Name: 비소세포폐암의 기형외형 이종이식 모델 구축: 질병 진행 모방 및 약물 활성성 예측 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-10T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 11 s
Description: 학습하세요 다세포 구형체를 이용한 비소세포폐암 기형외형 이종이식 모델 구축 방법을. 형광 A549-iRFP 세포와 폐내 접종으로 질병 진행을 모방하고 시스플라틴 반응을 동적 평가합니다.

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이 연구는 SAAG와 퍼시픽 대학교(University of the Pacific)의 SEED 장학금으로 지원되었습니다. Odyssey Infrared Imaging 205 시스템에 대한 액세스 권한을 부여해 주신 William Chan 박사와 SpectraMax iD3 플레이트 리더에 대한 액세스 권한을 부여해 주신 John Livesey 박사에게 감사드립니다. 동물 프로토콜에 대한 기술적 조언을 해주신 Melanie Felmlee 박사님께 감사드립니다.

동물 연구는 University of the Pacific의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받아 수행되었습니다(동물 프로토콜 19R10 및 22R10). 본 연구에는 체중 20-25g의 5-6주 된 8마리의 수컷 흉선성 누드 마우스가 참조된 설치류 식단으로 사육되고 병원체가 없는 (SPF) 조건에서 수용되었습니다. 케이지, 침구 및 식수는 고압 멸균되어 정기적으로 교체되었습니다. 마우스의 종양 접종 개략도는 그림 1에 나와 있습니다. 이 프로토콜에 사용된 모든 재료 및 기기와 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
1. A549-iRFP 세포의 3차원 MCS 확립
<ol><li>A549-iRFP 세포(인간 폐 선암)를 37°C에서 5%CO2 로 가습된 분위기에서 배양하고 10% 소 태아 혈청, 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 1μg/mL 퓨로마이신을 포함하는 완전 성장 배지 DMEM에서 성장시킵니다.</li>
	<li>0.3% 콜라겐이 보충된 100μL의 완전 성장 배지를 사용하여 4,000 cells/well의 파종 밀도로 A549-iRFP 세포를 96-well ultra-low attachment, round-bottom spheroid microplate에 파종합니다.</li>
	<li>MCS 형성을 용이하게 하기 위해 300× g 에서 4°C에서 7분 동안 마이크로플레이트를 원심분리합니다. 원심분리 후 세포 응집을 확인하기 위해 현미경으로 MCS 형태를 검사합니다.</li>
	<li>48시간 후 각 웰에 100μL의 완전 성장 배지를 추가하여 웰당 총 200μL의 성장 배지 부피를 얻습니다.</li>
	<li>각 웰에 있는 100μL의 성장 배지를 이틀에 한 번씩 새로운 완전 성장 배지로 교체합니다.</li>
</ol>2. A549-iRFP MCS의 특성 분석
<ol><li>현미경을 사용하여 MCS 형태를 관찰 및 이미지화하고, 위상차 현미경 이미지를 기반으로 MATLAB에서 참조된 소프트웨어로 시뮬레이션을 통해 MCS 부피를 추정할 수 있습니다.<ol><li>ImageJ 소프트웨어에서 하나의 MCS 이미지를 엽니다.</li>
		<li>자유형 선택을 사용하여 MCS의 가장자리를 선택하고 ROI Manager에 추가합니다.</li>
		<li>Edit(편집) | 선택 | 마스크 만들기를 클릭합니다.</li>
		<li>Edit(편집) | 반전.</li>
		<li>File(파일) | 다른 이름으로 저장 | 티파니.</li>
		<li>ReViSP 소프트웨어를 엽니다.</li>
		<li>찾아보기를 클릭하여 저장된 TIFF 이미지를 엽니다.</li>
		<li>시작을 클릭하여 MCS 시뮬레이션을 완료합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>700nm 채널에서 적외선 이미징 시스템을 사용하여 iRFP 형광 신호를 측정하고 소프트웨어(예: Image Studio)를 사용하여 형광 신호를 정량화합니다.<ol><li>Image Studio 소프트웨어를 엽니다.</li>
		<li>채널 탭에서 700 및 강도 = 5를 선택합니다.</li>
		<li>Scan Controls(스캔 컨트롤) 탭에서 84 μm, Medium(중간), 0.0 mm(0.0 mm) 및 Flip Image(이미지 대칭 이동)를 선택합니다. 다른 모든 항목을 기본값으로 유지합니다.</li>
		<li>딸깍 하는 소리 스타트 스캔을 시작합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>공급업체 프로토콜에 따라 3D cell viability assay를 사용하여 세포 생존율을 평가하고 정량화합니다.</li>
	<li>공급업체 프로토콜에 따라 BCA Assay를 사용하여 세포 단백질을 평가하고 정량화합니다.</li>
</ol>3. 종양 접종을 위한 MCS 선택
참고: MCS를 스페로이드 마이크로플레이트에 파종하고 정기적인 성장 배지 교환으로 2-3주 동안 성장시킨 후, 종양 접종에 적합한 특성을 가진 MCS를 선택하십시오.
<ol><li>현미경으로 MCS 형태를 관찰하고 전체적으로 가장자리가 매끄럽지만 5-10개의 거친 싹( 그림 2F의 화살표)과 직경이 700-800 μm 범위 내에 있는 둥근 모양의 MCS를 선택합니다.</li>
	<li>iRFP 형광을 측정하고(2.2단계 참조) 형광 신호가 평균의 1 표준 편차 내에 있는 MCS를 선택합니다.</li>
</ol>4. 폐내 MCS 접종
알림: 동물을 다루기 전에 70% 이소프로필 알코올 스프레이를 사용하여 수술 스테이션과 도구를 청소하십시오.
<ol><li>80mg/kg 케타민과 12mg/kg 자일라진의 IP 주사로 각 마우스를 마취합니다. 완전한 마취를 보장하기 위해 집게로 쥐 발을 집습니다.</li>
	<li>부프레노르핀 염산염(0.3mg/mL) 10μL를 피하로 주사하여 통증을 줄입니다.</li>
	<li>눈의 건조를 방지하기 위해 안과 연고를 바르십시오.</li>
	<li>마우스를 등쪽 자세로 놓고 테이프로 팔다리를 스트레칭 위치에 고정합니다.</li>
	<li>요오드와 알코올 면봉으로 뒷 피부를 살균합니다.</li>
	<li>왼쪽 뒷면을 수술용 가위로 사용하여 0.5-1cm 절개 부위를 자릅니다(그림 1B). 흉벽과 폐의 움직임이 보일 때까지 집게를 조심스럽게 사용하여 근육과 지방 조직을 분리합니다.</li>
	<li>피펫을 사용하여 마이크로플레이트에서 선택한 MCS 하나를 얼음처럼 차가운 PBS가 들어 있는 유리 페트리 접시에 옮깁니다.</li>
	<li>100μL 유리 주사기에 20G 바늘을 부착하고 얼음으로 예냉한 다음 PBS와 Matrigel의 사전 냉각된 혼합물 20μL(1:1v/v)를 그립니다.</li>
	<li>주사기를 사용하여 페트리 접시에서 최소한의 PBS-Matrigel 혼합물로 MCS 하나를 빠르게 흡입하여 MCS를 바늘의 금속 부분에 유지합니다. 알림: MCS가 바늘에서 미끄러지지 않도록 주사기와 플런저를 단단히 잡으십시오.</li>
	<li>두 갈비뼈 사이에 바늘을 ~3mm 깊이까지 수직으로 부드럽게 삽입하고 MCS가 포함된 20μL PBS와 Matrigel 혼합물을 모두 천천히 주입합니다. 알림: 폐, 혈관 조직 또는 심장의 손상을 방지하기 위해 삽입하는 동안 과도한 힘을 가하지 마십시오.</li>
	<li>바늘을 조심스럽게 제거하고 상처 부위에 삼중 항생제 연고를 바릅니다.</li>
	<li>절개 부위를 수술용 클립으로 봉합하고 2주 후에 제거합니다. 참고: 봉합사 라인이 형광 이미징을 방해할 수 있으므로 절개 부위를 봉합하지 마십시오. 벌거벗은 쥐는 수술 후 자연적으로 치유 할 수 있습니다.</li>
	<li>동물을 적외선 열 패드에 놓고 체온을 유지하기 위해 실험실 물티슈로 덮습니다. 동물이 깨어나 제대로 움직일 때까지 최소 30-60분 동안 동물을 모니터링하십시오.</li>
	<li>통증을 줄이기 위해 처음 48시간 동안 하루에 3번 부프레노르핀 염산염(0.3mg/mL) 10μL를 피하로 주사합니다.</li>
</ol>5. 수술 후 모니터링
<ol><li>3-4일마다 체중을 측정하십시오.</li>
	<li>700nm 채널의 소동물 이미징 시스템에서 3-4일마다 왼쪽, 오른쪽, 등쪽, 배쪽의 네 가지 자세로 종양 이종이식의 iRFP 형광 신호를 측정하고, 마우스는 2-3분에 걸쳐 이소플루란 흡입(유속: 1.5% 이소플루란을 함유한 1.5-2L/min 산소)으로 마취 상태를 유지합니다.</li>
	<li>소프트웨어(예: Image Studio)를 사용하여 생체 내 이종이식 암의 순 형광 강도를 정량화합니다.<ol><li>고정 사각형(A1, 200 x 125 픽셀)을 마우스의 가슴 영역에 대한 샘플링 창으로 사용합니다.</li>
		<li>free-hand 함수를 사용하여 사각형(A1) 내에서 마우스의 모양을 추적하고 영역 A1의 형광 강도(F1)를 측정합니다.</li>
		<li>다른 작은 사각형(A2, 25 x 40 픽셀)을 사용하여 허벅지 영역에 있는 마우스의 배경 형광(F2)을 측정합니다.</li>
		<li>방정식 (1)을 사용하여 각 마우스에서 이종이식 암의 순 형광 강도를 계산합니다. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66787/66787eq01.jpg" style="margin: auto;">(1)</li>
	</ol></li>
</ol>

