Name: 급성 LCMV에 감염된 마우스에서 바이러스 특이적 여포 도우미 CD4+ T 세포의 조기 분화에 접근 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 3 s
Description: 배우세요 급성 LCMV 감염 마우스에서 바이러스 특이적 여포 도우미 CD4+ T 세포의 조기 분화를 평가하는 방법을. 유전자 조작과 유세포 분석 기법을 활용하여 T 세포 활성화 메커니즘을 탐구하고 백신 설계 최적화에 기여합니다.

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이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (No. 32300785에서 X.C.까지), 중국 국가 혁신 인재 박사 후 과정 (No. BX20230449 to X.C.), 국가 과학 기술 전공 프로젝트(No. 2021YFC2300602 to L.Y.).

급성 LCMV 감염에서 Early Follicular Helper T-Cell Commitment의 해독

<ol><li>O'shea, J. J., Paul, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+underlying+lineage+commitment+and+plasticity+of+helper+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mechanisms underlying lineage commitment and plasticity of helper CD4+ T cells.</a> Science. 327 (5969), 1098-1102 (2010).</li>
<li>Crotty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+follicular+helper+cell+biology%3A+A+decade+of+discovery+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">T follicular helper cell biology: A decade of discovery and diseases.</a> Immunity. 50 (5), 1132-1148 (2019).</li>
<li>Vinuesa, C. G., Linterman, M. A., Yu, D., Maclennan, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+helper+t+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Follicular helper t cells.</a> Annu Rev Immunol. 34, 335-368 (2016).</li>
<li>Choi, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ICOS+receptor+instructs+T+follicular+helper+cell+versus+effector+cell+differentiation+via+induction+of+the+transcriptional+repressor+bcl6%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">ICOS receptor instructs T follicular helper cell versus effector cell differentiation via induction of the transcriptional repressor bcl6.</a> Immunity. 34 (6), 932-946 (2011).</li>
<li>Choi, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl6+expressing+follicular+helper+CD4+T+cells+are+fate+committed+early+and+have+the+capacity+to+form+memory%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Bcl6 expressing follicular helper CD4 T cells are fate committed early and have the capacity to form memory.</a> J Immunol. 190 (8), 4014-4026 (2013).</li>
<li>Johnston, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl6+and+BLIMP-1+are+reciprocal+and+antagonistic+regulators+of+T+follicular+helper+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bcl6 and BLIMP-1 are reciprocal and antagonistic regulators of T follicular helper cell differentiation.</a> Science. 325 (5943), 1006-1010 (2009).</li>
<li>Nurieva, R. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl6+mediates+the+development+of+T+follicular+helper+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bcl6 mediates the development of T follicular helper cells.</a> Science. 325 (5943), 1001-1005 (2009).</li>
<li>Yu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+repressor+bcl-6+directs+T+follicular+helper+cell+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The transcriptional repressor bcl-6 directs T follicular helper cell lineage commitment.</a> Immunity. 31 (3), 457-468 (2009).</li>
<li>Choi, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LEF1+and+TCF1+orchestrate+T%28FH%29+differentiation+by+regulating+differentiation+circuits+upstream+of+the+transcriptional+repressor+bcl6%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">LEF1 and TCF1 orchestrate T(FH) differentiation by regulating differentiation circuits upstream of the transcriptional repressor bcl6.</a> Nat Immunol. 16 (9), 980-990 (2015).</li>
<li>Wu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TCF1+is+required+for+the+t+follicular+helper+cell+response+to+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">TCF1 is required for the t follicular helper cell response to viral infection.</a> Cell Rep. 12 (12), 2099-2110 (2015).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+TCF-1+initiates+the+differentiation+of+T%28FH%29+cells+during+acute+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The transcription factor TCF-1 initiates the differentiation of T(FH) cells during acute viral infection.</a> Nat Immunol. 16 (9), 991-999 (2015).</li>
<li>Oestreich, K. J., Mohn, S. E., Weinmann, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+that+control+the+expression+and+activity+of+bcl-6+in+th1+cells+to+regulate+flexibility+with+a+TFH-like+gene+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms that control the expression and activity of bcl-6 in th1 cells to regulate flexibility with a TFH-like gene profile.</a> Nat Immunol. 13 (4), 405-411 (2012).</li>
