Name: Isolation of Mitochondria for Mitochondrial Supercomplex Analysis from Small Tissue and Cell Culture Samples(소조직 및 세포 배양 샘플에서 미토콘드리아 초복합체 분석을 위한 미토콘드리아 분리) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: 배우세요 소량 샘플에서 미토콘드리아 초복합체를 분석하는 방법을. 이 기술은 호흡 초복합체 조립과 기능을 연구하여 암 및 신경퇴행성 질환에서 미토콘드리아 역할을 이해하는 데 도움을 줍니다.

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이 연구는 https://ciencia.sede.gob.es/(Ministerio de Ciencia e Innovación)의 보조금 번호 "PGC2018-095795-B-I00"과 https://www.aragon.es/(Diputación General de Aragón)의 보조금 "Grupo de Referencia: E35_17R" 및 보조금 번호 "LMP220_21"를 통해 PF-S 및 RM-L에 지원되었습니다.

Supercomplex 분석을 위한 작은 조직 샘플의 미토콘드리아 분획

<ol><li>Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+active+mitochondrial+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Respiratory active mitochondrial supercomplexes.</a> Mol Cell. 32 (4), 529-539 (2008).</li>
<li>Schagger, H., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supercomplexes+in+the+respiratory+chains+of+yeast+and+mammalian+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria.</a> EMBO J. 19 (8), 1777-1783 (2000).</li>
<li>Schagger, H., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ratio+of+oxidative+phosphorylation+complexes+I-V+in+bovine+heart+mitochondria+and+the+composition+of+respiratory+chain+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The ratio of oxidative phosphorylation complexes I-V in bovine heart mitochondria and the composition of respiratory chain supercomplexes.</a> J Biol Chem. 276 (41), 37861-37867 (2001).</li>
<li>Acin-Perez, R., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+function+of+the+respiratory+supercomplexes%3A+the+plasticity+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">The function of the respiratory supercomplexes: the plasticity model.</a> Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 444-450 (2014).</li>
<li>Cogliati, S., Cabrera-Alarcon, J. L., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+functional+role+of+the+electron+transport+chain+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Regulation and functional role of the electron transport chain supercomplexes.</a> Biochem Soc Trans. 49 (6), 2655-2668 (2021).</li>
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<li>Kohler, A., Barrientos, A., Fontanesi, F., Ott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+significance+of+mitochondrial+respiratory+chain+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">The functional significance of mitochondrial respiratory chain supercomplexes.</a> EMBO Rep. 24 (11), e57092(2023).</li>
<li>Lapuente-Brun, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supercomplex+assembly+determines+electron+flux+in+the+mitochondrial+electron+transport+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain.</a> Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).</li>
<li>Milenkovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preserved+respiratory+chain+capacity+and+physiology+in+mice+with+profoundly+reduced+levels+of+mitochondrial+respirasomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Preserved respiratory chain capacity and physiology in mice with profoundly reduced levels of mitochondrial respirasomes.</a> Cell Metab. 35 (10), e1797 1799-1813 (2023).</li>
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<li>Moreno-Loshuertos, R., Fernández-Silva, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoreno-Loshuertos%2C+R+%22Clinical+Bioenergetics%22">Clinical Bioenergetics</a>. Ostojic, S. , Academic Press. 3-60 (2021).</li>
<li>Fernandez-Vizarra, E., Ugalde, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+assembly+of+the+mitochondrial+respiratory+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Cooperative assembly of the mitochondrial respiratory chain.</a> Trends Biochem Sci. 47 (12), 999-1008 (2022).</li>
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<li>Mukherjee, S., Ghosh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+of+mitochondrial+respiratory+chain+assembly+and+its+relation+to+mitochondrial+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism of mitochondrial respiratory chain assembly and its relation to mitochondrial diseases.</a> Mitochondrion. 53, 1-20 (2020).</li>
<li>Nesci, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+supramolecular+structure+of+the+mitochondrial+oxidative+phosphorylation+system%3A+implications+for+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Life+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Molecular and supramolecular structure of the mitochondrial oxidative phosphorylation system: implications for pathology.</a> Life (Basel). 11 (3), 242(2021).</li>
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<li>Ramirez-Camacho, I., Garcia-Nino, W. R., Flores-Garcia, M., Pedraza-Chaverri, J., Zazueta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+mitochondrial+supercomplexes+assembly+in+metabolic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Mol+Basis+Dis%22%5BJournal%5D)">Alteration of mitochondrial supercomplexes assembly in metabolic diseases.</a> Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1866 (12), 165935(2020).</li>
<li>Gonzalez-Rodriguez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+mitochondrial+complex+I+induces+progressive+parkinsonism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Disruption of mitochondrial complex I induces progressive parkinsonism.</a> Nature. 599 (7886), 650-656 (2021).</li>
<li>Novack, G. V., Galeano, P., Castano, E. M., Morelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+supercomplexes%3A+physiological+organization+and+dysregulation+in+age-related+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial supercomplexes: physiological organization and dysregulation in age-related neurodegenerative disorders.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 11, 600(2020).</li>
<li>Ramirez-Camacho, I., Flores-Herrera, O., Zazueta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relevance+of+the+supramolecular+arrangements+of+the+respiratory+chain+complexes+in+human+diseases+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">The relevance of the supramolecular arrangements of the respiratory chain complexes in human diseases and aging.</a> Mitochondrion. 47, 266-272 (2019).</li>
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<li>Marco-Brualla, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+ND2+subunit+of+mitochondrial+complex+I+are+sufficient+to+confer+increased+tumorigenic+and+metastatic+potential+to+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Mutations in the ND2 subunit of mitochondrial complex I are sufficient to confer increased tumorigenic and metastatic potential to cancer cells.</a> Cancers (Basel). 11 (7), 1027(2019).</li>
<li>Moreno-Loshuertos, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+hot+can+mitochondria+be%3F+Incubation+at+temperatures+above+43+degrees+C+induces+the+degradation+of+respiratory+complexes+and+supercomplexes+in+intact+cells+and+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">How hot can mitochondria be? Incubation at temperatures above 43 degrees C induces the degradation of respiratory complexes and supercomplexes in intact cells and isolated mitochondria.</a> Mitochondrion. 69, 83-94 (2023).</li>
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<li>Cogliati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+super-assembly+of+respiratory+complexes+III+and+IV%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanism of super-assembly of respiratory complexes III and IV.</a> Nature. 539 (7630), 579-582 (2016).</li>
<li>Gonzalez-Franquesa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-spectrometry-based+proteomics+reveals+mitochondrial+supercomplexome+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Mass-spectrometry-based proteomics reveals mitochondrial supercomplexome plasticity.</a> Cell Rep. 35 (8), 109180(2021).</li>
<li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+applications+of+blue-native+and+clear-native+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Features and applications of blue-native and clear-native electrophoresis.</a> Proteomics. 8 (19), 3974-3990 (2008).</li>
<li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+electrophoretic+techniques+to+identify+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions.</a> Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).</li>
<li>Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+isolation+from+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial isolation from skeletal muscle.</a> J Vis Exp. (49), e2452(2011).</li>
<li>Lai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mitochondrial+subpopulations+from+skeletal+muscle%3A+Optimizing+recovery+and+preserving+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiol+%28Oxf%29%22%5BJournal%5D)">Isolation of mitochondrial subpopulations from skeletal muscle: Optimizing recovery and preserving integrity.</a> Acta Physiol (Oxf). 225 (2), e13182(2019).</li>
<li>Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+electrophoresis+for+isolation+of+mitochondrial+oxidative+phosphorylation+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Native electrophoresis for isolation of mitochondrial oxidative phosphorylation protein complexes.</a> Methods Enzymol. 260, 190-202 (1995).</li>
<li>Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Blue native PAGE.</a> Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).</li>
<li>Chomyn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-mediated+transformation+of+mtDNA-less+human+cells%3A+analysis+of+phenotypic+variability+among+clones+from+normal+individuals--and+complementation+behavior+of+the+tRNALys+mutation+causing+myoclonic+epilepsy+and+ragged+red+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Platelet-mediated transformation of mtDNA-less human cells: analysis of phenotypic variability among clones from normal individuals--and complementation behavior of the tRNALys mutation causing myoclonic epilepsy and ragged red fibers.</a> Am J Hum Genet. 54 (6), 966-974 (1994).</li>
<li>Moreno-Loshuertos, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+reactive+oxygen+species+production+explain+the+phenotypes+associated+with+common+mouse+mitochondrial+DNA+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Differences in reactive oxygen species production explain the phenotypes associated with common mouse mitochondrial DNA variants.</a> Nat Genet. 38 (11), 1261-1268 (2006).</li>
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<li>Cogliati, S., Herranz, F., Ruiz-Cabello, J., Enríquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digitonin+concentration+is+determinant+for+mitochondrial+supercomplexes+analysis+by+BlueNative+page%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Bioenerg%22%5BJournal%5D)">Digitonin concentration is determinant for mitochondrial supercomplexes analysis by BlueNative page.</a> Biochim Biophys Acta Bioenerg. 1862 (1), 148332(2021).</li>
</ol>