Orthotopic NSCLC를 모델링하기 위한 다세포 스페로이드의 폐내 접종

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<li>Bray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+cancer+statistics+2018%3A+Globocan+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J+Clin%22%5BJournal%5D)">Global cancer statistics 2018: Globocan estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA Cancer J Clin. 68 (6), 394-424 (2018).</li>
<li>Travis, W. D., Brambilla, E., Riely, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+pathologic+classification+of+lung+cancer%3A+Relevance+for+clinical+practice+and+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">New pathologic classification of lung cancer: Relevance for clinical practice and clinical trials.</a> J Clin Oncol. 31 (8), 992-1001 (2013).</li>
<li>Ducote, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+artificial+intelligence+to+identify+tumor+microenvironment+heterogeneity+in+non-small+cell+lung+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Using artificial intelligence to identify tumor microenvironment heterogeneity in non-small cell lung cancers.</a> Lab Invest. 103 (8), 100176(2023).</li>
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</ol>

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

A549-iRFP MCS의 구축은 간단하고 재현성이 높은 실험실 절차이며 여러 세포주에 대한 MCS 형성으로 전환될 수 있습니다. 원심분리와 콜라겐의 도움으로 생성된 MCS는 3-4일 이내에 더 통합적이고 고형 종양과 같은 구조를 나타냅니다. 이 방법은 장기간, 일반적으로 2-3주 또는 작은 싹이 나오기 시작할 때까지 더 긴 기간 동안 일체형 구조를 유지하는 강력한 스페로이드의 형성을 보장합니다. 원심분리와 콜라겐을 사용함으로써 MCS의 형성을 표준화하여 실험 모델에서 MCS의 일관성과 신뢰성을 보장했습니다. 이 접근법은 결과의 재현성을 향상시키고 종양 성장 역학의 변동성을 최소화하여 종양 생물학 및 치료 개입을 연구하기 위한 보다 강력한 플랫폼을 제공합니다.
기존의 2D 단층 세포 배양과 달리 3D MCS는 이 연구에서 최소 6주라는 훨씬 더 긴 기간에 걸쳐 성장할 수 있습니다. 암의 성장과 진행을 모니터링하기 위해서는 동적이고 장기적인 정량 측정이 매우 유용합니다. 기존의 많은 3D MCS 분석법은 측정 중에 파괴적이어서 장기 평가에 대한 유용성이 제한됩니다. iRFP 형광 신호 측정의 비파괴 특성으로 인해 3D MCS에서 암세포 성장을 지속적이고 장기적으로 모니터링할 수 있습니다. 이 기능은 항암제에 대한 만성 노출의 영향을 평가하고 시간 경과에 따른 암세포의 역동적인 진화를 포착하는 데 특히 유용합니다. A549-iRFP 3D MCS에서 방출되는 iRFP 형광 신호는 스페로이드 부피, 세포 생존율 및 세포 단백질 수준을 포함한 스페로이드 성장에 대한 기존의 정량적 측정과 강한 상관관계를 나타냈습니다. 이는 MCS에서 암세포 성장을 평가하기 위한 대리물로서 형광 신호의 신뢰성을 강조합니다. iRFP 형광 신호의 긴 파장을 통해 작은 동물에서 암 성장 및 진행을 정량화할 수 있으며, 이는 항암제의 전임상 개발에 매우 중요합니다.
이 orthotopic NSCLC 모델의 일관성을 보장하기 위해 MCS는 폐 내 접종을 위해 신중하게 선택되어야 합니다. MCS의 유사한 크기와 형광 강도는 변동을 최소화하는 데 필요합니다. 더 큰 MCS를 접종하면 종양 진행에 더 큰 변동이 발생하는 경향이 있습니다. 또한 MCS 표면의 거칠기를 제어하는 것은 변동을 줄이는 데 중요한 역할을 합니다. 일부 MCS는 크기가 커짐에 따라 부드러운 가장자리를 유지했지만 다른 MCS는 성장함에 따라 가장자리가 더 거칠게 나타났습니다. 우리 손에서, 세포 배양에서 2-3주 동안 성장한 후 가장자리에 5-10개의 발아가 있는 완전한 고형 종양 유사 MCS는 마우스에서 더 균일한 종양 성장을 보인 반면, 가장자리가 거칠지 않거나 구조가 느슨하고 싹이 너무 많은 마우스는 접종 후 더 다양한 종양 성장 패턴을 보였습니다. 
