이 관찰을 확인하기 위해 Mastodon을 사용하여 30°, 45° 및 60°마다 이미징하여 얻은 융합 이미지에서 핵을 감지했습니다. 배아 표면에서 각각 20μm(그림 6A), 50μm 및 100μm 깊이에 하나씩 융합된 이미지의 3개 영역을 분석을 위해 선택했습니다. 이미지 전반에 걸쳐 핵 검출의 효율성을 비교하기 위해, 검출은 위에서 설명한 대로 수행되었으며, 서로 다른 각도 간격의 융합 이미지에서 동일한 파라미터를 사용했습니다. 분석된 모든 영역에서 30°, 45° 또는 60°마다 이미징하여 얻은 융합 이미지에 관계없이 모든 핵이 검출되었습니다(그림 6B, 하단 행). 따라서, 핵과 같은 구상 구조는 정보의 손실 없이 위의 각도 간격 중 어느 것에서나 이미지화될 수 있다.
세포 경계를 분석하기 위해, 세포 24,25,26을 분할하기 위해 일상적으로 사용되는 FIJI 플러그인인 Tissue Analyzer23이 사용되었다. Mastodon과 마찬가지로 Tissue Analyzer 플러그인은 FIJI의 "도움말" 메뉴의 "업데이트 사이트 관리" 섹션에 추가할 수 있으며 추가된 플러그인 메뉴에서 액세스할 수 있습니다. 세포 경계는 기본 매개변수와 조직 깊이에 따라 1.5에서 2 사이의 강한 블러와 1의 약한 블러를 사용하여 watershed 알고리즘을 사용하여 분할되었습니다. 이러한 매개변수는 모든 분석에서 일정하게 유지되어 간단한 비교가 용이했습니다. 분할된 이미지를 원본 입력 이미지와 수동으로 비교했을 때 소프트웨어가 셀 경계를 감지하지 못하거나 존재하지 않는 셀 경계를 그리는 오류가 관찰되었습니다(그림 6C, 하단 행). 조직 분석기 플러그인에 의해 발생한 오류 수는 해당 영역에서 감지된 총 결합 수로 정규화되어 '경계 분할 오류'로 계산되었습니다. 이러한 오류는 분석된 모든 영역에 존재했지만, 45° 및 60° 각도 간격으로 이미징하여 얻은 융합 이미지에서 오류 수가 30°에 비해 크게 증가했습니다(그림 6D). 이는 각도 간격이 증가할 때 융합된 이미지의 해상도가 점점 더 나빠졌다는 것을 나타냅니다. 따라서 셀 경계와 같은 더 미세한 구조를 분할하기 위해 더 촘촘한 각도 간격을 사용하면 다운스트림 처리가 더 쉬워집니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66735/66735fig01.jpg"> 그림 1: 폴리머 튜브를 사용한 시료 전처리. (A) 저장된 미세 원심분리기 튜브에서 폴리머 튜브를 겸자를 사용하여 채취합니다. (B) 튜브를 200μL 마이크로피펫의 팁에 부착합니다. (C) 피펫을 사용하여 배아를 튜브에 흡인합니다. (D,E) 튜브 바닥을 향해 볼 수 있는 새싹 단계 배아가 있는 폴리머 튜브. (F) 폴리머 튜브를 E3가 있는 페트리 접시에 놓아 아가로스를 응고시킵니다. (G) E3로 채워진 마이크로 원심 분리기 튜브에 폴리머 튜브를 보관합니다. (H) 장착된 폴리머 튜브가 있는 조립된 샘플 홀더. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66735/66735fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66735/66735fig02.jpg"> 그림 2: 멀티뷰 이미지 분석 워크플로우 및 비드를 사용한 정합. (A) 멀티뷰 이미지 분석 파이프라인입니다. (B) 이미지는 FIJI 플러그인인 BigStitcher의 "Multiview Explorer" 창을 보여주며, 각 보기는 단일 행으로 표시되며 각도, 채널, 정합, 관심 포인트 및 PSF에 대한 정보를 포함합니다. 프로토콜에서 설명하는 모든 명령은 팝업 메뉴에 표시된 대로 보기를 선택한 다음 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하면 나타납니다. 선택한 뷰는 그림과 같이 BigDataViewer 창에서 시각화할 수 있습니다. (C) 30° 각도 간격으로 이미징하여 얻은 등록 전(왼쪽)과 후(오른쪽)의 대표적인 비드 이미지. 모든 각도 뷰가 선택되고 표시되었습니다. 