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

여기에 설명된 프로토콜에 도입된 방법론적 조정은 미토콘드리아 복합 활성(충분한 양의 샘플의 가용성이 저하될 때 중요함)을 유지하고 조직 또는 세포주의 예상되는 SC 패턴을 재현하면서 손실을 피하고 수율을 높이기 위한 것입니다( 그림 2C 참조).). 이러한 목적으로 SC를 제대로 검출하는 데 높은 미토콘드리아 순도가 필요하지 않기 때문에 가능할 때마다 단계 수, 시간 및 부피를 줄였습니다.
따라서, 저속 원심분리에 의한 핵 및 파괴되지 않은 세포의 균질화 및 제거 후, 미토콘드리아를 포함하는 상층액은 1.5mL 폴리프로필렌 튜브로 전달되고, 조잡한 미토콘드리아 분획을 얻기 위한 후속 원심분리는 기존 프로토콜에 비해 속도를 높이고 시간 및 부피를 줄임으로써 미세분리기에서 수행됩니다. 이를 통해 상대적으로 짧은 시간에 여러 샘플을 처리 할 수 있습니다 : 면밀한 추정은 10 개의 샘플을 ~ 2-2.5 시간 내에 처리 할 수 있다는 것입니다 (균질화 시작 (프로토콜 단계 1.6. 또는 조직에 대한 동등성) 겔에 적재 준비가된 SCs 분획의 집착 (프로토콜 단계 3.7) 활동을 유지하면서 손실을 최소화합니다. 원래 Schägger의 그룹 프로토콜과 관련된 또 다른 변화는 SCs 분획의 폐쇄를 멤브레인 용해화 후 초원심분리 단계를 간단한 미세분리 원심분리(프로토콜 단계 3.4)로 대체하는 것입니다.
절차에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 세포 파괴의 효율성, 특히 배양 세포의 경우(프로토콜 단계 1.8 이후의 참고 참조) 및 특히 작은 세포의 경우. 조직과 세포주는 세포 파괴에 있어 다양한 난이도를 나타냅니다: 예를 들어, 심장과 근육에서 이 단계는 일반적으로 간이나 비장보다 덜 효율적이지만, 전자가 더 높은 미토콘드리아 함량을 가지고 있기 때문에 수율로 보상됩니다. 근육이나 심장에서 분리할 때 미토콘드리아 수율을 향상시키는 한 가지 대안은 균질화 전에 샘플에 트립신을 투여하는 것입니다. 뇌는 수동 균질화로 인해 세포 파괴 효율이 낮은 또 다른 조직으로, 이는 더 온화하고 덜 효율적이며, 이전에 보고된 바와 같이 이 조직의 세포 유형 변동이 더 높기 때문일 수도 있습니다 42. 이는 프로토콜(2.7.4단계)에서 제안한 대로 두 번째 균질화 단계로 부분적으로 보상할 수 있습니다. 반면에, 세포 파손이 과도하면 SC를 포함하는 최종 샘플이 전기 영동 작동을 방해할 수 있는 핵 DNA 단편으로 오염될 수 있습니다. 이 문제는 미토콘드리아 막을 용해시키기 위해 디지토닌을 첨가할 때 샘플의 점도가 증가하는 것으로 나타나며 DNAse I로 처리하여 해결할 수 있습니다.
둘째, 세제 대 단백질 비율이 너무 낮으면 멤브레인 용해의 효율성이 떨어지고 응집체 형성이 가능해집니다. 이는 겔에서 고분자량 SC에서 불량한 분리능으로 나타나거나( 그림 4 참조) 올리고머(43)에 해당하는 여러 밴드를 제공하는 CIV로 나타날 수 있습니다. 비율이 너무 높으면 SC(주로 CI-SC)의 세분화로 이어질 수 있습니다. 셋째, 전체 절차 동안 샘플을 가열하지 않고( 그림 4 참조) SC 조립 상태에 영향을 줄 수 있으므로 반복적인 동결-해동 주기를 피하는 것이 중요합니다.
표 2에서는 여러 세포 유형 및 조직 샘플에 대한 예상 수율의 요약을 제시합니다. 값은 근사치이며 셀 파괴 효율과 소스의 특성에 따라 달라집니다. 조직의 경우, 출발 물질이 동결되면 신선한 샘플보다 더 높은 수율을 제공하는 경향이 있습니다. 로딩할 수 있는 레인의 수(레인당 50-60μg의 미토콘드리아 단백질 부하를 고려)의 추정치가 제시됩니다.
여기에 제시된 프로토콜은 작은 변형으로 다양한 조직 및 세포 유형을 다루며, 신선 또는 냉동 샘플과 함께 사용할 수 있으며, 값비싼 정제 키트 또는 그래디언트를 사용하지 않고 간단한 장비와 상대적으로 저렴한 비용이 필요합니다. 그러나 예를 들어 뇌 시냅스 미토콘드리아 또는 근육 근막하 미토콘드리아와 같은 특정 미토콘드리아 집단이 분석 대상인 경우뿐만 아니라 특정 세포 유형 또는 샘플에 사용하기 위해 몇 가지 조정이 필요할 수 있습니다.
정확한 생리학적 역할과 병리학적 상황에서 SC의 잠재적 관여는 아직 정의되지 않았기 때문에 SC의 역학과 SC의 조립, 안정성 및 기능에 영향을 미치는 요인에 대한 분석이 필요합니다. 당사의 프로토콜은 특히 여러 실험 조건을 비교해야 하는 경우, 작은 샘플 크기와 다양한 세포 유형 및 조직에서 SC 패턴에 대해 재현 가능한 결과를 얻을 수 있는 귀중한 도구가 될 수 있습니다29.