MCS 이식 과정에서는 20G 바늘을 세심한 주의를 기울여 다루는 것이 필수적입니다. MCS는 잠재적인 손상을 제한하기 위해 베벨 또는 바늘의 금속 부분 내에 보관해야 합니다. 바늘 크기의 선택은 접종 중 MCS의 생존 가능성을 보장하는 것과 쥐 폐에 대한 잠재적 손상을 최소화하는 것 사이의 균형을 맞추기 위해 의도적으로 이루어졌습니다. 바늘 크기가 크면 마우스 조직이 손상될 수 있습니다. MCS가 바늘에 끼거나 접종 후 초기에 여러 개의 형광 점이 관찰되는 경우는 접종 한 MCS가 접종 중에 손상되었음을 나타낼 수 있습니다. 이러한 특성을 보이는 마우스는 추가 연구에서 제외되고 접종 실패로 분류되었습니다.
다세포 스페로이드(MCS)는 해부학적 고려 사항에 따라 오른쪽 폐가 아닌 왼쪽 폐에 접종되었습니다. 왼쪽 폐에는 두 개의 엽이 겹쳐져 있어 세 개의 엽이 나란히 위치한 오른쪽 폐에 비해 더 일관되고 접근하기 쉬운 목표 영역을 제공합니다. 따라서 좌측 폐는 특정 부위, 즉 좌측 상엽에 매우 신뢰할 수 있는 접종을 가능하게 하여 종양 발생 및 진행의 변동을 줄이는 데 도움이 됩니다. 
흉부 iRFP 형광 외에도 종양이 있는 마우스의 체중은 종양 부담의 중요한 확증 지표로 작용합니다. MCS 접종 후 이종이식 암이 진행됨에 따라, 마우스는 먼저 깨어 있을 때 먹고, 마시고, 활동하는 등 정상적인 행동을 보였으나, 약 40일째 되던 날에는 강한 흉부 iRFP 형광으로 나타난 무거운 종양 부담으로 인해 체중이 눈에 띄게 감소하고 정상적인 행동이 상실되었습니다. 인도적인 지침에 따라, 동물들은 체중이 15-20% 감소한 상태에서 안락사되었다. 체중 감량 시기는 배치에 따라 다르지만 정상적인 동물 행동의 손실과 일치하므로 동물 건강의 신뢰할 수 있는 지표로도 사용할 수 있습니다.
비소세포폐암(NSCLC)의 기형기성 모델에서의 암 진행은 주로 좌측 및 복측 형광 영상을 통해 모니터링되었으며, MCS 접종 후 일관되고 꾸준한 종양 성장을 보여주었습니다. 복부 쪽에서의 형광은 왼쪽보다 느린 증가를 보였는데, 이는 아마도 (1) 주입 깊이와 (2) 진행된 암 단계에서 기립성 종양과 피하 종양이 모두 존재하기 때문일 것입니다. 구체적으로, MCS는 갈비뼈를 통해 흉부로 접종되어 왼쪽 폐의 등쪽 표면에 침착되었기 때문에 MCS가 왼쪽 폐의 복부 표면까지 자라서 영상화하는 데 지연 시간이 필요했습니다. 종양이 자라면서 종양이 흉벽의 안쪽 표면까지 확장되는 경우가 있어 종양이 형광 스캐너에 더 가깝게 되어 좌측 이미징에 더 높은 신호를 제공합니다. 따라서 복부 쪽의 형광 영상은 폐의 종양을 더 정확하게 보여주었지만 일반적으로 종양을 감지하는 데 더 오랜 시간이 걸렸습니다. in vivo 형광 이미징이 끝날 무렵, 동물을 희생하여 개흉 절개 및 ex vivo imaging 을 실시했으며, 이를 통해 MCS 접종에서 기형외과 종양의 확립을 확인했을 뿐만 아니라 인간에서 NSCLC의 4가지 임상 단계를 요약하는 여러 해부학적 특징을 보여주었습니다. 
파일럿 효능 연구에서 폐의 체외 이미징과 종양이 있는 마우스의 생체 내 이미징 간의 강력한 상관관계는 동적 생체 내 형광 이미징 방법론의 신뢰성을 확증합니다. 비소세포폐암(NSCLC)의 기형외피모형(orthotopic model)은 종양 성장이 느린 것이 치료 효과의 핵심 지표이고, 체중 감소가 약물 독성의 주요 지표로서 항암 치료에 신뢰성 있게 반응하는 것으로 나타났다. 이러한 반응은 이 모델이 항암제 후보의 전임상 평가 및 개발을 위한 유용한 도구임을 보여주었습니다. 폐암의 특징인 전이(metastasis)는 모델에서 충실하게 재현되었으며, 더 중요한 것은 항암제인 시스플라틴(cisplatin)에 의해 확실하게 억제되었습니다. 이 파일럿 연구에서 시스플라틴을 단 두 번만 주사했을 때 종양 성장이 느려지는 것이 관찰되었는데, 이는 시스플라틴의 더 유의미한 항암 효과가 임상적으로 더 관련성이 높은 4주 투여 요법에서 비롯될 것임을 시사합니다. 
이 보고서의 비소세포폐암(NSCLC)의 orthotopic 모델은 폐암의 여러 일반 동물 모델에 비해 몇 가지 중요한 이점을 가지고 있습니다. 폐암의 피하 이종이식 모델과 비교할 때 이 모델은 종양 주변에 더 관련성이 높은 조직 미세환경을 제공합니다. 유전자 조작 마우스 모델과 비교했을 때, 이 모델은 실험 절차가 더 편리하고 종양 진행 및 동물의 생존율이 더 높습니다. 이 모델과 다른 폐암 모델 간의 포괄적인 비교는 이전 간행물18에서 확인할 수 있습니다. 다른 이종이식 동물 모델과 마찬가지로 이 모델의 한 가지 한계는 인간 암의 중요한 구성 요소인 완전한 면역 체계가 없다는 것입니다. 또한, 이 모델에서 접종된 MCS는 때때로 흉벽의 내부 표면에 원발성 이종이식 종양을 발생시킵니다. 따라서 이러한 발달을 쉽게 감지하고 최소화하기 위한 실험 절차는 이 모델을 개선하기 위한 향후 연구에 포함되어야 합니다. 또한, 비소세포폐암(NSCLC)의 종양 생물학 및 치료 반응에 대한 보다 포괄적인 이해를 달성하기 위해 남녀 모두를 대상으로 한 연구가 수행될 것입니다. 결론적으로, 이 보고서의 쥐 기형외과 폐암 이종이식 모델은 폐암 진행을 요약하고 항암 치료를 평가하기 위한 선구적이고 강력한 도구입니다. 이 모델은 비소세포폐암(NSCLC) 병리학에 대한 이해를 증진하고 해당 치료적 개입을 개발할 수 있는 엄청난 잠재력을 가지고 있습니다.