스케일 바: 75 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66735/66735fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66735/66735fig03.jpg"> 그림 3: 기본 배아 방향의 개요. 70%의 에피볼리(epiboly, A) 및 새싹 단계(B)에서 배아가 융모막 내에 속하는 방향의 대표 이미지. 각 패널의 맨 윗줄은 라이트 시트 시스템에서 얻은 명시야 이미지를 나타내고 맨 아래 줄은 대표적인 만화를 나타냅니다. (B)의 화살표는 방향을 식별하는 데 사용된 notochord의 위치를 나타냅니다. AP, 동물 극; Vp, 식물 극; A, 전방; P, 후방. 스케일 바: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66735/66735fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66735/66735fig04.jpg"> 그림 4: 다양한 배아 방향의 통계. (A) 누적 열은 위축법 전에 샘플을 준비할 때 70% 에피볼리에서 표시된 방향으로 떨어지는 배아의 백분율을 나타냅니다. (B) 누적된 열은 위형성 전에 샘플을 준비할 때 새싹 단계(왼쪽), 70% 에피볼리(가운데) 및 새싹 단계(오른쪽)에서 표시된 방향으로 떨어지는 배아의 백분율을 나타냅니다. N, 배아가 얻어진 독립적인 클러치의 수; n, 배아의 총 수입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66735/66735fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66735/66735fig05.jpg"> 그림 5: multiview reconstructed embryo의 핵 표현. (ᅡ)3D 산점도는 30̛° 각도 간격으로 이미징된 멀티뷰로 재구성된 배아에서 검출된 핵을 나타냅니다. 각 원은 핵을 나타내고 핵 위치의 중심이 표시됩니다. 핵 좌표는 FIJI 플러그인인 Mastodon을 사용하여 얻었습니다. (B) 동일한 배아에 대한 세 가지 대표적인 보기에서 얻은 핵의 3D 산점도 - 묘사는 60° 떨어져 있습니다. 각 핵의 색상은 무작위로 할당되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66735/66735fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66735/66735fig06.jpg"> 그림 6: 융합 이미지의 세포 규모 정보 비교. (A) 왼쪽 이미지는 표면에서 20μm 깊이에서 멀티뷰로 재구성한 배아의 스냅샷을 보여줍니다. 노란색 원은 추가 분석에 사용되는 영역을 나타냅니다. 스케일 바: 50 μm(모든 패널에서). (B) 각각 30°, 45°, 60°마다 이미징된 3개의 데이터 세트에서 배아 표면에서 20μm 깊이에 있는 핵의 대표적인 원시 이미지(상단). FIJI 플러그인인 Mastodon에 의해 동일한 이미지에서 검출된 핵(녹색)(아래). (C) 액틴 마커인 Utr-GFP(상단)를 사용하여 각각 30°, 45° 및 60°마다 이미징된 3개의 데이터 세트에서 배아 표면에서 20μm 깊이의 대표적인 원시 이미지. FIJI 플러그인인 Tissue Analyzer에 의해 분할된 경계는 동일한 이미지에 대해 표시됩니다(하단). 화살표는 경계 분할 시 조직 분석기에 의해 발생한 오류를 나타내며, 노란색 화살표는 경계가 누락되었음을 나타내고 흰색 화살표는 시각적으로 경계가 없는 것처럼 보일 때 잘못 감지된 경계를 나타냅니다. (D) 상자 그림은 서로 다른 깊이에서 30°, 45° 및 60°마다 이미징된 멀티뷰 재구성 배아 간에 조직 분석기가 만든 오류의 백분율을 나타냅니다. 오차 막대는 사분위수 범위의 1.5배를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66735/66735fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Light sheet microscopy has become the methodology of choice for live imaging of zebrafish embryos over long time scales with minimal phototoxicity. In ...