초복합체(SC)는 개별 호흡 사슬 복합체 1,2 사이의 초분자 결합입니다. SC의 초기 식별과 Schägger 2,3 그룹에 의한 그 구성에 대한 설명 이후, 나중에 다른 그룹에 의해 확인된 이래, SC는 서로 다른 화학량론에서 호흡기 복합체 I, III 및 IV(CI, CIII 및 CIV)를 포함하고 있음이 확인되었습니다. SC의 두 가지 주요 집단을 정의할 수 있는데, CI(및 CIII 단독 또는 CIII 및 CIV)를 포함하고 분자량이 매우 높은(MW, 더 작은 SC의 경우 ~1.5MDa부터 시작: CI + CIII2) 및 CIII 및 CIV를 포함하지만 CI는 포함하지 않고 훨씬 더 작은 크기(예: ~680kDa의 CIII2 + CIV). 이러한 SC는 내부 미토콘드리아 막에 유리 복합체와 공존하며 비율도 다릅니다. 따라서, CI는 대부분 관련 형태에서 발견되지만(즉, SCs에서: 소의 심장에서 ~80%, 많은 인간 세포 유형에서 90% 이상)3, CIV는 자유 형태(소의 심장에서 80% 이상)에서 매우 풍부하며, CIII는 보다 균형 잡힌 분포를 보여줍니다(더 풍부한 자유 형태의 경우 ~40%, Dimer로, in bovine heart).
그들의 존재는 현재 일반적으로 받아들여지고 있지만, 그들의 정확한 역할은 여전히 논쟁 중이다 4,5,6,7,8,9,10. 가소성 모델에 따르면, 세포 유형 또는 대사 상태에 따라 SC와 개별 복합체의 비율이 상이하게 존재할 수 있다 1,7,11. 조립체의 이러한 역동적 인 특성으로 인해 셀은 사용 가능한 연료의 사용과 환경 변화에 대응하여 산화 인산화 (OXPHOS) 시스템의 효율성을 조절 할 수 있습니다 4,5,7. SC는 또한 활성 산소 종 생성 속도를 제어하고 개별 복합체 4,12,13,14의 안정화 및 회전율에 참여할 수 있습니다. SC 조립 상태의 수정은 다양한 생리학적 및 병리학적 상황(15,16) 및 노화 과정(17)과 관련하여 설명되었다.
따라서, SC 패턴의변화는 성장에 사용되는 탄소원에 따라 효모에서 설명되었으며2, 포도당이 갈락토스4로 치환될 때 배양된 포유류 세포에서 설명되었습니다. 또한 공복 후 생쥐의 간에서변화가 보고되었으며8 미토콘드리아 지방산 산화가 차단된 성상세포(astrocyte)에서도 변화가 보고되었다18. 또한, 바스 증후군(Barth syndrome)19, 심부전(heart failure)20, 여러 대사 장애(multiple metabolic21) 및 신경학적장애(neurological 22,23,24), 그리고 다른 종양(25,26,27,28)에서 SC와 OXPHOS의 감소 또는 변화가 발견되었다. SC 조립 및 수준의 이러한 변화가 이러한 병리학적 상황에서 주요 원인인지 또는 2차 효과를 나타내는지 여부는 아직 조사 중입니다15,16. 다양한 방법론이 SC의 조립 및 기능에 대한 정보를 제공할 수 있습니다. 여기에는 활성 측정 8,29, 초구조 분석(30,31) 및 단백질체학(32,33)이 포함됩니다. 점점 더 많이 채택되고 있으며 앞서 언급한 방법론 중 일부의 시작점이 되는 유용한 대안은 Schägger의 그룹34,35에서 이 목적을 위해 개발한 블루 네이티브(BN) 전기영동에 의한 SC 조립 상태의 직접 측정입니다.
이 접근법은 미토콘드리아 막을 얻고 용해시키기 위해 재현 가능하고 효율적인 절차가 필요하며 겔 내 활성 분석(IGA), 2차원 전기영동 및 웨스턴 블롯(WB)과 같은 다른 기술로 보완할 수 있습니다. BN 전기영동에 의한 SC 동역학 연구의 한계는 시작 세포 또는 조직 샘플의 양일 수 있습니다. SC 조립 및 기능 분석을 위한 일련의 프로토콜은 Schägger의 그룹 분석법에서 채택되었으며, 20mg의 조직부터 시작하여 신선 또는 냉동 세포 또는 조직 샘플에 적용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>아세트산</td><td>PanReac</td><td>131008</td><td></td></tr><tr><td>Aminocaproic acid</td><td>Fluka Analytical</td><td>7260</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Bis Tris</td><td>Acrons Organics</td><td>327721000</td><td></td></tr><tr><td>Bradford assay</td><td>Biorad</td><td>5000002</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Blue G-250</td><td>Serva</td><td>17524</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Blue R-250</td><td>Merck</td><td>1125530025</td><td></td></tr><tr><td>Cytochrome c</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2506</td><td></td></tr><tr><td>Diamino&nbsp; 벤지딘 (DAB)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5637</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5628</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>PanReac</td><td>131669</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>지방산 무함유 BSA</td><td>Roche</td><td>10775835001</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>PanReac</td><td>A1067</td><td></td></tr><tr><td>균질화기 테프론 유봉</td><td>Deltalab</td><td>196102</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>PanReac</td><td>121512</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>PanReac</td><td>121509</td><td></td></tr><tr><td>만니톨</td><td>시그마-알드리치</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>랩켐</td><td>MTOL-P0P</td><td></td></tr><tr><td>MgSO<>4</td><td>PanReac</td><td>131404</td> 미니 트랜스 블롯 셀 BioRad 1703930 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>시그마-알드리치</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>MTCO1 단클론 항체</td><td>Invitrogen</td><td>459600</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>Roche</td><td>10107735001</td><td></td></tr><tr><td>NativePAGE 3 to 12% Mini Protein Gels</td><td>Invitrogen</td><td>BN1001BOX</td><td></td></tr><tr><td>NativePAGE 음극 완충액 첨가제 (20x)</td><td>Invitrogen</td><td>BN2002</td><td></td></tr><tr><td>NativePAGE Running Buffer (20x)&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>BN2001</td><td></td></tr><tr><td>NDUFA9 단클론 항체</td><td>Invitrogen</td><td>459100</td><td></td></tr><tr><td>니트로블루 테트라졸륨염(NBT)</td><td>시그마-알드리치</td><td>N6876</td><td></td></tr><tr><td>Pb(NO3)2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>228621</td><td></td></tr><tr><td>PDVF 멤브레인</td><td>아머샴</td><td>10600023</td><td></td></tr><tr><td>페나진 메타설페이트(PMS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9625</td><td></td></tr><tr><td>Pierce ECL Substrate</td><td>Thermo Scientific</td><td>32106</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Merck</td><td>PMSF-RO</td><td></td></tr><tr><td>SDHA 단클론 항체</td><td>Invitrogen</td><td>459200</td><td></td></tr><tr><td>숙신산나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2378</td><td></td></tr><tr><td>스트렙토마이신/페니실린</td><td>PAN 생명공학</td><td>P06-07100</td><td></td></tr><tr><td>설탕</td><td>시그마-알드리치</td><td>S3089</td><td></td></tr><tr><td>트리스</td><td>PanReac</td><td>A2264</td><td></td></tr><tr><td>UQCRC1 단클론 항체</td><td>인비트로젠</td><td>459140</td><td></td></tr><tr><td>XCell&nbsp; SureLock Mini-Cell</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp; EI0001</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of mitochondria for mitochondrial supercomplex analysis from small tissue and cell culture samples(소조직 및 세포 배양 샘플에서 미토콘드리아 초복합체 분석을 위한 미토콘드리아 분리) 

Isolation of Mitochondria for Mitochondrial Supercomplex Analysis from Small Tissue and Cell Culture Samples

