Name: 바늘 개방에 대한 피드백을 위해 일정한 공기 압력을 사용하는 미세 주입 바늘의 습식 베벨링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T13:20:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: 배우세요 기압을 이용한 미세 주입 바늘 습식 베벨링 기법으로 일관된 바늘 개방 크기를 제어하는 방법입니다. 이 프로토콜은 유전자 변형 곤충 연구에 필요한 날카로운 바늘을 효율적으로 제작할 수 있게 합니다.

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<meta charset="utf8"></head><body>일정한 공기 압력 하에서 미세주입 바늘의 습식 베벨링을 위한 프로토콜

<ol><li>Rubin, G. M., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+Drosophila+with+transposable+Element+Vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of Drosophila with transposable Element Vectors.</a> Science. 218 (4570), 348-353 (1982).</li>
<li>O'Brochta, D. A., Atkinson, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+systems+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Transformation systems in insects.</a> Methods Mol Biol. 260, 227-254 (2004).</li>
<li>Handler, A. M., James, A. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHandler%2C+AM+%22Insect+Transgenesis%3A+Methods+and+Applications%22">Insect Transgenesis: Methods and Applications</a>. , CRC Press. Boca Rato. (2000).</li>
<li>Harrell, R. A. Mosquito embryo microinjection. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarrell%2C+RA+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22">Cold Spring Harbor Protocols</a>. , 10.1101/pdb.prot107686 (2023).</li>
<li>Allen, M. L., O'Brochta, D. A., Atkinson, P. W., Levesque, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable%2C+germ-line+transformation+of+Culex+Quinquefasciatus+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Entomol%22%5BJournal%5D)">Stable, germ-line transformation of Culex Quinquefasciatus (Diptera: Culicidae).</a> J Med Entomol. 38 (5), 701-710 (2001).</li>
<li>Grossman, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transformation+of+the+malaria+vector%2C+Anopheles+gambiae%2C+with+the+piggyBac+transposable+element%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Germline transformation of the malaria vector, Anopheles gambiae, with the piggyBac transposable element.</a> Insect Mol Biol. 10 (6), 597-604 (2001).</li>
<li>Adelman, Z. N., Jasinskiene, N., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+applications+of+transgenesis+in+the+yellow+fever+mosquito%2C+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Development and applications of transgenesis in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti.</a> Mol Biochem Parasitol. 121 (1), 1-10 (2002).</li>
<li>Perera, O. P., Harrell, R. A., Handler, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ-line+transformation+of+the+South+American+malaria+vector%2C+Anopheles+albimanus%2C+with+a+piggyBac%2FEGFP+transposon+vector+is+routine+and+highly+efficient%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Germ-line transformation of the South American malaria vector, Anopheles albimanus, with a piggyBac/EGFP transposon vector is routine and highly efficient.</a> Insect Mol Biol. 11 (4), 291-297 (2002).</li>
