업데이트된 멀티플렉스 LN34 Real-Time 역전사-중합효소 연쇄 반응 분석을 통한 동물 광견병의 사후 진단

광견병은 100% 치명적이며, 가장 필요한 사람들에게 생명을 구하는 치료를 제공하기 위해서는 신속하고 정확한 진단이 필요합니다. 신뢰할 수 있는 실험실 검사는 광견병 통제에 매우 중요합니다. CDC는 검증된 실시간 Alisa 바이러스 검사인 LN34를 사용하여 정량적 역전사효소 PCR 또는 RT-PCR을 통한 광견병 검사 단계별 프로토콜을 개발하여, 실험실이 진단 정확도를 높이고 광견병 예방 노력을 지원할 수 있도록 했습니다.

수십 년 동안 광견병 검사는 DFA 또는 FAT라는 직접 형광 항체 검사에 의존해 왔습니다. 하지만 많은 국제 실험실에서도 뛰어난 민감도와 정확성 때문에 광견병 검사에 RT-PCR을 사용합니다. 광견병에 대한 DFA 검사는 특수 현미경, 콜드체인 보관, 직원 전문 교육, 그리고 최근 몇 년간 시약 부족이 겪었으며, PCR과 RT-PCR이 병원체 검사에 널리 사용되고 있습니다.

많은 실험실이 이미 PCR 및 RT-PCR 장비와 전문 지식을 갖추고 있으며, 필요한 시약은 상업 공급업체에서 구할 수 있습니다. 비용은 인간 광견병 환자가 가장 많은 지역에서 광견병 검사를 위한 주요 장벽입니다. CDC는 LN34 분석법의 다중화 형태를 개발하여 품질 관리를 개선하고 샘플당 비용을 낮추었습니다.

RT-PCR은 다른 병원체 검사에 널리 사용되고 결과가 해석하기 쉬워서 광견병 진단에 점점 더 많이 도입되고 있습니다. 하지만 검증된 테스트를 사용하는 것은 매우 중요하며, 테스트가 기대 대로 작동하는지 확인하는 것도 똑같이 중요합니다. 단계별 프로토콜에는 품질 관리, 안전 고려사항, PCR 모범 사례가 포함되어 있어 실험실이 시작할 수 있도록 돕습니다.

우선, 안전경, 닫힌 앞 가운, 장갑 두 켤레 등 개인 보호 장비를 착용하세요. 광견병 바이러스를 비활성화하기 위해 4차 암모늄 화합물이나 다른 적절한 소독제로 작업 표면을 청소하고 소독하세요. 작업 표면에 플라스틱 안감 흡수 패드를 깔고, 깨끗한 일회용 메스로 뇌간과 소뇌의 전체 단면을 나타내는 조직을 사용하세요.

균질화와 RNA 추출을 위해서는 일회용 메스로 필요한 조직을 다져야 합니다. 다진 조직을 면봉으로 도바질한 후, 균질화 완충제와 구슬이 미리 채워진 튜브로 옮깁니다. 겉장갑을 1:256 희석한 QAC 소독제로 버린 후, 작업대, 장비, 샘플 튜브 외부를 청소하고 소독합니다.

작은 비드 비터로 샘플을 60초간 균질화하세요. 그리고 튜브를 육안으로 점검하세요. 샘플을 실온에서 5분간 두세요.

마지막으로 작업대, 장비, 샘플 튜브 외부를 QAC 소독제로 청소하고 소독한 후 RNA 추출을 진행합니다. 우선, 1:256으로 희석한 QAC를 사용해 생물학적 안전 캐비닛의 표면 오염 제거를 수행합니다. 먼지나 기타 환경 오염 물질을 제거하기 위해 추가 청소를 하세요.

작업 플랫폼 위에 플라스틱 안감 흡수 작업 패드를 깔아두세요. 그 다음, 시약과 샘플을 생물안전 캐비닛에 정리하세요. 마이크로 원심분리관을 위한 모든 수집관을 깨끗한 랙에 배치하세요.