지난 수십 년 동안 호흡기 초복합체(SC)의 존재에 대해 축적된 증거는 미토콘드리아 전자 수송 사슬 조직에 대한 우리의 이해를 변화시켰고, 이는 "가소성 모델"의 제안을 낳았습니다. 이 모델은 조직 또는 세포 대사 상태에 따라 서로 다른 비율의 SC와 복합체가 공존한다고 가정합니다. SC에서 조립의 동적 특성으로 인해 셀은 사용 가능한 연료의 사용과 전자 전달의 효율성을 최적화하여 활성 산소 종 생성을 최소화하고 셀이 환경 변화에 적응할 수 있는 능력을 선호할 수 있습니다. 
최근에는 신경퇴행성 질환(알츠하이머병, 파킨슨병), 바스 증후군(Barth Syndrome), 리 증후군(Leigh syndrome), 암(cancer) 등 다양한 질환에서 SC 조립의 이상이 보고되고 있다. 질병 진행에서 SC 어셈블리 변경의 역할은 아직 확인되지 않았습니다. 그럼에도 불구하고 SC 어셈블리 상태를 결정하기에 충분한 양의 샘플을 사용할 수 있는지는 종종 어려운 과제입니다. 이는 크기가 작거나 여러 분석을 위해 나누어야 하는 생검 또는 조직 샘플, 성장이 느리거나 미세유체 장치에서 추출한 세포 배양, 일부 1차 배양 또는 희귀 세포 또는 특정 고가의 처리(나노 입자, 매우 비싼 화합물 등)의 효과를 분석해야 하는 경우에 발생합니다. 이러한 경우 효율적이고 적용하기 쉬운 방법이 필요합니다. 이 논문은 소량의 세포 또는 조직에서 농축된 미토콘드리아 분획을 얻는 데 적합한 방법을 제시하여 기본 전기영동으로 미토콘드리아 SC의 구조와 기능을 분석한 후 겔 내 활성 분석 또는 웨스턴 블롯을 수행합니다.