<li>Harrell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito+embryo+microinjection+under+halocarbon+oil+or+in+aqueous+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Mosquito embryo microinjection under halocarbon oil or in aqueous solution.</a> Cold Spring Harb Protoc. , 10.1101/pdb.prot108203 (2023).</li>
<li>Louradour, I., Ghosh, K., Inbar, E., Sacks, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+mutagenesis+in+Phlebotomus+papatasi%3A+The+immune+deficiency+pathway+impacts+vector+competence+for+Leishmania+major%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 mutagenesis in Phlebotomus papatasi: The immune deficiency pathway impacts vector competence for Leishmania major.</a> mBio. 10 (4), e01941(2019).</li>
<li>Tamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transformation+of+the+silkworm+Bombyx+mori+L.+using+a+piggyBac+transposon-derived+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector.</a> Nat Biotechnol. 18 (1), 81-84 (2000).</li>
<li>BV-10 Micropipette Beveler Operation Manual Rev. 3.00. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.manualslib.com/manual/2073788/Sutter-Instrument-Bv-10.html">https://www.manualslib.com/manual/2073788/Sutter-Instrument-Bv-10.html</a> (2018).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1.0mm O.D. 미세 모세관</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>베벨러 받침대 오일</td><td>Sutter Instruments</td><td>008</td><td></td></tr><tr><td>자전거 펜더 클립</td><td>VeloOrange</td><td>R-클립 4팩</td><td></td></tr><tr><td>https://velo-orange.com/products/vo-r-clip-4-pack 붐 스탠드 현미경</td><td>AmScope</td><td></td><td>AMScope 3.5X-90X 삼안 LED 붐 스탠드 스테레오 현미경 또는 동등한</td></tr><tr><td>BV-10 Beveler</td><td>Sutter Instruments</td><td>BV-10</td><td></td></tr><tr><td>다이아몬드 연마 플레이트&nbsp;</td><td>Sutter Instruments</td><td>104F</td><td>다이아몬드 연마 플레이트 - 극세(0.2 & 마이크로; 1.0 & 팁 크기)</td></tr><tr><td>개스킷, Buna-N</td><td>Clippard Instrument Laboratory, Inc.</td><td>11761-2-pkg</td><td>T&nbsp; 또는 L 커넥터의 연결을 밀봉하는 데 사용됩니다(아직 이 부품에 포함되지 않은 경우)</td></tr><tr><td>호스 클램프</td><td>Clippard Instrument Laboratory, Inc.</td><td>5000-2-pkg</td><td></td></tr><tr><td>호스 커넥터</td><td>Clippard Instrument Laboratory, Inc.</td><td>CT4-pkg</td><td>5 호스 커넥터</td></tr><tr><td>필요 미세 주입 바늘 홀더</td><td>World Precision Instruments</td><td>MPH3-10</td><td>1mm 외경 미세 모세관 용 바늘 홀더</td></tr><tr><td>P-2000</td><td>셔터 기기</td><td></td><td>모든 바늘 풀러</td></tr><tr><td>Photo-Flo 200 솔루션</td><td>B & H 사진, 비디오 및 오디오</td><td>BH #KOPF200P&nbsp; MFR #1464510</td><td>습윤제</td></tr><tr><td>압력계</td><td>Clippard Instrument Laboratory, Inc.</td><td>PG-100</td><td>0-100psi 게이지</td></tr><tr><td>참조 심지</td><td>Sutter Instruments</td><td>X050300</td><td></td></tr><tr><td>참조 심지 홀더</td><td>Sutter Instruments</td><td>M100019</td><td></td></tr><tr><td>레귤레이터</td><td>Clippard Instrument Laboratory, Inc.</td><td>01-Mar</td> Danco 모델 # 59849 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>T 피팅</td><td>Clippard Instrument Laboratory, Inc.</td>의 연결을위한 # 10-32 포트가 필요합니다.<td>15002-2-pkg</td><td></td></tr><tr><td>나사산 바</td><td></td><td></td> 나사산 <td>막대 또는 나사산 끝이 있는 막대. 스레드는 10-32여야 합니다.</td></tr><tr><td>우레탄 튜빙</td><td>Clippard Instrument Laboratory, Inc.</td><td>URH1-0804-BLT-050</td><td></td></tr></tbody></table>