<li>Choi, Y. S., Eto, D., Yang, J. A., Lao, C., Crotty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+STAT1+is+required+for+IL-6-mediated+bcl6+induction+for+early+follicular+helper+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: STAT1 is required for IL-6-mediated bcl6 induction for early follicular helper cell differentiation.</a> J Immunol. 190 (7), 3049-3053 (2013).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histone+methyltransferase+ezh2+primes+the+early+differentiation+of+follicular+helper+T+cells+during+acute+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">The histone methyltransferase ezh2 primes the early differentiation of follicular helper T cells during acute viral infection.</a> Cell Mol Immunol. 17 (3), 247-260 (2020).</li>
<li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ezh2+programs+T%28FH%29+differentiation+by+integrating+phosphorylation-dependent+activation+of+bcl6+and+polycomb-dependent+repression+of+p19ARF%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Ezh2 programs T(FH) differentiation by integrating phosphorylation-dependent activation of bcl6 and polycomb-dependent repression of p19ARF.</a> Nat Commun. 9 (1), 5452(2018).</li>
<li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((METTL3-dependent+m%286%29A+modification+programs+T+follicular+helper+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">METTL3-dependent m(6)A modification programs T follicular helper cell differentiation.</a> Nat Commun. 12 (1), 1333(2021).</li>
<li>Johnston, R. J., Choi, Y. S., Diamond, J., Yang, J. A., Crotty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT5+is+a+potent+negative+regulator+of+TFH+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">STAT5 is a potent negative regulator of TFH cell differentiation.</a> J Exp Med. 209 (2), 243-250 (2012).</li>
<li>Lee, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+KLF2+restrains+CD4%2B+T+follicular+helper+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The transcription factor KLF2 restrains CD4+ T follicular helper cell differentiation.</a> Immunity. 42 (2), 252-264 (2015).</li>
<li>Xiao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+e3+ubiquitin+ligase+itch+is+required+for+the+differentiation+of+follicular+helper+t+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The e3 ubiquitin ligase itch is required for the differentiation of follicular helper t cells.</a> Nat Immunol. 15 (7), 657-666 (2014).</li>
<li>Baumjohann, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microRNA+cluster+mir-17%7E92+promotes+TFH+cell+differentiation+and+represses+subset-inappropriate+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The microRNA cluster mir-17~92 promotes TFH cell differentiation and represses subset-inappropriate gene expression.</a> Nat Immunol. 14 (8), 840-848 (2013).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinase+complex+mTORC2+promotes+the+longevity+of+virus-specific+memory+CD4%28%2B%29+T+cells+by+preventing+ferroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The kinase complex mTORC2 promotes the longevity of virus-specific memory CD4(+) T cells by preventing ferroptosis.</a> Nat Immunol. 23 (2), 303-317 (2022).</li>
<li>Hale, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+memory+CD4%2B+T+cells+with+commitment+to+T+follicular+helper-+and+T+helper+1-cell+lineages+are+generated+after+acute+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Distinct memory CD4+ T cells with commitment to T follicular helper- and T helper 1-cell lineages are generated after acute viral infection.</a> Immunity. 38 (4), 805-817 (2013).</li>
<li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selenium-GPX4+axis+protects+follicular+helper+t+cells+from+ferroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Selenium-GPX4 axis protects follicular helper t cells from ferroptosis.</a> Nat Immunol. 22 (9), 1127-1139 (2021).</li>
<li>Oxenius, A., Bachmann, M. F., Zinkernagel, R. M., Hengartner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-specific+MHC-class+II-restricted+TCR-transgenic+mice%3A+Effects+on+humoral+and+cellular+immune+responses+after+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Virus-specific MHC-class II-restricted TCR-transgenic mice: Effects on humoral and cellular immune responses after viral infection.</a> Eur J Immunol. 28 (1), 390-400 (1998).</li>