위에서 설명한 프로토콜에 따라 얻어진 미토콘드리아의 수율은 세포주 또는 조직 유형, 샘플의 특성(즉, 신선 또는 냉동 조직이 사용되는 경우) 또는 균질화 공정의 효율성과 같은 여러 요인에 따라 달라집니다. 다른 세포주와 조직에서 얻은 미토콘드리아의 예상 수율은 표 2에 수집되어 있습니다. 미토콘드리아 분획이 얻어지면 다음 단계는 호흡기 SC 패턴 분석으로, BN-PAGE에 의한 미토콘드리아 샘플 용해화 및 전기영동 분리 후 IGA 분석 또는 WB 면역검출 후 수행됩니다. 그림 1 은 실행 직후 염색되지 않은 겔 레인의 양상과 배양된 세포주와 마우스 간 미토콘드리아 샘플의 표준 Coomassie 염색 후 띠 패턴을 보여줍니다.
그림 2A,B에서는 IGA 분석을 사용한 후 인간 세포와 마우스 세포의 SC 조립 패턴 간의 명확한 차이를 관찰할 수 있습니다. 따라서 유리 복합체 I은 마우스 세포에서 관찰되는 반면 인간 미토콘드리아에서는 검출되지 않습니다. 복합 IV-IGA 패턴은 두 인간 세포주에서 매우 유사하며(그림 2B) 그림 2A에서 분석된 두 마우스 세포주 간의 차이를 나타냅니다. 이러한 차이는 BL6 세포가 SCAF18의 돌연변이 변이체를 발현한다는 사실에 기인합니다.
작은 샘플에 대해 작업하기 위해 여기에 설명된 미토콘드리아 분리를 위한 프로토콜로 수득된 SC 패턴은 더 큰 샘플에 사용되는 "종래의" 프로토콜과 관련하여 유지됩니다. 이는 그림 2C에서 볼 수 있으며, 레인 1 및 6(간 3g과 BAT 1.1g에서 기존 프로토콜을 사용하여 미토콘드리아 분리 후 획득)과 각각 레인 2 및 5(여기에 제시된 프로토콜을 사용하여 두 조직의 약 0.1g에서 얻음)를 비교함으로써 볼 수 있습니다. 가소성 모델에서 제안된 바와 같이, 호흡기 복합체와 SC의 상대적 비율은 세포 유형과 대사 상태에 따라 달라집니다. 그림 2C,D에서 보인 바와 같이, 다른 조직은 다른 SC 집합 유형을 보여줍니다. 따라서 뇌 미토콘드리아는 다른 조직과 비교할 때 유리 복합체 I 수준이 매우 낮고 SC의 비율이 높으며, BAT는 CV 수치가 낮고(그림 2A) SC III + IV(그림 2D)가 높은 것이 특징입니다. 심장 미토콘드리아는 높은 수준의 SC와 CV를 나타내며, CV 조립 패턴은 배양된 세포주와 마우스 간 미토콘드리아 샘플 간에 매우 유사합니다(그림 2E).
SC 어셈블리는 또한 비장 제어 및 종양 세포에서 얻은 두 개의 샘플에 대해 그림 3 과 같이 WB로 분석할 수 있습니다. 이 경우 30-50μg의 미토콘드리아 단백질은 일반적으로 특정 항체를 가진 다양한 복합체 및 SC를 검출하기에 충분합니다. 그림 4 는 이러한 프로토콜을 적용하는 동안 발생할 수 있는 몇 가지 주요 위험을 보여줍니다. 잘못된 겔 그래디언트는 그림 4A, 레인 1에서와 같이 비정상적이고 원치 않는 이동 패턴을 생성할 수 있으며, 여기서 SC는 겔의 아크릴아마이드 농도가 정상보다 높기 때문에 레인 상부의 웰 가까이에 남아 있습니다. 고온(여기서는 37°C 및 40°C에서 10분 동안)에서 비교적 짧은 시간 동안이라도 시료를 배양하면 SC와 CI가 분해됩니다(그림 4A 레인 2-4). 마찬가지로, 세제 대 단백질 비율은 좋은 결과와 적절한 겔 분리능에 매우 중요합니다. 디지토닌 2g/단백질 g의 비율 이하에서는 띠 분리능이 점진적으로 감소하고 더 낮은 농도(0.5g/g)에서는 SC에 해당하는 영역의 도말만 볼 수 있습니다(그림 4B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66771/66771fig01.jpg"> 그림 1: 배양 세포주(L929Balbc)와 마우스 간에서 디지토닌 투과화된 미토콘드리아를 BNGE로 분리한 후 미토콘드리아 복합체 및 초복합체의 패턴. 왼쪽의 레인(1과 2)은 CV만 검출할 수 있는 런 직후의 염색되지 않은 겔의 측면을 나타내고, 오른쪽의 레인(3과 4)은 Coomassie 염색 후 밴드의 패턴을 보여줍니다. 약어: BNGE = 블루 네이티브 겔 전기영동; CV = 복소수 V; SCs = 초복합체. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66771/66771fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66771/66771fig02.jpg"> 그림 2: 다양한 세포주와 마우스 조직에서 분리한 미토콘드리아의 IGA 분석. (A,B) (A) 마우스 또는 (B) 인간 세포주에서 분리된 미토콘드리아에서 표시된 복합체의 겔 내 활성. L929Balbc는 앞서 설명한 바와 같이 Balb/cJ 마우스 혈소판의 미토콘드리아를 ρ°L929neo 세포로 전달하여 당사 실험실에서 생성된 투과연골 세포주입니다40,41. BL6 섬유아세포는 BL6 마우스의 귀 생검을 통해 우리 실험실에서 생성된 불멸화된 세포주입니다. (C) 3g의 간(1번 레인)과 1.1g의 BAT(6번 레인)로 시작하는 기존 방법 또는 여기에 제시된 프로토콜을 사용하여 분리한 마우스 미토콘드리아의 CI-IGA 패턴은 모든 경우(2번 레인, 간, 3번 레인, 심장, 4번 레인, 뇌 및 5번 BAT)로 시작합니다. (D) 마우스 간, 심장, 뇌 및 BAT 미토콘드리아의 CIV-IGA 패턴(패널 2C, 레인 2-5에 표시된 CI-IGA 후 수행). (E) 마우스 배양 세포 및 간에서 분석된 CV-IGA 활성. 레인당 약 60-75μg의 미토콘드리아 단백질이 로드되었습니다. 약어 : IGA = in-gel activity; SC = 초복합체; CI = 복합체 I; BAT = 갈색 지방 조직. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66771/66771fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66771/66771fig03.jpg"> 그림 3: 비장 샘플에서 다양한 미토콘드리아 복합체 및 초복합체의 WB 면역검출. 비장 대조군(Spleen M9) 및 종양(Tumor M9) 샘플에서 얻은 미토콘드리아 복합체 및 SC의 Blue Native PAGE 분리 후, 이를 PVDF 멤브레인으로 옮기고 표시된 CI, CIII, CIV 및 CII 소단위(각각 패널 A-D)를 인식하는 항체와 순차적으로 혼성화했습니다. 레인당 약 50μg의 미토콘드리아 단백질이 로드되었습니다. 별표는 이전 웨스턴 블롯에서 남아 있는 신호를 나타냅니다. 약어: SC = 초복합체; CI = 복합체 I; CIII = 복합체 III; CIV = 복합체 IV; CII = 복합 II. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66771/66771fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66771/66771fig04v2.jpg"> 그림 4: Blue-Native PAGE에 의한 SC 분석의 함정. 서로 다른 가용화 조건에서 (A) 신선한 쥐 간과 (B) 냉동 쥐 간에서 분리한 미토콘드리아의 CI IGA 분석. (A) 레인 1, 잘못된 겔 구배 농도(정상 8-3% 대신 13-13%). 레인 2-4, 로딩 전에 각각 얼음 위에서 또는 37°C 및 40°C에서 10분 동안 배양된 샘플. (B) 용해화를 위해 다른 디지토닌/단백질 비율을 사용하여 냉동된 쥐 간에서 얻은 미토콘드리아의 CI에 대한 IGA 후 패턴. 약어: SC = 초복합체; PAGE = 폴리아크릴아미드 겔 전기영동; CI = 복합체 I; IGA = 겔 내 활성. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66771/66771fig04largev2.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>보통</td>
