Name: 항균 그래핀 산화물/구리 나노복합체 제조 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 57 s
Description: 학습하세요 항균성 그래핀 산화물/구리 나노복합체 합성법을 통해 내성균 대응 소재를 개발하는 방법을. 이 저비용 기술은 대규모 생산과 생의학 적용에 적합합니다.

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1. GO/Cu 나노복합체의 제조
참고 : GO 나노 시트에서 성장하는 Cu 나노 입자의 크기와 형태는 GO 산화 정도, Cu 전구체의 농도 및 환원제(26)의 농도에 의해 결정됩니다.
<ol><li>유리병에 1mg/mL GO 현탁액 10mL를 준비합니다. GO가 증류수(DI)에 잘 분산될 때까지 GO 현탁액을 1시간 동안 초음파 처리합니다.</li>
	<li>유리 바이알에 20mM CuCl2 용액을 준비합니다. CuCl2 가 DI 물에 잘 분산 될 때까지 CuCl2 용액을 초음파 처리합니다.</li>
	<li>20mM CuCl2 용액 10mL를 GO 용액에 첨가하고 혼합물을 70 ° C에서 1 시간 동안 초음파 처리합니다.</li>
	<li>20mM NaBH4 용액을 준비합니다. 주의: 이 절차는 화학 흄 후드에서 수행해야 합니다. 산화 환원 반응은 환원제 NaBH4 가 물에 도입되자마자 발생합니다. 실험 직전에 NaBH4 용액을 준비합니다.</li>
	<li>NaBH4, GO 및CuCl2의 혼합물 제조<ol><li>20mM NaBH4 용액 20mL를 GO 및 CuCl2 혼합물에 넣고 200rpm에서 마그네틱 바(magnetic bar)로 교반합니다. NaBH4 용액을 첨가한 후 30분 동안 계속 저어줍니다. 주의: 이 절차는 화학 흄 후드에서 수행해야 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>혼합물의 원심분리<ol><li>1.5.1 단계의 혼합물을 원심 분리기 튜브로 옮깁니다. 용액을 23,000× g 에서 실온에서 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버리십시오. 주의 : 원심분리기를 작동할 때는 항상 동일한 무게의 튜브를 배치하여 균형을 유지하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>GO / Cu 나노 복합 혼합물을 10mL의 DI 물로 재현탁하고 침전물이 용액 전체에 고르게 분산되도록 초음파 처리합니다.</li>
	<li>용액을 23,000× g 에서 실온에서 10분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 상층액을 제거하십시오.</li>
	<li>1.7-1.8단계를 한 번 더 반복하여 미반응 화학 물질을 제거합니다.</li>
	<li>GO / Cu 나노 복합체에 증류수 1mL를 첨가하고 혼합물을 초음파 처리하여 침전물을 액상 전체에 고르게 분산시킵니다. 알림: 하나의 원추형 튜브에 모든 GO/Cu 나노 복합 용액을 수집합니다.</li>
	<li>GO / Cu 나노 복합체가 완전히 건조되고 GO / Cu 나노 복합체 분말을 얻을 때까지 진공 상태에서 -60 ° C에서 하룻밤 동안 용액을 동결 건조시킵니다.</li>
	<li>GO/Cu 나노복합 분말을 사용할 때까지 -20°C에서 보관하십시오.</li>
</ol>2. 항균 시험을 위한 세균의 준비
주의: 이 절차는 알코올이 있는 생물 안전 캐비닛에서 수행해야 합니다.amp. 박테리아 폐기물은 폐기하기 전에 고압멸균해야 합니다. 항생제 내성균을 다룰 때는 장갑, 가운, 마스크 등을 착용해야 하며, 실험 후에는 비누나 손 소독제를 사용하여 손을 씻어야 합니다. 항상 철저히 소독하십시오. 실험 구역에서 오염이 발생하면 즉시 70% 에탄올로 소독하십시오.
<ol><li>세균 배양 배지 준비<ol><li>플라스크에 트립틱 대두 한천 20g과 증류수 500mL를 섞습니다. 혼합물을 121°C의 오토클레이브에서 15분 동안 멸균합니다.</li>
		<li>한천이 굳기 전에 한천 용액 15mL를 페트리 접시에 붓고 한천 플레이트를 준비합니다. 사용할 때까지 한천 플레이트를 4°C에서 보관하십시오. 참고: 이 작업은 한천 용액이 경화되기 전에 신속하게 수행해야 합니다. 오염을 방지하려면 경화하는 동안 한천 플레이트를 UV로 15분 동안 살균하십시오.</li>
		<li>플라스크에 트립틱 콩 육수(TSB) 15g과 증류수 500mL를 섞습니다. 혼합물을 121°C의 오토클레이브에서 15분 동안 멸균합니다.</li>