<li>Grosjean, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+enrichment+of+mouse+splenic+t+cells+for+ex+vivo+and+in+vivo+T+cell+receptor+stimulation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and enrichment of mouse splenic t cells for ex vivo and in vivo T cell receptor stimulation assays.</a> STAR Protoc. 2 (4), 100961(2021).</li>
<li>Dowling, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+the+bottom-up+proteomic+analysis+of+mouse+spleen%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for the bottom-up proteomic analysis of mouse spleen.</a> STAR Protoc. 1 (3), 100196(2020).</li>
<li>Choi, Y. S., Crotty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+vector+expression+in+TCR+transgenic+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Retroviral vector expression in TCR transgenic CD4+ T cells.</a> Methods Mol Biol. 1291, 49-61 (2015).</li>
<li>Wu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+expansion+and+retroviral+transduction+of+mouse+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A method for expansion and retroviral transduction of mouse regulatory T cells.</a> J Immunol Methods. 488, 112931(2021).</li>
<li>He, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+CXCR5-+expressing+CD8%28%2B%29+T+cells+curtail+chronic+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Follicular CXCR5- expressing CD8(+) T cells curtail chronic viral infection.</a> Nature. 537 (7620), 412-428 (2016).</li>
<li>Crotty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+helper+CD4+T+cells+%28TFH%29%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Follicular helper CD4 T cells (TFH).</a> Annu Rev Immunol. 29, 621-663 (2011).</li>
<li>Breitfeld, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+B+helper+T+cells+express+CXC+chemokine+receptor+5%2C+localize+to+B+cell+follicles%2C+and+support+immunoglobulin+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Follicular B helper T cells express CXC chemokine receptor 5, localize to B cell follicles, and support immunoglobulin production.</a> J Exp Med. 192 (11), 1545-1552 (2000).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinase+mTORC1+promotes+the+generation+and+suppressive+function+of+follicular+regulatory+t+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The kinase mTORC1 promotes the generation and suppressive function of follicular regulatory t cells.</a> Immunity. 47 (3), 538-551 (2017).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phosphatase+pten+links+platelets+with+immune+regulatory+functions+of+mouse+T+follicular+helper+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The phosphatase pten links platelets with immune regulatory functions of mouse T follicular helper cells.</a> Nat Commun. 13 (1), 2762(2022).</li>
<li>Chen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+identification+of+T%28fh%2913+cells+in+mouse+and+human%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric identification of T(fh)13 cells in mouse and human.</a> J Allergy Clin Immunol. 147 (2), 470-483 (2021).</li>
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저자는 상충되는 이해관계가 없음을 선언합니다.

TFH 세포 분야의 연구는 B 세포를 돕는 TFH 세포의 특화된 기능이 발견된 이후 주목을 받았습니다. 축적된 연구는 TFH 세포 분화가 다단계 및 다인자 과정(multistage and multifactorial process)이라는 것을 나타냈다(30), 여기서 TFH 세포 운명 헌신은 초기 단계(early stage5)에서 결정된다. 따라서 조기 분화된 TFH 세포의 기전을 더 잘 이해하는 것은 TFH 세포 생물학 및 합리적인 백신 설계에 매우 중요합니다. 본 연구에서는 LCMV 암스트롱 바이러스 감염 모델, TCR-형질전환 SM 마우스 및 레트로바이러스 매개 형질도입을 활용하여 바이러스 특이적 TFH 세포의 조기 운명 헌신에 접근하고 조기 분화된 TFH 세포의 유전자 발현을 조작하는 방법을 제공하였다.
케모카인 수용체 CXCR5는 TFH 세포를 다른 CD4+ TH 세포 subset 6,7,8,31과 구별하는 중요한 표면 마커이므로 TFH 세포 연구에서 높은 특이성과 민감도를 가진 CXCR5 염색 방법이 필요합니다. 이 연구에서는 TFH 세포 subset을 식별하기 위해 3단계 streptavidin-biotin CXCR5 염색 방법을 선보였습니다(그림 1C). 특이성 손실은 고감도의 2-또는 3-strep 항체 염색 접근법에서 까다로운 문제 중 하나이지만, 감염 후 3일째에 CXCR5-GFP29 reporter SM CD4+ T 세포의 GFP 신호와 3단계 CXCR5 항체 염색에 의한 형광 신호가 거의 완전히 겹치는 것으로 나타났습니다(그림 1D), 3단계 CXCR5 항체 염색법에 의한 특이성과 민감도 모두의 달성을 시사합니다. 실제로, 이 3-strep CXCR5 염색 전략은 검증되고 신뢰할 수 있으며 연구자들이 TFH 세포 생물학 11,14,15,21 및 기타 CXCR5 발현 T 세포 유형29,32를 더 잘 조사하는 데 도움이 되었습니다.
감염 및 면역 시, TFH 세포의 운명 헌신은 일반적으로 naive CD4+ T 세포를 TFH 세포 또는 non-TFH effector TH 세포 2,3,30으로 분기하여 분화하는 방식으로 모델링됩니다. 이 연구는 전달된 SM CD4+ T 세포에서 TFH 및T H1 세포의 균형 잡힌 분기를 보여주었습니다. 더욱이, 이렇게 전달된 SM CD4+ T 세포는 감염 초기 단계에서 적절한 세포량을 가지고 있어 TFH 세포 분화 연구에 적합한 모델로 작용합니다. 확실히, 전달된 SM CD4+ T 세포에서 레트로바이러스 매개 이소성 Bcl-6 발현은 대조군 SM CD4+ T 세포(86.6% 대 53.8%)에 비해 TFH 세포 분화에 강하게 치우쳐 있었으며(그림 3C), 이는 이전 보고서6과 일치하며 연구에서 설명된 프로토콜의 정확성을 더욱 입증합니다. 대안적으로, 전술한 프로토콜은 또한 조기에 활성화된 SM CD4+ T 세포(11)에서 관심 유전자(예를 들어, bcl6, Tcf7)의 레트로바이러스-매개 knock-down에 적용될 수 있다(데이터는 도시되지 않음).