			<td colspan="3">구성</td>
		</tr><tr><td>하이포토닉 버퍼(Hypotonic buffer)</td>
			<td colspan="3">10 mM 걸레, 83 mM 자당, pH 7.2</td>
		</tr><tr><td>하이퍼토닉 완충액</td>
			<td colspan="3">30mM 걸레, 250mM 자당, pH 7.2</td>
		</tr><tr><td>균질화 완충액 A</td>
			<td colspan="3">10 mM 트리스, 1 mM EDTA, 0.32 M 자당, pH 7.4</td>
		</tr><tr><td>균질화 완충액 AT</td>
			<td colspan="3">225 mM 만니톨, 1 mM EGTA, 75 mM 자당, 0.01% BSA pH 7.4</td>
		</tr><tr><td>균질화 완충액 AT2</td>
			<td colspan="3">225 mM 만니톨, 1 mM EGTA, 75 mM 자당, 0.02% BSA pH 7.4</td>
		</tr><tr><td>BN 시료 완충액</td>
			<td colspan="3">50mM NaCl, 50mM 이미다졸, 2mM 아미노카프로산, 1mM EDTA pH 7.0</td>
		</tr><tr><td>Digitonin 솔루션</td>
			<td colspan="3">50mM NaCl, 50mM 이미다졸, 5mM 아미노카프로산, 4mM PMSF에서 10% 디지토닌</td>
		</tr><tr><td>BN 로딩 버퍼</td>
			<td colspan="3">0.75M 아미노카프로산에 함유된 5% Coomassie Blue G</td>
		</tr><tr><td>BN 음극 버퍼 A</td>
			<td colspan="3">50mM 트리신, 15mM 비스-트리스 pH = 7.0 (4 °C), 0.02 % G-250 (쿠마시 브릴리언트 블루 G-250)</td>
		</tr><tr><td>BN 음극 버퍼 B</td>
			<td colspan="3">50 mM 트리신, 15 mM 비스-트리스 pH = 7.0 (4 ° C), 0.002 % G-250</td>
		</tr><tr><td>BN 양극 버퍼</td>
			<td colspan="3">50mM 비스-트리스, pH=7.0</td>
		</tr><tr><td>복합체 I IGA 기판</td>
			<td colspan="3">5mM Tris-HCl pH 7.4, 0.1mg/mL NADH, 2.5mg/mL 니트로블루 테트라졸륨(NBT)</td>
		</tr><tr><td>복합체 II IGA 기판</td>
			<td colspan="3">50mM 인산칼륨 완충액 pH 7.4, 20mM 숙신산나트륨, 0.2mM 페나진 메토설페이트(PMS), 2.5mg/mL NBT</td>
		</tr><tr><td>복합체 III IGA 기판</td>
			<td colspan="3">50mM 인산칼륨 완충액 pH 7.2, 0.05% 디아미노벤지딘(DAB)</td>
		</tr><tr><td>복합체 IV IGA 기질</td>
			<td colspan="3">CIII 및 50μM 사이토크롬 c와 동일한 솔루션</td>
		</tr><tr><td>복합체 V IGA 기판</td>
			<td colspan="3">35 mM 트리스, 270 mM 글리신 pH 8.3, 14 mM MgSO4, 0.2 % Pb (NO3) 2, 8 mM ATP</td>
		</tr><tr><td>염색 용액</td>
			<td colspan="3">Coomassie 염료 R-250은 40 % 메탄올 및 10 % 아세트산에서 0.25 %</td>
		</tr><tr><td>탈색/정착 용액</td>
			<td colspan="3">40% 메탄올, 10% 아세트산</td>
		</tr><tr><td>전송 버퍼</td>
			<td colspan="3">48 mM 트리스, 39 mM 글리신, 20 % 메탄올</td>
		</tr></tbody></table>표 1: 버퍼 및 미디어 구성.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>세포 유형/조직</td>
			<td>시작 금액</td>
			<td>예상 수율(μg 미토콘드리아 단백질)</td>
			<td>레인 수(50-60 μg/lane)</td>
		</tr><tr><td>배양된 세포</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>MDA-MB-468 (영어)</td>
			<td>100μL vpc</td>
			<td>300-400 마이크로그램</td>
			<td>6-9</td>
		</tr><tr><td>143B 파생</td>
			<td>100μL vpc</td>
			<td>200-350 마이크로그램</td>
			<td>4-7</td>
		</tr><tr><td>마우스 섬유아세포(Mouse Fibroblasts)</td>
			<td>100μL vpc</td>
			<td>150-200 마이크로그램</td>
			<td>3-5</td>
		</tr><tr><td>심장</td>
			<td>100의 mg의</td>
			<td>400-500 마이크로그램</td>
			<td>10-12*</td>
		</tr><tr><td>골격근</td>
			<td>100의 mg의</td>
			<td>300-400 마이크로그램</td>
			<td>8-10*</td>
		</tr><tr><td>간</td>
			<td>100의 mg의</td>
			<td>400-500 마이크로그램</td>
			<td>8-10</td>
		</tr><tr><td>지라</td>
			<td>50의 mg의</td>
			<td>150-250 마이크로그램</td>
			<td>3-5</td>
		</tr><tr><td>박쥐</td>
			<td>100의 mg의</td>
			<td>200-300 마이크로그램</td>
			<td>4-6</td>
		</tr><tr><td>뇌</td>
			<td>100의 mg의</td>
			<td>250-300 마이크로그램</td>
			<td>5-8</td>
		</tr></tbody></table>표 2: 다양한 세포 유형 및 마우스 조직에서 얻은 미토콘드리아의 예상 수율. 심장이나 골격근에서 얻은 미토콘드리아 분획은 다른 조직에서 얻은 것보다 더 순수합니다. 따라서, 더 적은 양이 겔(*)에 적재될 수 있다.