		<li>40-50mL의 육수 용액을 50mL 원뿔형 튜브에 분취합니다. 사용할 때까지 육수를 4 °C에서 보관하십시오. 알림: 오염을 방지하려면 분양된 육수를 UV로 15분 동안 살균하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>세균 배양<ol><li>루프를 사용하여 한천 플레이트에 MSRA 또는 P. aeruginosa 원액을 접종합니다. 진탕 인큐베이터를 사용하여 37°C에서 한천 플레이트를 24시간 동안 배양합니다.</li>
		<li>루프를 사용하여 박테리아 군집 하나를 육수 10mL에 접종합니다. 200rpm에서 진탕 인큐베이터를 사용하여 37°C에서 24시간 동안 육수를 배양합니다.</li>
		<li>2.2.1-2.2.2 단계를 한 번 더 반복하여 동일한 특성을 가진 박테리아를 얻습니다.</li>
		<li>24시간 후 멸균 증류수를 사용하여 박테리아 용액을 10배로 연속적으로 희석합니다. 희석된 세균 현탁액 100μL를 한천 플레이트에 접종하고 스프레더로 펴 바릅니다. 진탕 인큐베이터를 사용하여 37°C에서 한천 플레이트를 24시간 동안 배양합니다. 알림: 희석 수준은 박테리아에 따라 다릅니다. 한천 플레이트에 100개 미만의 콜로니를 준비하는 것을 목표로 합니다.</li>
		<li>방정식 (1)을 사용하여 콜로니 형성 단위(CFU)를 결정하기 위해 24시간 배양 후 박테리아 콜로니를 계산합니다. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66762/66762eq01.jpg" style="margin: auto;"> (1)</li>
		<li>2.2.4-2.2.5 단계를 3 회 이상 반복하여 박테리아의 CFU가 상대적으로 일정한지 확인합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 미세희석액법을 이용한 항균시험
<ol><li>1일차) 루프를 사용하여 한천 플레이트의 박테리아 콜로니 1개를 육수 10mL에 접종합니다. 200rpm에서 진탕 인큐베이터를 사용하여 37°C에서 24시간 동안 육수를 배양합니다.</li>
	<li>2일차) Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)를 사용하여 GO/Cu 나노복합체 혼합물을 최소 3가지 농도로 준비합니다. GO / Cu 나노 복합체가 DPBS에 잘 분산 될 때까지 GO / Cu 나노 복합체 현탁액을 초음파 처리합니다. 참고: 이 프로토콜에서는 GO/Cu 나노복합체 혼합물의 500, 250, 125 및 62.5μg/mL를 테스트했습니다.</li>
	<li>제어 용액을 준비합니다. 음성 대조군은 DPBS이고 양성 대조군은 DPBS에 있는 페니실린/스트렙토마이신 용액의 1%로 박테리아를 죽입니다.</li>
	<li>100μL의 GO/Cu 나노복합 현탁액과 대조 용액을 96웰 플레이트에 추가합니다. 모든 샘플을 삼중으로 추가합니다. 알림: 박테리아에 적용하기 전에 샘플을 UV로 15분 동안 살균하십시오.</li>
	<li>배양 24시간 후 CFU를 기준으로 TSB를 사용하여 박테리아 현탁액을 1 × 106 CFU/mL로 희석합니다. 참고: 2.2.5단계에 따른 본 연구의 초기 MRSA 및 녹농균 배양 현탁액 농도는 각각 4.5 × 109 CFU/mL 및 3 × 109 CFU/mL입니다. 1 × 106 CFU/mL의 박테리아 농도는 배양액을 각각 4,500배 및 3,000배 희석하여 얻습니다.</li>
	<li>1 × 106 CFU/mL 희석된 박테리아 현탁액 100μL를 96웰 플레이트의 시료 웰에 접종합니다. 200rpm에서 24시간 동안 진탕 인큐베이터를 사용하여 37°C에서 96웰 플레이트를 배양합니다. 참고: 박테리아의 최종 농도는 100μL의 샘플과 혼합한 후 5 × 105 CFU/mL입니다.</li>
	<li>3일차) 200μL 마이크로피펫 팁으로 샘플과 박테리아 현탁액을 세게 혼합합니다. 샘플-박테리아 혼합물을 멸균 증류수로 순차적으로 희석합니다. 알림: 희석 수준은 박테리아에 따라 다릅니다. 한천 플레이트에 100개 미만의 콜로니를 준비하는 것을 목표로 합니다.</li>
	<li>희석된 세균 현탁액 100μL를 한천 플레이트에 접종하고 스프레더로 펴 바릅니다. 진탕 인큐베이터를 사용하여 37°C에서 한천 플레이트를 24시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>4일차) 세균 군집을 세고 CFU 값을 결정하여 수학식 (2)를 사용하여 GO/Cu 나노복합체의 항균 활성을 확인합니다. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/66762/66762eq02.jpg" style="margin: auto;"> (2)</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>저항성 박테리아를 위한 항균 그래핀 산화물/구리 나노복합체