프로토콜의 한 가지 제한 사항은 타이밍 문제(총 2시간 이상)와 3단계 CXCR5 염색 방법의 다단계 프로세스입니다. 대안적으로, 1단계18,33 또는 2단계 4,9,34 CXCR5 염색법도 T FH 세포 연구에 적용하였다. 이러한 CXCR5 염색 방법의 특이성/민감도에 대한 비교가 필요합니다.
요약하면, 본 연구는 초기에 분화된 바이러스 특이적 TFH 세포에 접근하고 잠재적으로 TFH 세포 분화를 조절하는 관심 유전자를 조사하기 위한 프로토콜을 제공했습니다. 이러한 프로토콜은 초기 TFH 세포 운명 약속에 대한 연구를 촉진할 것입니다.

다양한 병원체나 위협에 직면했을 때, 미성숙 CD4+ T 세포는 특화된 기능을 가진 다양한 보조 T(TH) 세포 subset으로 분화하여 면역 반응을 조정합니다1. 급성 바이러스 감염 시나리오에서 naive CD4+ T 세포의 상당 부분은 B 세포 2,3에 도움을 제공하는 여포 도우미 T(TFH) 세포로 분화합니다. 다른 CD4+ TH 세포 subset(예를 들어, TH1, TH2, TH9 및 TH17 세포)와 구별되듯이, TFH 세포는 상당한 수준의 CXCR5를 발현하는데, 이는 B 세포 귀환 chemokine CXCL13에 대한 chemokine 수용체로서, TFH 세포가 B 세포 소낭선으로 이동할 수 있게 한다. B 세포 난포에서 TFH 세포는 생식 중심 반응을 시작하고 유지하는 데 있어 B 세포를 동족 형성을 지원하여 빠른 고친화성 항체 생산과 장기 체액성 기억을 가능하게 합니다 2,3.
급성 바이러스 감염 시, 바이러스 특이적 TFH 세포의 조기 운명 결정은 72 h 4,5 이내에 발생하며, TFH 세포 운명 결정을 관장하는 "마스터 조절자" 역할을 하는 전사 억제 인자 B 세포 림프종-6(Bcl-6)5,6,7,8에 의해 조절됩니다. Bcl-6의 결핍은 TFH 세포 분화를 심각하게 둔화시키는 반면, 이소성 Bcl-6 발현은 TFH 세포 운명 헌신을 실질적으로 촉진합니다. Bcl-6 외에도 여러 분자가 초기 TFH 세포 운명 헌신을 지시하는 데 관여합니다. 전사 인자 TCF-1 및 LEF-1은 Bcl-6 9,10,11의 유도를 통해 TFH 세포 분화를 시작합니다. Bcl-6 및 TCF-1 모두에 의한 Blimp1의 억제는 초기 TFH 세포 운명 헌신11,12에 필요합니다. STAT1 및 STAT3는 초기 TFH 세포 분화에도 필요합니다13. 게다가, 히스톤 메틸전이효소 EZH214,15 및 m6A 메틸전이효소 METTL316에 의한 후성유전학적 변형은 TFH 세포 전사 프로그램(특히 Bcl6 및 Tcf7)을 안정화하는 데 도움이 되므로 초기 TFH 세포 운명 헌신을 촉진합니다. 앞서 언급한 분자 및 다른 분자를 포함한 발전이 다른 곳에서 요약된3, 초기 TFH 세포 운명 헌신의 전사 및 후성유전학적 규칙을 이해하는 데 이루어졌지만, 이전에 알려지지 않은 분자는 학습되어야 할 과제로 남아 있습니다.
급성 림프구성 맥락막염 바이러스(LCMV) 감염의 마우스 모델에서, LCMV 당단백질 에피토프 I-AbGP66-77을 특이적으로 인식하는 입양 전달 동종성 TCR-형질전환 SMARTA(SM) CD4+ T 세포는 바이러스 감염 중에 TFH 또는 TH1 세포 분화를 겪습니다. 이 TFH/TH1 분기 분화 패턴은 바이러스 특이적 TFH 세포의 생물학을 연구하는 데 있어 SM/급성 LCMV 감염 모델의 발전을 지원합니다. 실제로, SM/급성 LCMV 감염 모델은 TFH 세포 연구 분야에서 널리 사용되어 왔으며 TFH 세포 생물학의 이정표적 발견에 중요한 역할을 했습니다. 여기에는 TFH 세포 5,6의 계통 정의 전사 인자로서의 전술한 Bcl-6의 식별뿐만 아니라 T FH 세포분화를 안내하는 다른 중요한 전사 인자(예: Blimp-16, TCF-1/LEF 9,10,11, STAT1/STAT313, STAT517, KLF218 및 Itch19)가 포함되며, TFH 세포 분화, 전사 후 규정( 예를 들어, TFH 세포 분화, TFH 세포 기억 및 가소성21,22, 및 TFH 세포를 표적으로 하는 합리적인 백신 접종 전략(예: 셀레늄23)의 METTL316 및 miR-17~9220)을 포함할 수 있다.