이 프로토콜은 소량의 샘플만 사용할 수 있는 경우 호흡기 초복합체를 분석하는 기술을 설명합니다.

Isolation of Mitochondria for Mitochondrial Supercomplex Analysis from Small Tissue and Cell Culture Samples(소조직 및 세포 배양 샘플에서 미토콘드리아 초복합체 분석을 위한 미토콘드리아 분리) 

Over the last decades, the evidence accumulated about the existence of respiratory supercomplexes (SCs) has changed our understanding of the mitochondrial ...

우리의 연구는 미토콘드리아 생물 발생, 특히 OXPHOS 시스템 조직 및 조절을 더 잘 이해하고 암에서 신경 퇴행성 질환에 이르는 질병에서 미토콘드리아가 수행하는 역할을 정의하는 데 중점을 두고 있습니다. 미토콘드리아는 세포에서 여러 가지 필수적인 역할을 수행하여 전체 신진대사와 생존을 조절합니다. 우리는 미토콘드리아의 복잡성과 건강 및 질병의 세포 적응 메커니즘에 대한 기여에 대한 지식을 천천히 늘리고 있습니다.우리는 OXPHOS 시스템을 위한 새로운 조직 모델, 즉 이전 제안을 통합하고 기능을 최적화하고 세포 적응을 허용하기 위해 서로 다른 비율로 슈퍼 복합체와 유리 복합체의 공존을 가정하는 가소성 모델을 확립하는 데 기여했습니다. 당사의 프로토콜은 작은 조직 또는 세포 배양 샘플에서 시작하여 청색 천연 전기영동 또는 기타 기법으로 슈퍼 복합체, 조립 및 상태 및 기능을 분석하기에 충분한 미토콘드리아 단백질 양을 얻을 수 있도록 합니다. 우리는 간단한 장비로 짧은 시간에 비교적 저렴한 비용으로 이를 재현 가능하게 수행할 수 있습니다.

isolation-mitochondria-for-mitochondrial-supercomplex-analysis-from

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

이 동영상은 밀도 구배 원심분리와 함께 차등 속도 원심분리를 사용하여 인간 난소암 조직에서 미토콘드리아를 분리하는 절차를 설명합니다. 분리된 미토콘드리아는 인간 난소암 미토콘드리아 단백질체의 단백질체 분석에 사용할 수 있습니다.

