Capacitive Biosensor를 사용한 Dynamic Multiparameter Platelet Function Assessment (동적 다중 파라미터 혈소판 기능 평가)

우리는 생리학적 환경에서 혈소판 기능을 평가하기 위한 분석을 설계하고 있으며, 멤브레인 용량 센서가 있는 반강성 미세환경에서 혈소판을 활성화하여 현재 분석의 한계를 해결하기 위해 노력하고 있습니다. 이 분석은 혈소판 수, 자극 강도 및 활성화 경로를 측정합니다. 이 도구는 지혈 중 혈소판 메커니즘을 연구하기 위한 포괄적인 접근 방식을 제공합니다.

당사의 프로토콜은 생리학적 조건에서 단일 분석으로 혈소판의 여러 매개변수를 평가할 수 있습니다. 우리는 이 프로토콜을 개선하고 다른 지혈 평가 센서를 개발하는 데 중점을 둘 것입니다. 먼저 표준 CAD 레이아웃 소프트웨어를 사용하여 원고에 설명된 대로 미세 가공 공정을 위한 4인치 실리콘 웨이퍼 기판에 대한 팀 멤브레인 커패시턴스 칩(MCC)의 레이아웃을 설계합니다.

생체 기능화를 위해 산소 플라즈마를 사용하여 TMCC의 감지 전극을 100와트에서 45초 동안 세척합니다. TMCC의 샘플 웰에 200 프루프 에탄올에 담긴 Do Decanal 용액 1개를 추가합니다.TMCC를 건조 질소로 채워진 용기에 넣습니다.

용기를 밀봉하고 파라 필름으로 24-48 시간 동안 포장합니다. 이틀 후 TMCC의 금 표면을 탈이온수와 200프루프 에탄올로 헹굽니다. TMCC를 실온에서 질소 가스로 건조시킵니다.

PBS의 인간 피브로넥틴 용액을 TMCC의 샘플 웰에 첨가하고 섭씨 37도에서 2-8시간 동안 배양합니다. 커패시턴스 센서 설정의 경우 마이크로 포지셔너 및 니들 프로브가 있는 LCR 미터를 사용하여 센서와의 전기 접촉을 설정합니다. 3D 프린팅 플라스틱 고정 장치를 사용하여 TMCC 및 BMCC를 안전하게 배치합니다.

TMCC를 BMCC 위에 정확하게 정렬하여 커패시터를 형성하기 위해 하단 고정 장치에 XY 축에 스토퍼가 장착되어 있는지 확인합니다. 8헤르츠 샘플링 속도로 100킬로헤르츠에서 0.5볼트의 정현파 신호를 적용합니다. 농축된 혈소판이 풍부한 혈장(CPRP)을 얻으려면 인간 혈액 샘플을 원심분리하십시오.

CPRP를 멸균 용기로 옮기고 혈소판 계수를 수행합니다. 억제제 연구의 경우, Tyrode의 완충액에 사전 정의된 농도의 아스피린을 주입하여 CPRP를 배양합니다. 혈소판 기능 분석을 위해 TMCC 및 BMCC를 3D 프린팅 설비에 조립합니다.

조립된 MCC의 기준선 커패시턴스를 5분 동안 측정한 다음 TMCC의 샘플 웰에 45마이크로리터의 CPRP를 추가하고 혈소판이 TMCC의 피브로넥틴 코팅 전극에 부착될 때까지 30분 동안 기다립니다. 다음으로, 부착된 혈소판을 방해하지 않고 샘플 웰에서 30마이크로리터의 CPRP를 제거하고 웰에 Tyrode의 완충액을 보충합니다. 마지막 세척 후 원하는 농도의 작용제 용액 10마이크로리터를 추가하고 샘플을 80분 동안 평형화합니다.

델타 C 접착력을 결정하기 위해 30분 접착 후 정전 용량의 최대 변화를 측정합니다. 활성화 단계의 경우 델타 C 활성화라고 하는 커패시턴스의 최대 변화를 측정합니다. 활성화 후 200초에서 300초 사이의 커패시턴스 곡선의 기울기를 계산하여 S 활성화를 결정합니다.

Tukey의 수술 후 테스트로 분산 분석을 사용하여 통계 분석을 수행하여 그룹 간 결과를 비교합니다. Shapiro-Wilk 적합도를 사용하여 정규 분포를 검정합니다. 미리 결정된 혈소판 수를 가진 CPRP 솔루션은 접착 중 정전 용량의 선형 감소를 보여주었습니다.

트롬빈 활성화 후 기하급수적인 정상 상태 감소가 관찰되었습니다. 델타 C 접착 값은 다양한 혈소판 수에서 혈소판 수와 강한 상관관계를 보였으며, 1.3밀리몰의 아스피린 농도에서 현저히 감소했습니다. 혈소판 자극에 따른 정전용량의 기하급수적인 감소율은 세포 농도에 따라 증가했습니다.

커패시턴스 손실의 크기도 농도가 높을수록 증가하여 델타 C 활성화에서 분명한 상승 추세를 보여주었습니다. S 활성화와 혈소판 수에 대해서도 유사한 경향이 관찰되었다. 아스피린 투여량이 증가함에 따라 커패시턴스, 델타 C 활성화 및 S 활성화가 감소하는 추세를 보였습니다.

고용량과 중용량에서 S 활성화의 통계적으로 유의미한 차이가 관찰된 반면, 델타 C 활성화에서는 유의한 차이가 발견되지 않았습니다. 트롬빈으로 활성화된 CPRP 샘플에 대한 커패시턴스 신호는 트롬빈 농도가 증가함에 따라 커패시턴스 감소가 더 두드러지는 것을 보여주었습니다. 델타 C 활성화와 S 활성화 모두 트롬빈 수치에서 통계적으로 유의미한 경향을 보였다.