모든 종양학적 질환 중에서 폐암은 가장 많은 생명을 앗아갈 뿐만 아니라 미국에서 매년 두 번째로 많은 신규 환자를 청구합니다1. 이 파괴적인 악성 종양은 현대 의료의 주요 장애물로 작용하고 있으며, 이 질환의 복잡한 생물학에 대한 더 깊은 이해와 보다 효과적인 치료 방식을 요구하고 있다2. 비소세포폐암(NSCLC)은 폐암의 85%를 차지하며 고형암으로 발전하는 경향이 있다3. 폐암에서 가장 중요한 과제 중 하나는 암의 진행과 치료적 개입에 대한 반응에 지대한 영향을 미치는 역동적이고 이질적인 종양 미세환경입니다 4,5,6. 비소세포폐암(NSCLC)의 여러 단계에서 암세포와 암세포의 미세환경 사이의 상호작용에 대한 심층적인 이해를 위해서는 비소세포폐암(NSCLC) 진행의 조직학적 특징을 요약하는 정교한 병리학적 모델이 필요합니다.
이와 관련하여, orthotopic 동물 모델은 NSCLC 연구를 위한 유망한 방법으로 부상하고 있습니다. 일반적으로 사용되는 피하 이종이식 모델7과 달리, 정형외형 모델은 기원 기관에 직접 접종되는 암세포를 특징으로 한다. 폐암의 경우, 이는 암세포를 폐 조직에 직접 이식하는 것을 의미한다 8,9. 결과적으로, 폐암의 orthotopic 모델은 인접 조직, 혈관 및 면역 구성 요소를 포함한 자연 종양 미세 환경을 더 잘 모방하여 생리학적 및 임상적 관련성을 향상시킵니다.
3차원 다세포 스페로이드(MCS)는 종양 환경의 특징을 재현하는 또 다른 유망한 접근법입니다. 대부분의 암은 다양한 세포-세포 상호 작용, 세포외 기질, 산소 및 영양소의 구배를 포함한 복잡한 종양 미세환경으로 특징지어진다10,11. 기존의 2D 세포 배양은 이러한 종양 특이적 특징을 재현할 수 있는 공간적, 구조적 복잡성이 부족합니다12. 이에 반해, 적절한 크기의 MCS는 저산소성 및 괴사성 코어를 가진 이질적인 구조를 특징으로 하며, 이는 종양 내 미세환경뿐만 아니라 항암 치료에서 약물 내성의 주요 기전인 약물 침투에 대한 생리적 장벽을 재현합니다 13,14,15.
양능성 동물 모델과 MCS 배양 기법을 모두 활용하여 면역력이 저하된 마우스에 MCS를 접종하여 유방암 및 전립선암의 정형외과 모델을 성공적으로 구축했습니다16,17. 여기에서는 폐암의 쥐 기형외생식물 이종이식 모델을 구축하고 특성화하기 위한 상세한 방법론을 보고한다. 이 방법은 형광 인간 폐암 세포(A549-iRFP)18에서 유래한 3D MCS의 폐내 접종을 사용합니다. 이 모델은 비소세포폐암(NSCLC)의 4가지 임상 단계와 밀접하게 평행한 단계를 통해 폐암의 생체 내 진행을 관찰할 수 있는 탁월한 기회를 제공합니다. 또한, 이 모델의 이종이식 암은 임상적으로 확립된 항폐암 약물인 시스플라틴(cisplatin)에 반응했습니다.