본 연구는 (1) 조기 분화된 TFH 세포에 접근하는 데 적합한 급성 LCMV 감염 SM 키메라 마우스 모델 확립, (2) 조기 분화 TFH 세포와 관련된 분자의 유세포 분석 염색 수행, (3) SM CD4+에서 레트로바이러스 벡터 기반 유전자 조작 수행을 포함하여 바이러스 특이적 TFH 세포의 조기 운명 헌신에 접근하기 위한 재현 가능한 방법을 설명합니다 T 세포. 이러한 방법은 바이러스 특이적 TFH 세포의 조기 운명 헌신을 조사하는 연구에 유용할 것입니다.

<table><tbody><tr><td>0.25% 트립신-EDTA</td><td>코닝</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>4% 파라포름알데히드 고정 용액, 4% PFA</td><td>베요타임</td><td>P0099-500mL</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m 세포 여과기</td><td>Merck</td><td>CLS431751</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 안티 마우스 TCR V&alpha; 2 (클론 B20.1)</td><td>Biolegend</td><td>127812</td><td>1:200 희석</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 700 안티 마우스 CD45.1 (클론 A20)</td><td>Biolegend</td><td>110724</td><td>1:200 희석</td></tr><tr><td>APC 안티 마우스 CD25 (클론 PC61)</td><td>Biolegend</td><td>101910</td><td>1:200 희석</td></tr><tr><td>B6 CD45.1 (B6. SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ) 마우스</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>002014</td><td></td></tr><tr><td>BeaverBeads Streptavidin</td><td>Beaver</td><td>22321-10</td><td></td></tr><tr><td>Biotin anti-mouse F4/80 항체 (clone BM8)</td><td>Biolegend</td><td>123106</td><td>1:200 희석</td></tr><tr><td>Biotin Rat anti-mouse CD11c (클론 N418)</td><td>Biolegend</td><td>117304</td><td>1:200 희석</td></tr><tr><td>Biotin Rat 안티 마우스 CD19 (클론 6D5)</td><td>Biolegend</td><td>115504</td><td>1:200 희석</td></tr><tr><td>비오틴 쥐 안티 마우스 CD8a (클론 53-6.7)</td><td>Biolegend</td><td>100704</td><td>1:200 희석</td></tr><tr><td>비오틴 쥐 안티 마우스 NK-1.1 (클론 PK136)</td><td>Biolegend</td><td>108704</td><td>1:200 희석</td></tr><tr><td>비오틴 쥐 안티 마우스 TER-119 / 에리스로이드 세포 (클론 TER-119)</td><td>Biolegend</td><td>116204</td><td>1:200 희석</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민, BSA</td><td>시그마</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>브릴리언트 바이올렛 421 안티 T-벳 (클론 4B10)</td><td>바이오레전</td><td>드 644816</td><td>1:100 희석</td></tr><tr><td>브릴리언트 바이올렛 605 안티 마우스 CD279 (PD-1) (클론 29F.1A12)</td><td>바이오레전</td>드 <td>135220</td><td>1:200 희석</td></tr><tr><td>C57BL/6J (B6) 마우스</td><td>잭슨 연구소</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>CXCR5-GFP 넉인 리포터 마우스</td><td></td><td></td><td>사내에서; CXCR5-GFP 넉인 마우스 라인은 Cxcr5의 개방형 판독 프레임 뒤에 IRES-GFP 구조를 삽입하여 생성되었습니다.</td></tr><tr><td>DMEM 10% 배지</td><td></td><td></td><td>10% FBS DMEM</td></tr><tr><td>배지</td><td>Gibco</td><td>11885092</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>FACSFortesa</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청, FBS</td><td>Sigma</td><td>F8318</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo (버전 10.4.0)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Foxp3/Transcription Factor 염색 완충액 세트</td><td>Invitrogen</td><td>00-5523-00</td><td>키트에는 3개의 시약이 포함되어 있습니다: a. 고정/투과화 농축액(4X); b. 고정/투과화 희석제; c. 투과화 완충액.