<ol><li>Doron, S., Gorbach, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+infections%3A+Overview%5BTitle%5D)+AND+%22International+Encyclopedia+of+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Bacterial infections: Overview.</a> International Encyclopedia of Public Health. , 273-282 (2008).</li>
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<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graphene+oxide%2Fcopper+nanoderivatives-modified+chitosan%2Fhyaluronic+acid+dressings+for+facilitating+wound+healing+in+infected+full-thickness+skin+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Graphene oxide/copper nanoderivatives-modified chitosan/hyaluronic acid dressings for facilitating wound healing in infected full-thickness skin defects.</a> Int J Nanomedicine. 15, 8231-8247 (2020).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>항생제-항진균제</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>임상 MDR 세균 균주&nbsp;</td><td>중앙대학교병원 (서울, 대한민국)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>구리(II) 염화물</td><td>덕산</td><td>10125-13-0</td><td></td></tr><tr><td>전계방출 주사전자현미경 (FE-SEM)</td><td>Carl Zeiss</td><td>SIGMA</td><td></td></tr><tr><td>그래핀 옥사이드</td><td>시그마</td><td>796034</td><td></td></tr><tr><td>수소화붕소나트륨</td><td>Sigma</td><td>71320</td><td></td></tr><tr><td>투과 전자 현미경 (템)</td><td>JEOL</td><td>JEM-2100</td><td></td></tr><tr><td>트립틱 소이 한천</td><td>BD 디프코</td><td>236950</td><td></td></tr><tr><td>트립틱 소이 육수</td><td>BD 디프코</td><td>211825</td><td></td></tr></tbody></table>