<table><tbody><tr><td>100 &마이크로; L 유리 주사기</td><td>해밀턴</td><td>Part/REF #80601</td><td></td></tr><tr><td>20 g바늘</td><td>thermo fisher scientific Inc.</td><td>14 826D</td><td></td></tr><tr><td>96-웰 초저 부착 스페로이드 마이크로플레이트&nbsp;</td><td>Corning</td><td>15-100-173</td><td></td></tr><tr><td>A549-iRFP</td><td>Imanis 생명 과학&nbsp;</td><td>CL082-STAN</td><td></td></tr><tr><td>AIN-93M 성숙한 설치류 다이어트&nbsp;</td><td>리서치 다이어트, Inc.</td><td></td><td></td>D10012M</tr><tr><td>Athymic 누드 마우스</td><td>Charles River Laboratories, Inc.</td><td>변형 코드: 490; 동형접합</td><td></td></tr><tr><td>BCA</td><td>피어스</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>부프레노르핀 하이드로클로라이드</td><td>패터슨 수의학</td><td>NDC 번호: 42023-179-05</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo 3D 세포 생존력 분석</td><td>Promega</td><td>G9683</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐</td><td>Gibco</td><td>A1064401&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>MT10013CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Cytiva HyClone</td><td>SH3039603</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>오픈 소스 도구 (https://imagej.net/ij/)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Image Studio&nbsp;</td><td>LI-COR</td><td>버전 5.2</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Patterson 수의학</td><td>NDC 번호: 17033-0091-25</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Ketamine Patterson 수의학</td><td>NDC 번호: 50989-0161-06</td><td></td></tr><tr><td>현미경&nbsp;</td><td>Keyence</td><td>모델 번호: BZ-X710</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>CB-40234</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Infrared Imaging 205 System&nbsp;</td><td>LI-COR</td><td>모델 번호: 9140</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>MT21040CV</td><td></td></tr><tr><td>Pearl Trilogy 소형 동물 이미징 시스템&nbsp;</td><td>LI-COR</td><td>모델 번호: 9430</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신&nbsp;</td><td>코닝</td><td>MT30002CI</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AAJ67236XF MATLAB의 ReViSP 소프트웨어&nbsp;</td><td>Sourceforge (https://sourceforge.net/projects/revisp/)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>수술 클립의 오픈 소스 도구--AutoClip 시스템</td><td>Fine Science Tools</td><td>12020-00</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Patterson 수의학</td><td>NDC 번호: 61133-6017-01</td><td></td></tr></tbody></table>

비소세포폐암의 기형외형 이종이식 모델 구축: 질병 진행 모방 및 약물 활성성 예측

Construction of An Orthotopic Xenograft Model of Non-Small Cell Lung Cancer Mimicking Disease Progression and Predicting Drug Activities

비소세포폐암(NSCLC)은 복잡하고 이질적인 종양 미세환경을 가진 매우 치명적인 질병입니다. 현재 암세포 현탁액의 피하 접종에 기초한 일반적인 동물 모델은 NSCLC에서 종양 미세환경을 재현하지 못합니다. 여기에서는 3차원 다세포 스페로이드(MCS)의 폐 내 접종을 사용하는 쥐 기형외과 폐암 이종이식 모델을 설명합니다. 구체적으로, 형광 인간 비소세포폐암(A549-iRFP)을 콜라겐이 함유된 저부착 96웰 마이크로플레이트에서 3주 동안 배양하여 MCS를 형성한 후, 흉선성 누드 마우스의 왼쪽 폐에 늑간으로 접종하여 기공성 폐암 모델을 확립했습니다.
원래의 A549 세포주와 비교했을 때, A549-iRFP 세포주의 MCS는 항암제에 유사하게 반응하였다. A549-iRFP 세포의 장파장 형광 신호는 스페로이드 부피, 세포 생존율 및 세포 단백질 수준을 포함한 암세포 성장의 일반적인 마커와 강한 상관관계가 있어 형광 이미징을 통해 생체 내에서 암 성장을 동적으로 모니터링할 수 있습니다. 마우스에 접종한 후 A549-iRFP MCS 이종이식은 원발성 종양의 확장, 인접 이차성 종양의 출현, 암세포의 반대쪽 우측 폐 및 원격 장기로의 전이를 포함하여 비소세포폐암의 임상 단계와 매우 유사한 단계를 안정적으로 진행했습니다. 또한, 이 모델은 벤치마크 항폐암 약물인 시스플라틴(cisplatin)에 대해 예상되는 독성과 더 느린 암 진행으로 반응했습니다. 따라서 비소세포폐암(NSCLC)의 이 쥐 기형외생식물(murine orthotopic xenograft) 모델은 질병의 진행을 요약하고 잠재적인 항암제의 개발을 촉진하는 플랫폼 역할을 할 것입니다.