</td></tr><tr><td>Goat Anti-Rat IgG 항체 (H+L), Biotinylated</td><td>Vector laboratories</td><td>BA-9400-1.5</td><td>1:200 dilution</td></tr><tr><td>Invitrogen EVOS FL Auto Cell Imaging System</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isolation buffer</td><td></td><td></td><td>0.5% BSA 및 2mM EDTA</td></tr><tr><td>LCMV GP61-77 펩타이드를 함유한 FACS 버퍼 (GLKGPDIYKGVYQFKSV)</td><td>중국 펩타이드 회사</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD 고정성 근적외선 데드 셀 염색 키트, 633 또는 635nm 여기용</td><td>Life Technologies</td><td>L10199</td><td>1:200 희석</td></tr><tr><td>MigR1</td><td>애드겐</td><td>#27490</td><td></td></tr><tr><td>NaN3</td><td>시그마</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM 매체</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>pCL-Eco</td><td>애드겐</td><td>#12371</td><td></td></tr><tr><td>PE 안티 마우스 CD69(클론 H1.2F3)</td><td>Biolegend</td><td>104508</td><td>1:200 희석</td></tr><tr><td>PE 마우스 anti-Bcl-6 (클론 K112-91)</td><td>BD Biosciences</td><td>561522</td><td>1:50 희석</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수, PBS</td><td>Gibco</td><td>10010072</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Solarbio</td><td>H8761</td><td></td></tr><tr><td>정제 쥐 안티 마우스 CXCR5 (클론 2G8)</td><td>BD Biosciences</td><td>551961</td><td>1:50 희석</td></tr><tr><td>쥐 단클론 PerCP 안티 마우스 CD4 (클론 RM4-5)</td><td>Biolegend</td><td>100538</td><td>1:200 희석</td></tr><tr><td>재조합 쥐 IL-2</td><td>Gibco</td><td>212-12-1MG</td><td></td></tr><tr><td>적혈구 용해 완충액</td><td>Beyotime</td><td>C3702-500mL</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 배지</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 2%</td><td></td><td></td><td>RPMI 1640 배지 2% 함유</td></tr><tr><td>FBS SMARTA (SM) TCR 형질전환 마우스</td><td></td><td></td><td>저희 연구실의 SM TCR 형질전환 라인은 Rafi Ahmed 박사(에모리 대학교)의 선물입니다. 또한 이 마우스 라인은 The Jackson Laboratory(stain#: 030450)에서도 얻을 수 있습니다.</td></tr><tr><td>2% FBS 및 0.01% NaN3</td>Streptavidin PE-Cyanine7을 함유한 <td>염색 완충액</td><td></td><td></td> PBS</tr><tr><td></td><td>eBioscience</td><td>25-4317-82</td><td>1:200 희석</td></tr><tr><td>TCF1/TCF7 (C63D9) Rabbit mAb (Alexa Fluor 488 Conjugate)&nbsp;</td><td>세포 신호 전달 기술</td><td>6444S</td><td>1:400 희석</td></tr><tr><td>TFH 세포 염색 완충액</td><td></td><td></td><td>1% BSA 및 2% 마우스 혈청 함유 FACS 완충액</td></tr><tr><td>TransIT-293 시약</td><td>Mirus Bio</td><td>MIRUMIR2700</td><td></td></tr></tbody></table>

급성 lcmv에 감염된 마우스에서 바이러스 특이적 여포 도우미 cd4+ t 세포의 조기 분화에 접근

Accessing Early Differentiation of Virus-Specific Follicular Helper CD4+ T Cell in Acute LCMV-Infected Mice

Follicular Helper T (TFH) cell은 동족 B 세포가 친화성이 높은 항체를 생성하여 장기적인 체액성 면역을 형성하는 데 도움을 주는 독립적인 CD4+ T 세포 계통으로 인식됩니다. 급성 바이러스 감염 시 바이러스 특이적 TFH 세포의 운명 결정은 초기 감염 단계에서 결정되며, 조기 분화된 TFH 세포에 대한 연구는 T 세포 의존성 체액성 면역을 이해하고 백신 설계를 최적화하는 데 중요합니다. 이 연구에서는 급성 림프구성 맥락수막염 바이러스(LCMV) 감염 마우스 모델과 LCMV 당단백질 에피토프 I-AbGP66-77을 특이적으로 인식하는 CD4+ T 세포를 가진 TCR-transgenic SMARTA(SM) 마우스를 사용하여 유세포 염색을 기반으로 바이러스 특이적 TFH 세포의 조기 운명 헌신에 접근하는 절차를 설명했습니다. 또한, SM CD4+ T 세포의 레트로바이러스 transduction을 이용하여 조기 분화된 바이러스 특이적 TFH 세포에서 유전자 발현을 조작하는 방법도 제공합니다. 따라서 이러한 방법은 바이러스 특이적 TFH 세포의 조기 투여의 기저에 있는 메커니즘을 탐색하는 연구에 도움이 될 것입니다.