바늘 개방에 대한 피드백을 위해 일정한 공기 압력을 사용하는 미세 주입 바늘의 습식 베벨링

Wet Beveling of Microinjection Needles Utilizing Constant Air Pressure for Feedback on Needle Opening

위에서 설명한 절차는 일관되게 날카로운 미세 주입 바늘을 생성합니다. 날카로운 바늘은 모기 배아와 같은 부드러운 융모막 곤충 배아에 배아 막의 저항이 거의 또는 전혀 없이 삽입할 수 있는 것이 특징입니다. 유전자 변형을 위해 모기 배아를 미세 주입하면 배아막은 상대적으로 탄력이 있습니다. 무딘 바늘을 배아막에 밀어 넣으면 움푹 들어간 곳이 생깁니다(그림 4B). 바늘을 뒤로 당기면 멤브레인이 모양을 되찾습니다. 충분한 압력이 가해지면, 무딘 바늘은 결국 막을 뚫고 나가게 될 것이고, 배질이 밖으로 새어 나올 가능성이 높습니다. 바늘이 날카로울수록 바늘이 배아막에 밀착될 때 움푹 들어간 곳이 적습니다(그림 4E). 막이 찢어지는 대신, 날카로운 바늘이 막으로 빠져나가 배아에 거의 또는 전혀 손상을 입히지 않습니다. 이상적인 바늘을 사용하면 바늘이 배아 속으로 미끄러질 때 배아 막의 움푹 들어간 곳이 거의 없습니다.
UM-ITF(University of Maryland Insect Transformation Facility)는 학계 및 산업계의 고객을 위해 유전자 변형 곤충을 만드는 서비스 시설입니다. 이 시설은 모기 배아의 미세 주입을 위해 비스듬한 바늘을 사용합니다. 2023년 1월부터 2023년 12월까지 UM-ITF는 56개 클라이언트 프로젝트에서 12,795개의 흰줄숲모기 배아를 주입했습니다(표 1). 베벨 니들을 사용함으로써 UM-ITF는 프로젝트 전반에 걸쳐 평균 31%의 주입 후 해치를 유지할 수 있었습니다(표 2). 또한 UM-ITF는 고객과의 프로젝트 후 후속 조치를 통해 결정된 96%의 주입 성공률을 유지할 수 있었습니다(표 2). 주입 성공은 주입된 주입 물질(CRISPR 가이드, Cas9 단백질, 트랜스포존 벡터 플라스미드 등)이 유전자 변형을 생성할 수 있는 방식으로 프로젝트의 배아에 전달되었는지, 기본적으로 CRISPR Indel 생성, 클라이언트 트랜스포존 기반 벡터의 삽입 또는 주입 품질 관리 벡터의 삽입(트랜스포존은 프로모터 플러스 마커로 끝남)의 증거가 있는지에 대한 척도입니다. 다시 말해, 주입된 성분이 제대로 작동한다면 주사가 유전자 변형을 일으킬 만큼 충분히 좋은가. 유전자 변형 프로젝트의 성공에 기여하는 많은 요인이 있으며 날카로운 바늘을 사용한 고품질 미세 주입이 성공의 핵심 요소입니다. 위의 프로토콜에 설명된 절차를 사용하여 니들을 베벨링하면 UM-ITF가 고품질의 날카로운 미세주입 니들을 일관되게 생산할 수 있으므로 UM-ITF가 일관되게 성공적인 주입을 제공할 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66767/66767fig01.jpg"> 그림 1: 공기 시스템 구성 요소 및 미세모세관에 대한 연결의 개략도. 공기는 공기 공급 장치(하우스 에어 또는 에어 실린더)에서 우레탄 튜브 시스템을 통해 모세관 바늘로 전달됩니다. 우레탄 튜브는 호스 연결부(HC)로 레귤레이터(R)와 압력계에 연결되며, 호스 연결부는 호스 커넥터와 호스 클램프로 구성됩니다. 호스 연결은 레귤레이터(R) 및 압력 게이지 바닥의 10-32 나사 암 연결부에 나사로 고정됩니다. T 커넥터(T)는 레귤레이터(R)에 연결되어 압력계와 바늘 홀더(NH) 사이에 공기를 흘려보냅니다. 우레탄 튜브는 바늘 홀더(NH)와 함께 제공되는 루어 커넥터(LC)로 바늘 홀더에 연결됩니다. 공기 공급 장치에 대한 연결은 사용하는 공기 공급 장치에 따라 다릅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66767/66767fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66767/66767fig02.jpg"> 그림 2: 매니퓰레이터 부품 및 공기 설정. 