A549-iRFP MCS의 특성 분석 A549-iRFP MCS는 콜라겐 및 원심분리의 도움으로 스페로이드 마이크로플레이트에서 성공적으로 배양되었습니다. MCS가 1주일 후 직경이 약 500μm에 도달했을 때, A549 및 A549-iRFP MCS는 모두 다양한 항암제 및 제형에 3일 동안 노출된 후 약물이 없는 성장 배지에서 추가로 4일 동안 유지되었습니다. A549-iRFP MCS는 모세포인 A549 세포의 반응 패턴과 매우 흡사한 반응 패턴을 보였다. A549 및 A549-iRFP MCS는 폐암에 대한 1차 항암제 중 하나인 시스플라틴과 유사한 용량-반응 곡선 및 IC50 값을 보였다(그림 2A). A549 및 A549-iRFP MCS의 생존력은 다른 항암제 또는 제형에 의해 유사한 정도로 억제되었다(그림 2B).
A549-iRFP MCS는 iRFP 형광, 세포 생존율 및 세포 단백질 수치에 따라 최대 6주 동안 모니터링되었습니다. MCS의 부피는 위상차 현미경 이미지를 기반으로 한 소프트웨어 시뮬레이션으로 추정되었으며, 시뮬레이션된 형태는 현미경 및 형광 신호로 이미지화한 것과 유사한 모양을 나타냈습니다(그림 2C). A549-iRFP MCS의 세포 생존율은 3D 세포 생존도 분석으로 정량화되었으며, 직경 350에서 950μm까지 다양한 크기의 MCS로 분석을 검증했습니다. MCS를 함유한 성장 배지와 분석 시약 간의 다양한 부피 비율과 5분과 10분의 서로 다른 진탕 시간 간에 유의한 차이는 관찰되지 않았습니다. (보충 그림 S1). 4개의 바이오마커 모두 시간이 지남에 따라 증가했으며 이후 시점에서 더 큰 변동이 있었습니다(그림 2D). iRFP 형광은 MCS의 다른 세 가지 전통적인 정량 측정치인 부피(Pearson r = 0.9307, p &lt; 0.0001), 세포 생존율(Pearson r = 0.7666, p &lt; 0.0001) 및 세포 단백질(Pearson r = 0.7317, p &lt; 0.0001)과 강한 상관관계를 보였습니다(그림 2E).
생쥐의 종양 진행 2-3주 동안 성장한 후, 형태, MCS 직경, 적절하게 거친 가장자리 및 형광 신호(자세한 매개변수는 프로토콜 섹션 3 참조)를 포함한 적절한 특성을 가진 A549-iRFP MCS를 종양 접종을 위해 선택했습니다. 종양 접종 수술 후, 종양이 있는 마우스의 체중을 3일마다 측정하여 수술 직전 Day 0의 체중과 비교한 변화 비율로 표시하였다. 수술 후 쥐의 체중이 약간 감소하고 1주일 이내에 빠르게 회복되었습니다. 치료하지 않으면 체중은 ~40일까지 점진적으로 증가했지만 다음 주에 급격히 감소(~15%)하여 IACUC 지침에 따라 마우스의 안락사(3배 마취 과량: IP 주사를 통한 80mg/kg 케타민 및 12mg/kg 자일라진)로 이어졌습니다(그림 3A). 종양이 있는 마우스는 왼쪽, 등쪽, 오른쪽 및 배쪽의 네 가지 자세로 3일마다 이미지를 촬영했습니다. 이 중 좌측(종양이 접종되는 곳)과 복부(폐의 양쪽을 관찰할 수 있는 곳)는 식 (1)에 따라 순 형광 강도를 정량화하기 위한 주요 자세로 선택되었습니다(그림 3B, C). 두 자세의 순 형광 강도는 유사한 종양 진행 경향을 보였으며 복부 쪽의 형광이 왼쪽보다 약간 느리게 성장했습니다.
이 기형외피 모델에서 MCS 이종이식은 비소세포폐암(NSCLC)의 4가지 임상 단계를 반영하는 뚜렷한 단계를 거쳤습니다(그림 3D)18,19,20. 다종 화학 물질 민감증 접종 후 8일째 경에 좌측 폐에서 집중 형광이 나타났으며, 이는 임상 환경에서 1기 비소세포폐암(NSCLC)에 따른 국소 종양이 형성되었음을 의미합니다. 대략 11일째가 되자 형광이 눈에 띄게 강화되거나 왼쪽 폐의 여러 부위에 분산되어 2기 비소세포폐암(NSCLC)과 유사한 종양이 있음을 나타냅니다. 그 후, 대략 18일째에 복부 쪽에서 증가된 형광 신호가 관찰되었으며, 이는 이종이식의 3기와 같은 진행을 암시합니다. 또한, 해부학적 검사와 체외 영상 촬영을 통해 심장 표면에서 종양이 자라는 것이 확인되었는데, 이는 비소세포폐암 3기의 중요한 특징입니다. MCS 접종 후 대략 27일째 되는 날, 폐 양쪽에 관류 형광이 나타났고, 열린 흉부 해부학적 검사에서 심장, 기관 및 주요 혈관에서 관류 종양이 자라는 것이 확인되었으며, 이는 4기 비소세포폐암과 유사한 암 전이를 나타냅니다.
시스플라틴에 대한 종양 보유 마우스의 반응 이 orthotopic 폐암 쥐 모델에 대해 파일럿 효능 연구가 수행되었습니다. 종양 접종 10일 후, 종양이 있는 마우스의 꼬리 정맥을 통해 5mg/kg 시스플라틴 또는 생리식염수를 주사했으며, 일주일에 한 번 주사하여 총 두 번 주사했습니다. 종양이 있는 마우스의 복부 쪽 이미지는 그림 4A에 제시되어 있습니다. 체중과 종양 형광은 3-4일마다 모니터링했습니다. 생리식염수 투여군과 비교했을 때, 시스플라틴 투여군의 마우스는 시스플라틴 주사 후 체중이 유의하게 감소하였으나 시스플라틴 투여 후 몇 주 후에 회복하였다(그림 4B). 시스플라틴(cisplatin) 그룹의 순 형광 강도는 식염수 그룹보다 느린 증가 추세를 보였습니다(그림 4C). 생체 내 형광 모니터링이 끝나면 동물을 희생시키고 폐를 절개하고 형광으로 이미지를 촬영했습니다. 총 조직 단백질에 의한 정규화 후, 시스플라틴군의 마우스에서 절개한 폐의 형광 강도가 생리식염수 그룹보다 낮은 것으로 확인되었다. (그림 4E). 복부 형광 영상(그림 4A)에서 빨간색 사각형의 이미지는 좌측 폐와 우측 폐 모두에서 종양 형광이 처음으로 시각화된 시점을 나타내며, 이는 IV기 비소세포폐암에서 종양 전이의 핵심 지표입니다. 