각 뇌 샘플마다 1.5밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브 1개에 100% 에탄올 300마이크로리터를 미리 채워 넣으세요. 균질화된 시트 뇌 샘플을 10,000에서 16,000G에서 테이블탑 마이크로 원심분리기에서 2분간 원심분리합니다. 투명한 분홍색 상정액을 100% 에탄올이 들어간 새로운 멸균 튜브로 옮기고, 피펫을 위아래로 움직여 600마이크로리터의 에탄올 상상정액 혼합물을 혼합한 후 수집관 내 스핀 컬럼으로 옮깁니다.

액체가 컬럼을 통과할 때까지 1분간 원심분리기를 하고, 흐름을 버리고 각 컬럼을 새로운 수집관으로 옮깁니다. 각 컬럼에 400마이크로리터의 RNA 프리워시 버퍼를 추가합니다. 혼합물을 10,000에서 16,000G에서 30초간 원심분리한 후 흐름을 버립니다.

각 컬럼을 같은 수집관에 다시 넣고 프리워시 단계를 두 번 반복합니다. 다음으로 각 컬럼에 700마이크로리터의 RNA 워시 버퍼를 추가합니다. 원심분리기는 10,000에서 16,000G로 2분간 진행합니다.

그리고 RNase가 없는 튜브에 조심스럽게 옮기세요. 흐름 장갑과 수집관을 버리고, 외부 장갑을 벗어 버리세요. 이제 50마이크로리터의 DNase 및 RNase 자유 물을 컬럼 매트릭스에 직접 첨가하고 30초간 배양합니다.

그 다음 10,000에서 16,000G로 1분간 원심분리합니다. RNA를 새로 장착한 나사 위, 평평한 하단 삽입물, 마이크로 원심분리관으로 조심스럽게 옮겨 RT-PCR 분석합니다. 우선, 마스터 믹스 준비 공간에서 1단계 RT-PCR 버퍼를 해동하고, 템플릿 제어 없이 뉴클레아제 프리 워터, 프라이머, 프로브를 얼음 위에 올립니다.

한 단계 RT-PCR 효소를 얼음 위에 올려놓으세요. LN34 다중화 및 베타 A 마스터 믹스의 각 시약의 부피를 계산합니다. LN34 다중화 분석법을 위해 96웰 플레이트 맵을 사용하여 각 샘플에 대해 3중 웰을 지정합니다.

소용돌이 및 회전 후, 할당된 각 LN34 우물에 23마이크로리터의 LN34 다중화 마스터 믹스를 분사합니다. 음성 템플릿 제어 반응을 설정하려면 각 음성 템플릿 제어 우물에 PCR 등급의 물 2마이크로리터를 추가하세요. 96웰 플레이트를 얼음 위에 올려놓으세요.

작업대를 70% 에탄올로 청소하세요. 현재 템플릿 에디션 작업 공간에서 인공 RNA의 RNA 샘플을 해동하고 양성 대조 단회용 인공 RNA를 얼음 위에 사용합니다. 소용돌이 후, RNA 샘플을 담은 원심분리관을 통해 해당 웰에 샘플 또는 양성 대조 RNA를 2마이크로리터 피펫으로 주입합니다.

모든 샘플을 추가한 후, 광학 접착 커버를 웰 위에 덮어 완전히 밀봉하세요. 플레이트를 500G에서 실온에서 1분간 원심분리한 후, 밀봉된 플레이트를 가족 및 VIC 헥스 리포터 다이에 맞게 보정된 실시간 또는 정량 PCR 기기에 넣습니다. 기기를 적절한 사이클링 매개변수로 설정하세요.

검사 후 LN34는 0.2, 베타 액틴은 0.05로 임계값을 설정합니다. 대조 샘플 곡선에서 품질 문제를 확인해 보세요. LN34 분석은 로그 척도에서 서로 다른 주기 임계값에서 임계값을 넘는 긍정적인 증폭 곡선을 보였다.

그리고 LN34와 베타 액틴 모두에 대한 선형 척도의 시그모이드 증폭 곡선도 있습니다. 음성 결과는 증폭 없이 평탄한 선을 보였습니다. 비정상적인 증폭 곡선이 확인되었으며, 일부는 형광이 시그모이드가 아닌 선형 증가를 보여 비전형적인 결과를 나타냈다.

해당 다성분 그래프는 예상한 매끄러운 곡선 대신 불규칙한 물결 형광 신호를 보였습니다. 사이클 임계값에만 의존하는 대신 증폭 그래프를 분석할 필요성을 강조합니다.