급성 LCMV 감염 중 조기 분화 바이러스 특이적 TFH 세포의 특성 바이러스 특이적 TFH 세포의 초기 운명 헌신을 조사하기 위해, LCMV GP 에피토프 I-AbGP66-77을 특이적으로 인식하는 naive congenic SM CD4+ T 세포를 CD45.2+ C57BL/6 수용자에게 입양 전달했습니다. 다음 날, 이 수혜자들은 급성 분해된 LCMV Armstrong의 고용량으로 정맥 주사로 감염되었습니다(그림 1A). 감염 후 3일째에 C57BL/6 수용자의 비장 세포를 유세포 분석으로 분석한 결과, 대량의 CD4.1+ SM CD4+ T 세포(전체 CD4+ T 세포의 ~10%)가 확인되었으며(그림 1B), 이는 추가 조사를 위한 충분한 수의 바이러스 특이적 CD4+ T 세포를 제공했습니다. 전이된 SM CD4+ T 세포에 대한 추가 분석은 CXCR5 및 Bcl-6/TCF-1의 동시 발현과 CXCR5 및 CD25/T-bet의 상호 발현을 보여주었으며, 이에 따라 TFH(CXCR5+Bcl-6+ 또는 CXCR5+TCF-1+) 및 TH1(CXCR5-CD25+ 또는 CXCR5-T-bet+) 계통을 정의했습니다(그림 1C). 연구에서 제시된 CXCR5 항체 염색의 특이성 및 민감도를 평가하기 위해 앞서 언급한 CD45.1+ SM 마우스 라인과 CXCR5-GFP knock-in 마우스 라인을 추가로 교차시켰으며, 이는 Cxcr529의 열린 판독 프레임 이후에 IRES-GFP 구조를 삽입하여 생성되었습니다. 그런 다음, CD45.1+ CXCR5-GFP 리포터 SM 세포를 C57BL/6 수용자로 옮겼다. 이 수혜자들은 LCMV 암스트롱에 감염되었으며, 감염 후 3일째에 그들의 비장 세포를 분석했습니다. 실제로, 연구에서 CXCR5 항체 염색법에 의한 형광 신호는 감염 후 3일차에 전달된 CXCR5-GFP 리포터29개의 SM CD4+ T 세포의 GFP 신호와 미세하게 겹쳤으며(그림 1D), 이는 3단계 CXCR5 항체 염색 방법의 높은 특이성을 나타냅니다.
SM CD4+ T 세포에서 레트로바이러스 기반 Bcl-6 과발현 Bcl-6는 TFH 세포 분화 6,7,8을 촉진하는 가장 중요한 분자 중 하나입니다. 조기 분화된 TFH 세포에 접근하는 데 있어 현재 프로토콜의 신뢰성을 확인하기 위해 CD45.1+ SM CD4+ T 세포를 생체 내에서 활성화하고 MigR1 플라스미드 또는 MigR1-Bcl6 과발현 플라스미드 형질주입된 293T 세포의 레트로바이러스 상등액으로 transduction했습니다(그림 2 및 그림 3A). 레트로바이러스-형질도입된 SM CD4+ T 세포는 다음으로 C57BL/6 수용자에게 입양 전달되었고, 그 후 LCMV Armstrong에 감염되었습니다(그림 3B). 감염 후 3일째에는 MigR1-SM CD4+ T 세포에서 TFH와 TH1 세포의 균형 잡힌 분기가 관찰되었으며, MigR1-Bcl6-SM CD4+ T 세포에서는 TFH 세포 유도 분화가 우세했습니다(그림 3C). 일관되게 Bcl-6 발현 수준은 MigR1-SM CD4+ T 세포에 비해 MigR1-Bcl6-SM CD4+ T 세포에서 향상되었습니다(그림 3D). 따라서, 이소성 Bcl-6 발현 주도 TFH 세포 분화(6)라는 표현형은 본 프로토콜에 따라 정교하게 재현되었다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66752/66752fig01.jpg"> 그림 1: LCMV 암스트롱 감염 중 SM TFH 세포의 초기 운명 헌신에 대한 유세포 분석 분석. (A) 실험 설계. CD45.1+ SM 마우스에서 비장 CD4+ T 세포를 수확한 후 C57BL/6 수용자(CD45.2+)에 입양 이식했습니다. 다음 날, 이 수혜자들은 LCMV 암스트롱에 감염되었습니다. 감염 후 3일째에 수혜자의 비장에서 전달된 CD45.1+ SM 세포를 유세포 분석으로 분석했습니다. (B) LCMV 암스트롱 감염 후 3일째에 수혜자의 비장에서 전달된 CD45.1+ SM CD4+ T 세포의 게이팅 전략을 보여주는 대표적인 유세포 분석 데이터. (C) LCMV 암스트롱 감염 후 3일째에 수혜자의 비장에서 전달된 CD45.1+ SM 세포에서 CXCR5 및 기타 TFH 세포 관련 분자(Bcl-6, TCF-1, CD25 및 T-bet)의 동시 염색을 보여주는 대표적인 유세포 분석 데이터. (D) LCMV 암스트롱 감염 후 3일째에 수혜자의 비장에서 전달된 CD45.1+ CXCR5-GFP 리포터 SM 세포에서 CXCR5 및 GFP 신호에 대한 형광 접합 항체의 동시 염색을 보여주는 대표적인 유세포 분석 데이터. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66752/66752fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66752/66752fig02.jpg"> 그림 2: SM CD4+ T 세포의 레트로바이러스 transduction. (A) SM CD4+ T 세포의 레트로바이러스 생산 및 레트로바이러스 형질도입의 개략도. 레트로바이러스 생산을 위해 세포 밀도가 ≥80% confluence에 도달하면 6-well plate에 파종된 293T 세포를 타겟 DNA 플라스미드로 transfection했습니다. 그런 다음, 형질주입 후 72시간 후에 레트로바이러스를 함유하는 세포 배양 상층액을 채취하고 즉시 사용하거나 -80°C에서 보관하였다. SM CD4+ T 세포의 레트로바이러스 형질도입을 위해 CD45.1+ SM 마우스에 200μg의 LCMV GP61-77 펩타이드를 정맥 주사했습니다. 그런 다음 펩타이드 주입 후 16-18시간 후에 SM 마우스에서 비장을 절제하여 비장 CD4+ T 세포의 활성화 상태를 검출하였다. 활성화된 SM CD4+ T 세포를 레트로바이러스가 함유된 배양 상층액으로 transduction하고 transduction efficiency에 접근하기 전에 48시간 동안 in vitro에서 배양했습니다. (B) 플라스미드 DNA transfection된 293T 세포에서 GFP의 형광 현미경 이미징. 척도 막대: 400 μm. (C) naive: mouse(naive, 왼쪽) 또는 LCMV GP61-77 펩타이드 주입 SM mouse(활성화됨, 오른쪽)의 비장 미아 CD4+ T 세포에서 CD25 및 CD69 발현 수준의 유세포 분석. (D) 레트로바이러스 형질도입 SM CD4+ T 세포(형질주입, 왼쪽) 또는 레트로바이러스-비형질주입 SM CD4+ T 세포(비형질주입, 왼쪽)에서 GFP 발현의 유세포 분석. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66752/66752fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66752/66752fig03.jpg"> 그림 3: SM TFH 세포 운명 헌신에서 Bcl-6 과발현의 효과. (A) IRES-GGP(MigR1-Bcl6)의 업스트림에서 Bcl6 CDS 영역이 있는 레트로바이러스 MigR1 백본(상단 패널) 및 수정된 MigR1 벡터의 선형 맵(하단 패널). (B) 실험 설계. MigR1-형질주입 또는 MigR1-Bcl6-형질주입된 SM CD4+ T 세포는 LCMV Armstrong보다 하루 전에 C57BL/6 수용자(CD45.2+)로 입양 전달되었습니다. 감염 후 3일째에 수혜자의 비장에서 전달된 CD45.1+ SM CD4+ T 세포를 유세포 분석으로 분석했습니다. (C) MigR1 형질주입 또는 MigR1-Bcl6-형질주입 GFP+, SM, CD4+, T 세포에서 CXCR5 및 CD25의 유세포 분석. 게이트에 인접한 숫자는 SM CD4+ T 셀에서 TFH 셀의 주파수를 나타냅니다. (D) MigR1-transduced 또는 MigR1-Bcl6-transduced SM CD4+ T 세포에서 Bcl-6 발현 수준의 유세포 분석. MFI, 평균 형광 강도. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66752/66752fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

현재 연구는 바이러스 특이적 TFH 세포의 조기 운명 헌신을 평가하고 이러한 세포에서 유전자 발현을 조작하기 위한 프로토콜을 보여줍니다.

급성 LCMV에 감염된 마우스에서 바이러스 특이적 여포 도우미 CD4+ T 세포의 조기 분화에 접근

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