폐암 1차 치료제 중 하나인 시스플라틴(Cisplatin)은 좌측 폐에서 우측 폐로의 종양 전이를 늦췄습니다(그림 4D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66787/66787fig01.jpg"> 그림 1: 연구의 순서도. (A) 콜라겐 및 원심분리를 통해 A549-iRFP 세포를 스페로이드 마이크로플레이트에 파종하여 MCS를 형성합니다. (B) 임상 환경에서 폐암의 4기를 모방한 기형외과 폐암 이종이식 모델을 구축하기 위해 적절한 특성을 가진 A549-iRFP MCS를 마우스의 왼쪽 폐에 투여합니다. 다종 화학 물질 민감증 1개가 들어 있는 흰색 주사기는 종양 접종을 나타내고, 두 개의 빨간색 주사기는 꼬리 정맥을 통해 투여되는 약물 치료를 나타냅니다. 약어: MCS = 다세포 스페로이드. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66787/66787fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66787/66787fig02.jpg"> 그림 2: A549-iRFP MCS의 특성화. (A) 3일 노출 및 4일 약물 없는 성장 후 시스플라틴에 대한 A549-iRPF MCS 및 A549 MCS의 용량-반응 곡선(평균 ± SD, N = 3-4). (B) 항암 치료제(시스플라틴, 파클리탁셀 또는 자체 개발한 두 가지 약물 제형) 및 4일 약물 없는 성장(평균 ± SD, N = 3-4)에 3일 노출 후 A549-iRFP MCS의 세포 생존율. (C) 조영제 위상 현미경(C1, 스케일 바 = 500μm), 형광 공초점 현미경(C2) 및 소프트웨어 시뮬레이션(C3)에 의한 1-6주 배양 후 대표적인 A549-iRFP MCS의 형태학적 연구. (D) 1-6주 동안 A549-iRFP MCS의 iRFP 형광, 부피, 세포 생존도 및 세포 단백질의 동적 변화(iRFP 형광 및 부피의 경우 N = 10; 세포 생존력 및 세포 단백질의 경우 N = 5). (E) 1-6주 동안(N = 60) A549-iRFP MCS의 iRFP 형광과 다른 세 가지 전통적인 성장 측정(부피, 세포 생존도 및 세포 단백질)의 상관관계. (F) 종양 접종에 적합한 특성의 A549-iRFP MCS의 예(스케일 바 = 500μm). 약어: MCS = 다세포 스페로이드. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66787/66787fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66787/66787fig03.jpg"> 그림 3: 비소세포폐암(NSCLC)의 orthotopic murine 모델에서의 종양 진행. (A) 종양 접종 후 마우스의 체중 변화(평균 ± SEM, N = 5). (B) 좌측 이미징을 기반으로 한 종양 보유 마우스의 순 형광 강도의 동적 변화(N = 5). (C) 복부 측 이미징을 기반으로 한 종양 보유 마우스의 순 형광 강도의 동적 변화(N = 5). (D) 비소세포폐암(NSCLC)의 4가지 임상 단계를 모방한 암 진행. 좌측 영상, 복측 영상, 해부학적 관찰(노란색 화살표는 폐 및 심장 표면의 종양을 나타냄) 및 4단계에서 대표적인 종양 보유 마우스의 생체 외 영상. 이 그림은 Huang et al.18에서 발췌한 것입니다. 약어: NSCLC = 비소세포폐암. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66787/66787fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66787/66787fig04.jpg"> 그림 4: 시스플라틴에 대한 종양 보유 마우스의 반응. (A) 식염수 또는 시스플라틴으로 처리한 후 종양이 있는 마우스의 복부 쪽 이미징(빨간색 사각형으로 표시된 이미지는 왼쪽 및 오른쪽 폐 모두에서 종양 형광을 처음 시각화할 수 있는 시점을 나타냄). (B) 식염수 또는 시스플라틴 처리 후 종양이 있는 마우스의 체중 변화(평균 ± SEM, N = 3-4). (C) 복부 측 이미징을 기반으로 한 식염수 또는 시스플라틴 처리 후 종양 보유 마우스에서 순 형광 강도의 동적 변화(평균 ± SEM, N = 3-4). (D) 왼쪽 폐와 오른쪽 폐 모두에서 종양 형광을 보이는 마우스의 비율. (E) 생체 내 형광 이미징 종료 시 희생된 마우스에서 절개된 폐의 정규화된 형광 강도(평균 ± SEM, N = 3-4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66787/66787fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 S1: 다양한 직경의 A549-iRFP MCS에 대한 3D 세포 생존도 분석. (A) ~350 μm; (비) ~550 마이크로미터; (C) ~ 750 μm; (D) ~950 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66787/66787_Supplementary%20Figure%20S1.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 연구는 형광 A549-iRFP 세포의 다세포 스페로이드의 폐 내 접종에 기반한 비소세포폐암(NSCLC) 모델을 제시합니다. 이 모델은 임상 비소세포폐암(NSCLC) 단계를 요약하고 시스플라틴(cisplatin)에 반응하며, 이는 장파장 형광의 동적 생체 내 모니터링에 따른 것입니다.