매니퓰레이터 부품: a. 거친 조정 손잡이, b. 미세 조정 손잡이, c. 캘리퍼스, d. WPI 바늘 홀더, e. 각도 게이지, f. 고정 clamp 및 자전거 펜더 클립, g. 루어 어댑터 및 루어 호스 커넥터, h. 우레탄 튜브. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66767/66767fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66767/66767fig03.jpg"> 그림 3: 연마판 회전과 관련된 바늘 배치. (A) 베벨링 중 바늘의 적절한 배치. 비스듬히 깎을 바늘은 회전에 수직이고 회전과 일직선 사이 어딘가에 배향 된 회전 연마판에 놓아야하며, 여기서 회전은 바늘 끝에서 멀어집니다. (B) 부적절한 바늘 배치. 이 방향의 연마판 회전은 연마판 표면이 팁 아래가 아닌 바늘 팁 쪽으로 밀려나게 합니다. 이 방향에서는 베벨링이 부드럽게 발생하지 않을 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66767/66767fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66767/66767fig04.jpg"> 그림 4: 날카롭지 않은 바늘과 날카로운 바늘에 의한 바늘 삽입 비교. (A-C) 날카롭지 않은 바늘과 (D-F) 날카로운 바늘. (A) 및 (D)는 바늘이 배아에 접촉하기 전에 포착되었습니다. (B)와 (E)는 바늘이 배아막을 뚫기 직전의 지점에 있고, (C)와 (F)는 바늘 피어싱 직후의 지점에 있습니다. (B)의 흰색 화살표는 날카롭지 않은 바늘이 뚫리기 위해 더 큰 압력을 가해야 하기 때문에 배아막이 움푹 들어가 있음을 나타냅니다. (E)의 검은색 화살표는 날카로운 바늘로 인해 바늘 피어싱이 쉽게 이루어졌기 때문에 움푹 들어간 곳이 없음을 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66767/66767fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 1: 2023년 1월부터 2023년 12월까지의 UM-ITF Aedes 프로젝트. 각 프로젝트에 대해 주입된 배아 수, 이러한 주입된 배아에서 부화한 유충의 수, 주입된 배아 총계당 부화한 유충의 비율이 포함된 UM-ITF Aedes 미세주입 프로젝트 목록. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66767/Table%201_RE.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 2: UM-ITF Aedes 프로젝트 결과. UM-ITF는 곤충 유전자 변형을 위한 미세주사 서비스를 제공하는 서비스 시설입니다. 이 표에는 2023년 1월부터 2023년 12월까지 ITF가 투입한 Aedes 프로젝트의 수가 나열되어 있습니다. 프로젝트 후속 요청에 응답한 클라이언트 수로, 응답이 주입 프로젝트의 성공 또는 실패를 나타냅니다. 성공적인 프로젝트는 주사 물질이 유전자 변형을 일으킬 수 있도록 개발 중인 배아에 한 시간과 위치에서 미세 주입된 프로젝트와 유전자 변형의 부족으로 인해 성공하지 못한 것으로 간주되는 프로젝트의 수. 2023년 1월부터 2023년 12월까지의 기간 동안 Aedes 미세 사출 프로젝트의 평균 부화율. 프로젝트 성공률과 고객 응답률. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66767/table%202_RE.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Microinjection needles are a critical tool in the delivery of genome modification reagents, CRISPR components (guide RNAs, Cas9 protein, and donor ...