미토콘드리아 분리: 인간 난소암 조직 샘플에서 미토콘드리아를 분리하는 기술

포유 동물 조직 생검에서 미토콘드리아의 신속한 분리를위한 방법을 설명한다. 쥐 간 또는 골격근 제제 상용 조직 dissociator 균질화하고, 미토콘드리아는 나일론 메쉬 필터를 통한 여과에 의해 미분을 분리 하였다. 대안적인 방법을 사용하여 100 분간 - 미토콘드리아 분리 시간은 60 비교 &lt;30 분이다.

조직 해리 차동 여과 이식 미토콘드리아의 신속한 분리 및 정제

샘플 간의 미토콘드리아 막 전위를 비교하면 세포 상태에 대한 귀중한 정보를 얻을 수 있습니다. 형광을 사용하여 미토콘드리아를 분리하고 억제제 및 언커플러에 대한 반응을 평가하기 위한 자세한 단계가 설명되어 있습니다. 이 프로토콜의 방법과 유용성은 세포 배양 및 세포 스트레스의 동물 모델을 사용하여 설명됩니다.

분리 및 배양 세포 및 마우스 조직에서 미토콘드리아의 기능적 분석

여기에서는 소량의 마우스 골격근에서 고품질의 정제된 미토콘드리아를 분리할 수 있도록 이전에 보고된 방법의 변형을 제시합니다. 이 절차는 마이크로플레이트 기반 호흡기 분석 중에 높은 기능으로 호흡하는 고도로 결합된 미토콘드리아를 생성합니다.

높은 처리량 마이크로 호흡 측정을위한 마우스 골격근의 최소 수량에서 미토콘드리아의 분리

미토 콘 드리 아 식물 세포의 단지 작은 백분율은, 그들은 연구의 범위에 대 한 정화 될 필요가 있다. 미토 콘 드리 아 균질, 매우 순화 된 미토 콘 드리 아 분수를 차동 및 밀도 그라데이션 원심 분리 뒤 다양 한 식물 기관에서에서 격리할 수 있습니다.

절연 및 호흡 측정의 미토 콘 드리 아 애기 thaliana 에서

미토 콘 드리 아 리보솜 그들의 세균 및 세포질에서 갈라 전문 있다. 여기 우리가 어떻게 mitoribosomes HEK 세포에서 그들의 기본 구획에서 얻어질 수 있다 보여줍니다. 방법은 정지 세포에서 미토 콘 드리 아의 절연 및 mitoribosomes의 결과 정화를 포함 한다.

HEK 세포에서 Mitoribosome의 신속한 격리

여기에서는 마우스 골격근으로부터의 미토콘드리아를 분리하는 상세한 방법과 마이크로플레이트 기반 호흡 측정법을 사용하여 산소 소모율(OCR)에 의한 호흡의 후속 분석을 설명한다. 이 파이프 라인은 미토콘드리아 대사에 대한 여러 환경 또는 유전 적 개입의 효과를 연구하는 데 적용될 수 있습니다.

호흡 측정을 위한 마우스 골격근으로부터 미토콘드리아의 분리

여기에서 우리는 분자 산소를 소비하는 능력과 독립적으로 포유류 세포의 미토콘드리아 기능을 직접 측정하기 위한 분석 모음을 제시합니다.

포유류의 미토콘드리아 기능을 측정하기 위한 산소 비의존적 분석

우리는 프로테옴 규모에서 단백질 발견 및 정량화와 호환되는 고품질 미토콘드리아 분리를 위한 2단계 프로토콜을 제시합니다. 우리의 프로토콜은 유전 공학을 필요로하지 않으므로 모든 일차 세포와 조직에서 미토콘드리아를 연구하는 데 적합합니다.

단백질 발견 및 정량 분석을 개선하기 위한 미토콘드리아의 2단계 태그 없는 분리

미토콘드리아에 대한 생체 에너지 및 대사체 연구는 많은 질병에서 미토콘드리아의 다면적인 역할을 밝혀냈지만, 이러한 세포 소기관에 대한 분리 방법은 다양합니다. 여기에 자세히 설명된 방법은 여러 조직 소스에서 고품질 미토콘드리아를 정제할 수 있습니다. 품질은 호흡 조절 비율 및 고해상도 호흡 측정법으로 평가된 기타 지표에 의해 결정됩니다.

설치류 심장 조직으로부터 강력한 미토콘드리아 분리 

배우세요 소량 샘플에서 미토콘드리아 초복합체를 분석하는 방법을. 이 기술은 호흡 초복합체 조립과 기능을 연구하여 암 및 신경퇴행성 질환에서 미토콘드리아 역할을 이해하는 데 도움을 줍니다.

Isolation of Mitochondria for Mitochondrial Supercomplex Analysis from Small Tissue and Cell Culture Samples(소조직 및 세포 배양 샘플에서 미토콘드리아 초복합체 분석을 위한 미토콘드리아 분리) (동영상) | JoVE Journal

Isolation of Mitochondria for Mitochondrial Supercomplex Analysis from Small Tissue and Cell Culture Samples(소조직 및 세포 배양 샘플에서 미토콘드리아 초복합체 분석을 위한 미토콘드리아 분리)

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