light-sheet-microscopy-imaging-mounting-strategies-for-early

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 기사는 광시트 형광 현미경 검사를 위한 시료 준비에 대해 설명합니다. 또한 장기 이미징을 위해 살아있는 제브라피시 배아를 장착하는 방법을 보여주며, 이를 통해 거의 생리학적 조건에서 살아있는 배아의 긴 타임랩스 동영상을 녹화할 수 있습니다.

광시트 현미경 시료 전처리: 장기 이미징을 위한 살아있는 제브라피시 배아 장착

제브라 피쉬의 개발은 배아가 낮은 농도의 아가로 오스와 광학적으로 명확한 폴리머 튜브에 포함 된 빛 시트 현미경과 일에 따라 할 수있다.

다층 제브라 피쉬의 장기 라이트 시트 현미경에 장착

광시트 형광 현미경은 배아 발달을 이미징하기 위한 훌륭한 도구입니다. 이를 통해 생리학적 조건에 가까운 살아있는 배아의 장시간 타임랩스 동영상을 녹화할 수 있습니다. 우리는 넓은 시공간 규모에 걸쳐 제브라피시 눈 발달을 이미징하기 위한 응용 프로그램을 시연하고 다중 보기 데이터 세트의 융합 및 디콘볼루션을 위한 파이프라인을 제시합니다.

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여기에서는 정상적인 발달을 방해하지 않고 살아있는 제브라피시 배아의 후체 발달을 장기간 타임 랩스 이미징할 수 있는 다목적 장착 방법을 제시합니다.

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이 문서에서는 연장된 시간 경과 공초점 현미경 검사법을 위해 깨지기 쉬운 제브라피시 배아를 장착하는 방법에 대해 설명합니다. 이 저가형 방법은 모든 반전된 현미경에 이미징을 위해 일반 유리 바닥 현미경 접시를 사용하여 쉽게 수행할 수 있습니다. 장착은 다른 농도에서 아가로즈의 층에서 수행됩니다.

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광 시트 기반 형광 현미경 검사는 발달 생물학에서 가장 가치있는 도구입니다. 비교 연구의 주요 문제는 주변 분산입니다. 우리의 프로토콜은 여러 표본의 동시 라이브 이미징을위한 실험 프레임 워크를 설명하고, 따라서, 적극적으로이 문제를 해결.

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여기서, 결과 데이터를 분석하기 위해 상용화된 라이트시트 현미경 및 이미지 프로세싱 워크스테이션을 이용한 안구 형태형성의 타임랩스 이미징을 위한 프로토콜이 제공된다. 이 프로토콜은 배아 마취, 낮은 용융 온도 아가로스에 매립, 이미징 챔버에 서스펜션, 이미징 매개 변수 설정, 마지막으로 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 이미징 데이터를 분석하는 절차를 자세히 설명합니다.

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우리는 빛 시트 형광 현미경 검사법과 생체 내 제브라피시 심장을 연구하는 최적화 된 도구를 설명합니다. 특히, 우리는 밝은 심장 형질 전환선을 제안하고 발달과 심장 결함을 피하는 새로운 부드러운 임베드 및 고정 기술을 제시합니다. 심장 이미징에 적응된 가능한 데이터 수집 및 분석 파이프라인도 제공됩니다.

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여기에 기재된 방법은 초점 및 평면 드리프트를 보정하는 광학 절편 및 재조정 간단한 전략을 수행 할 해부 현미경 형광을 사용하여 제브라 피쉬 배아 장기 발전 경과 분석을 허용한다.

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여기에서는 투과광과 형광 현미경을 사용하여 타임 랩스 이미징을 위해 병아리 배아를 배양하는 새로운 기술을 소개합니다. 수중 여과지 샌드위치는 액체 배양 배지에 완전히 잠긴 병아리 배아를 배양할 수 있는 잘 정립된 여과지 운반 기법1의 변형입니다.

장기를위한 잠수 필터 종이 샌드위치 예 비켜 시간 경과 영상

배우세요 라이트 시트 현미경을 이용한 초기 제브라피쉬 배아의 고해상도 실시간 이미징 및 샘플 마운팅 전략입니다. 세포 수준 해상도로 배아 발달 과정을 관찰하며 광독성을 최소화합니다.

Light Sheet Microscopy Imaging and Mounting Strategies for Early Zebrafish Embryos

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