Non-small cell lung cancer (NSCLC) is a highly lethal disease with a complex and heterogeneous tumor microenvironment. Currently, common animal models ...

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피하 전임상 모델에서 환자 유래 종양을 활용하여 새로운 치료법, 예측 바이오 마커의 발견 및 약제 내성 경로의 효능을 연구 할 수있는 좋은 방법입니다. 이 모델은 신약 개발 과정에서 임상 시험에 앞서 많은 신규 항암 요법의 운명을 결정하는데 중요하다.

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상해 항공을 미리 조절 하 여 murine 폐에 폐 암 세포의 orthotopic engraftment를 크게 향상 하는 방법을 설명 합니다. 이 방법은 또한 폐 microenvironment, 전이성 보급, 폐 암 공동 morbidities stromal 상호 작용 연구에 적용 될 수 있습니다 그리고 파생 xenografts 환자를 보다 효율적으로 생성 하.

Orthotopic 폐 암 세포 Engraftment의 효율성 증가 사전 조건 Bleomycin와 쥐의 기도

여기, 우리는 암에 대 한 신뢰할 수 있는 전 임상 모델을 만드는 생물학 관련 사이트에서 초음파 유도 신경 (NB) 및 Ewing의 육 (ES) 세포의 주입을 활용 (설립 세포 및 종양 환자에서 파생 된 셀) 프로토콜 제시 연구입니다.

초음파의 이용 가이드 생물학 관련 전이성 종양 Xenografts의 설립을 위한 세포 이식 조직 감독

여기 우리는 비 작은 세포 폐 암 공부 시간 및 비용 절감 모델 마우스 폐 선 암 세포의 침 습 syngeneic orthotopic 이식 모델을 설명 합니다.

Orthotopic PD L1 식 공부 Syngeneic 폐 선 암 세포의 이식

이 프로토콜은 환자 유래 정형외 이종이식 모델의 생성을 중급 요뇨세포 암종 세포 또는 직장 내 대장암 세포를 비만 당뇨병/중증 복합으로 주입하여 생성하는 것을 설명합니다. 면역 결핍 (NOD /SCID) 림프절 기질 세포의 영향하에 1 차적인 종양 성장 및 자발적인 전이를 위한 마우스, 이는 인간 전이성 질병의 진행을 모방합니다.

인간 비뇨기과 세포 암 및 대장암 종양 성장 및 자발적 전이를 위한 환자 유래 직교 이종이식 모델

PDX 모델이 중개 종양학 분야에서 빠르게 표준이 되고 있기 때문에 현재 프로토콜은 역형성 갑상선 암종(ATC) 및 두경부 편평 세포 암종(HNSCC)의 환자 유래 이종이식(PDX) 모델을 설정하고 특성화합니다.

역형성 갑상선 암종 및 두경부 편평 세포 암종의 환자 유래 이종 이식 모델의 확립 및 특성화

정형소 소아 뇌종양 모델의 개발에는 암세포를 정밀하게 이식하기 위해 입체 장치를 사용하는 세심한 정밀도가 필요합니다. 여기에 제시된 방법론은 뇌종양 세포를 준비하고, 두개내 주사를 수행하고, 뇌종양 생착을 평가하기 위한 수술 후 모니터링 시스템을 구현하는 것과 관련된 단계를 간략하게 설명합니다.

Stereotaxic Device를 이용한 뇌종양에 대한 Orthotopic Patient-derived Xenograft Models 구축

폐암에 대한 새로운 치료법 개발의 주요 과제에는 국소 질환이 전이성 질환으로 진행됨에 따라 종양 미세 환경을 모델링하는 것이 포함됩니다. 여기에서는 시간이 지남에 따라 질병의 생체 내 추적을 가능하게 하는 폐암의 동소 동계 모델을 확립하는 간단한 방법을 설명합니다.

폐암의 동계 동소 마우스 모델을 생성하기 위한 최소 침습적 방법

학습하세요 다세포 구형체를 이용한 비소세포폐암 기형외형 이종이식 모델 구축 방법을. 형광 A549-iRFP 세포와 폐내 접종으로 질병 진행을 모방하고 시스플라틴 반응을 동적 평가합니다.

비소세포폐암의 기형외형 이종이식 모델 구축: 질병 진행 모방 및 약물 활성성 예측

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