항균 그래핀 산화물/구리 나노복합체 제조

Fabrication of Antibacterial Graphene Oxide/Copper Nanocomposites

투과 전자 현미경 (TEM), 주사 전자 현미경 (SEM) 및 에너지 분산 X 선 분광법 (EDS) 분석을 수행하여 GO / Cu 나노 복합체의 형성을 확인했습니다. 그림 1A, B 는 이질적인 Cu 나노 입자가 GO 시트에서 성장했음을 보여줍니다. 그림 1C에서 볼 수 있듯이 EDS 매핑은 GO 시트의 입자가 Cu 나노 입자임을 확인했습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66762/66762fig01.jpg"> 그림 1: GO/Cu 나노복합체의 특성. (A) 투과 전자 현미경, (B) 주사 전자 현미경 및 (C) GO/Cu 나노 복합체의 형성을 확인하는 에너지 분산 X선 분광법 이미지. 스케일 바 = 500nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66762/66762fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
환자의 상처에서 분리한 박테리아 균주인 메티실린 내성 황색포도상구균(MRSA) 및 녹농균(P. aeruginosa)은 표 1 및 표 2에 요약된 바와 같이 다양한 항생제에 내성을 나타냅니다. 그림 2A,B는 MRSA 및 P. aeruginosa에 대한 GO/Cu 나노복합체의 항균 효능을 각각 보여줍니다. 특히, GO/Cu 나노복합체의 농도가 증가함에 따라 박테리아 성장이 현저히 억제되었습니다. 우리는 합성된 GO/Cu 나노복합체의 125μg/mL가 MRSA 및 녹농균에 대한 효과적인 항균 활성에 충분하다는 것을 발견했습니다. 구체적으로, MRSA의 99.8%와 녹농균의 84.7%를 500μg/mL의 GO/Cu 나노복합체로 처리하여 박멸하였습니다. 세균 박멸의 다른 비율은 그람 양성 박테리아와 그람 음성 박테리아의 독특한 생물학적 구조에 기인할 수 있습니다. MRSA와 같은 그람 양성 박테리아는 90% 이상의 펩티도글리칸으로 구성된 세포벽을 가지고 있습니다. 대조적으로, 녹농균(P. aeruginosa)과 같은 그람 음성 박테리아는 외막이 있는 세포벽에 5%-20%의 펩티도글리칸만 가지고 있습니다. 이 외막은 그람 음성 박테리아에게 항균제에 대한 강력한 내성을 제공하여 이러한 작용제의 침투를 방해합니다(27). 그럼에도 불구하고 GO/Cu 나노복합체는 항생제 내성 박테리아를 효과적으로 제거할 수 있습니다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66762/66762fig02v2.jpg"> 그림 2: GO/Cu 나노복합체의 항균 효과. (A) 임상적 상처에서 얻은 MRSA 및 (B) 녹농균. 데이터는 평균± SEM(n = 4)으로 표시됩니다. p &lt; 0.001; P &lt; 0.0001. MRSA = 메티실린 내성 황색포도상구균; P = 포지티브 컨트롤; N = 네거티브 컨트롤. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66762/66762fig02largev2.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>항생제</td>
			<td>마이크(μg/mL)</td>
			<td>해석</td>
		</tr><tr><td>클린다마이신</td>
			<td>≤ 0.25</td>
			<td>R</td>
		</tr><tr><td>시프로플록사신(Ciprofloxacin)</td>
			<td>≥ 8</td>
			<td>R</td>
		</tr><tr><td>에리스로마이신</td>
			<td>≥ 8</td>
			<td>R</td>
		</tr><tr><td>겐타마이신</td>
			<td>≥ 16</td>
			<td>R</td>
		</tr><tr><td>무피로신</td>
			<td>≥ 512</td>
			<td>R</td>
		</tr><tr><td>페니실린-G</td>
			<td>≥ 0.5</td>
			<td>R</td>
		</tr><tr><td>티게사이클린</td>
			<td>≤ 0.12</td>
			<td>S</td>
		</tr></tbody></table>표 1: 메티실린 내성 황색포도상구균에 대한 항생제 감수성 시험. 약어: MIC = 최소 억제 농도; S = 민감함; R = 저항.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>항생제</td>
			<td>마이크(μg/mL)</td>
			<td>해석</td>
		</tr><tr><td>세포탁심</td>
			<td>32</td>
			<td>R</td>
		</tr><tr><td>시프로플록사신(Ciprofloxacin)</td>
			<td>≤ 0.25</td>
			<td>S</td>
		</tr><tr><td>겐타마이신</td>
			<td>2</td>
			<td>S</td>
		</tr><tr><td>미노사이클린</td>
			<td>≥ 16</td>
			<td>R</td>
		</tr><tr><td>티카르실린/캘리포니아</td>
			<td>32</td>
			<td>나는</td>
		</tr><tr><td>티게사이클린</td>
			<td>≥ 8</td>
			<td>R</td>
		</tr><tr><td>트리메토프림/설파</td>
			<td>80</td>
			<td>R</td>
		</tr></tbody></table>표 2: 녹농균(P. aeruginosa)에 대한 항생제 감수성 시험. 약어: MIC = 최소 억제 농도; S = 민감함; I = 중간; R = 저항.

Antibiotics are currently the most used antibacterial treatment for killing bacteria. However, bacteria develop resistance when continually overexposed to ...

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

Graphene은 생물 의학 임플란트의 코팅 소재로 가능성을 제공합니다. 이 연구에서 우리는 graphene의 나노 미터 두께의 레이어 코팅 nitinol 합금하는 방법을 설명하고 graphene은 임플란트 응답에 영향을 미칠 수 있는지 결정합니다.

생명을 주입 Graphene 코팅

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생물 액체 배지에서 확장 성, 금속 높은 가로 세로 비율 나노 복합 재료의 생성

여기에서는 손상된 혈관 재건에 응용하기 위해 박테리아 나노셀룰로오스(BNC)를 자성화하는 프로토콜을 제시합니다. BNC는 G. xylinus 균주에 의해 합성되었습니다. 한편, BNC의 자화는 BNC 메쉬 내부의 Fe2+ 및 Fe3+ 철 이온의 현장 침전을 통해 실현되었습니다.

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플라즈몬 나노 입자를 사용하여 그래 핀 산화물의 가시 광선 유도 감소

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나노 입자와 그들의 항균 활동 및 세포 독성 속성의 평가 수정 다중 벽 탄소 나노튜브의 합성

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Nafion 코팅의 제조, 미생물 발효 하는 동안 실시간 산도 모니터에 그래 핀 산화물/폴리아닐린 Chemiresistive 센서 감소

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Fabrication of Monolayer Graphene-Coated Grids for Cryoelectron Microscopy(초저온 전자 현미경을 위한 단층 그래핀 코팅 그리드 제작)

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학습하세요 항균성 그래핀 산화물/구리 나노복합체 합성법을 통해 내성균 대응 소재를 개발하는 방법을. 이 저비용 기술은 대규모 생산과 생의학 적용에 적합합니다.

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