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

출처: Poland, R. et al. 동기 부여된 행동의 분자 기질을 연구하기 위한 설치류 뇌 미세 주사. J. Vis. 경험. (2015년)이 비디오에서는 주사기와 마이크로인젝터 튜브로 구성된 물로 채워진 미세 주입 설정이 정확한 약물 전달을 위해 사용됩니다. 사전 이식된 가이드 캐뉼라가 있는 쥐는 표적 뇌 미세 주사를 받아 조직 손상을 최소화하면서 깨어 있는 동물에게 치료제를 정확하게 투여할 수 있습니다.

깨어 있는 설치류 뇌에 치료제의 미세 주입 기반 전달

출처: Vanegas, M. I., et al. 약물 주입 및 전기생리학을 결합하기 위한 Microinjectrode 시스템. J. Vis. 경험. (2019년)이 비디오는 정확한 부피 추적을 위해 유성 마커 용액을 사용하고 신경 기록 및 약물 주입을 동시에 가능하게 하는 모세관을 통해 약물 용액을 전달하는 미세 전극 기반 미세유체 장치를 보여줍니다.

약물 주입 및 전기생리학 결합을 위한 미세유체 기반 미세 주입 시스템

출처: Paolone, G., et al. 설치류 뇌의 미세 주사를 위한 맞춤형 바늘. J. Vis. 경험. (2018).이 비디오는 구멍이 있는 석영 마이크로니들을 사용하여 설치류 뇌 마이크로니들 주사를 보여줍니다. 마이크로니들은 분사 속도를 제어하기 위해 주사기와 마이크로펌프에 부착됩니다. 주사액이 담긴 바늘을 전달 속도를 낮게 설정한 상태에서 뇌에 삽입합니다. 일단 배치되면 배송 속도가 빨라집니다. 잠시 멈춘 후 바늘을 빼냅니다.

석영 마이크로니들을 사용한 설치류 뇌 미세주사

설치류는 행동과 복잡한 정신 장애의 분자 기질을 조사하기에 적합한 모델입니다. 깨어 있는 설치류의 뇌 미세주입은 질병 기질을 밝히는 데 사용할 수 있습니다. 효율적이고 사용자 정의 가능한 뇌 미세주입 방법과 동기 부여를 정량화하는 조작적 패러다임의 실행이 제시됩니다.

쥐 뇌 미세 주입은 분자 기판 동기를 행동을 연구하기 위해

우리는 여기 석 바늘을 사용 하 여 쥐 두뇌에 있는 microinjection에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 바늘 하지 감지 조직 손상을 생산 하 고 깊은 지역에도 안정적인 전달. 또한, 그들은 맞춤된 설계에 의해 연구의 필요에 적응 시킬 수 있다 하 고 다시 사용 될 수 있습니다.

쥐 두뇌에 있는 Microinjections에 대 한 개인화 된 바늘

어떻게 마이크로 및 photomanipulation 기술이 FRAP photoactivation 활성화 운동 매개 변수 결정 및 마이그레이션 내 단백질의 spatiotemporal 역학 셀 설명 합니다. 실험 정보 subcellular 역학과 운동 성 레 귤 레이 터 또는 기본 말라 골격의 회전율을 포함합니다.

Micromanipulation 기법 전체적 역동성의 분석 및 Cytoskeletal 레 귤 레이 터의

zebrafish 모델 시스템을 포함 한 광학 선명도, 급속 한 외부 개발, 많은 귀중 한 기능을가지고 있으며, 청각과 균형의 분야에 특별 한 중요성의 외부 감각 머리 세포 이다. 이 문서 설명 어떻게 유전자 변형 zebrafish 토토 mechanosensation 머리 세포와 연 접 기능을 시험 하는 데 사용할 수 있습니다.

애벌레 Zebrafish의 측면 라인 세포의 생체 내 칼슘 이미징

당사는 전기 생리학을 위해 설계된 마이크로인로드 시스템을 제시하고 선택적 약물 주입과 함께 실험 프로브(즉, 나노센서, 마이크로전극)의 보조 전달을 지원합니다. 널리 이용 가능한 미세유체 성분은 프로브를 함유하는 캐뉼라에 결합된다. 마이크로 인젝트 로드 건설을위한 단계별 프로토콜이 포함되어 있으며, 마카크 피질에서 muscimol 주입 중 결과가 있습니다.

결합 된 약물 주입 및 전기 생리학을위한 마이크로 인젝트 로드 시스템

CRISPR/Cas9는 비모델 유기체에서 유전자 기능을 특성화하는 데 점점 더 사용됩니다. 이 프로토콜은 주입 믹스 준비에서 모기 배아를 획득하고 주입하는 것뿐만 아니라 주입 된 모기와 원하는 돌연변이에 대한 자손을 후면, 교차 및 선별하는 방법에 이르기까지 Culex pipiens의녹아웃 라인을 생성하는 방법을 설명합니다.

CRISPR/Cas9를 사용하여 Null 돌연변이를 생성하기 위해 컬렉스 모기의 배아를 준비하고 주입합니다.

Xenopus Laevis의 Oocytes의 Microinjection

배우세요 기압을 이용한 미세 주입 바늘 습식 베벨링 기법으로 일관된 바늘 개방 크기를 제어하는 방법입니다. 이 프로토콜은 유전자 변형 곤충 연구에 필요한 날카로운 바늘을 효율적으로 제작할 수 있게 합니다.

바늘 개방에 대한 피드백을 위해 일정한 공기 압력을 사용하는 미세 주입 바늘의 습식 베벨링

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