Name: 3차원 피브린 하이드로겔에서 인간 흉선 오가노이드의 형성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T13:20:00.000+00:00
Duration: 3 min 31 s
Description: 학습하세요 3D 피브린 하이드로겔에서 인간 흉선 오가노이드 형성 방법을. 이 기술은 흉선 상피세포 성숙과 체포이식을 지원하여 자가면역 질환 연구와 세포 치료에 활용됩니다.

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<meta charset="utf8"></head><body>iPSC 유래 오가노이드를 이용한 흉선 미세환경 재현

<ol><li>Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+and+negative+selection+of+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Positive and negative selection of T cells.</a> Annu Rev Immunol. 21, 139-176 (2003).</li>
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<li>Cumano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+molecular+insights+into+immune+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">New molecular insights into immune cell development.</a> Annu Rev Immunol. 37, 497-519 (2019).</li>
<li>Bautista, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptional+profiling+of+human+thymic+stroma+uncovers+novel+cellular+heterogeneity+in+the+thymic+medulla%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptional profiling of human thymic stroma uncovers novel cellular heterogeneity in the thymic medulla.</a> Nat Commun. 12 (1), 1096(2021).</li>
<li>Kadouri, N., Nevo, S., Goldfarb, Y., Abramson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymic+epithelial+cell+heterogeneity%3A+TEC+by+TEC%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymic epithelial cell heterogeneity: TEC by TEC.</a> Nat Rev Immunol. 20 (4), 239-253 (2020).</li>
<li>Alves, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+progression+of+cortical+and+medullary+thymic+epithelial+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Serial progression of cortical and medullary thymic epithelial microenvironments.</a> Eur J Immunol. 44 (1), 16-22 (2014).</li>
<li>Baik, S., Jenkinson, E. J., Lane, P. J. L., Anderson, G., Jenkinson, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+both+cortical+and+Aire%2B+medullary+thymic+epithelial+compartments+from+CD205%2B+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Generation of both cortical and Aire+ medullary thymic epithelial compartments from CD205+ progenitors.</a> Eur J Immunol. 43 (3), 589-594 (2013).</li>
<li>Tavian, M., Peault, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+development+of+the+human+hematopoietic+system%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryonic development of the human hematopoietic system.</a> Int J Dev Biol. 49 (2-3), 243-250 (2005).</li>
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<li>Anderson, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projection+of+an+immunological+self+shadow+within+the+thymus+by+the+aire+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein.</a> Science. 298 (5597), 1395-1401 (2002).</li>
<li>Sharma, H., Moroni, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advancements+in+regenerative+approaches+for+thymus+rejuvenation%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Sci%22%5BJournal%5D)">Recent advancements in regenerative approaches for thymus rejuvenation.</a> Adv Sci. 8 (14), 2100543(2021).</li>
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<li>Pinto, S., Schmidt, K., Egle, S., Stark, H. -J., Boukamp, P., Kyewski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+organotypic+coculture+model+supporting+proliferation+and+differentiation+of+medullary+thymic+epithelial+cells+and+promiscuous+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">An organotypic coculture model supporting proliferation and differentiation of medullary thymic epithelial cells and promiscuous gene expression.</a> J Immunol. 190 (3), 1085-1093 (2013).</li>
<li>Hun, M., Barsanti, M., Wong, K., Ramshaw, J., Werkmeister, J., Chidgey, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+thymic+extracellular+matrix+improves+in+vivo+thymic+organoid+T+cell+output%2C+and+drives+in+vitro+thymic+epithelial+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Native thymic extracellular matrix improves in vivo thymic organoid T cell output, and drives in vitro thymic epithelial cell differentiation.</a> Biomaterials. 118, 1-15 (2017).</li>
<li>Asnaghi, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymus+extracellular+matrix-derived+scaffolds+support+graft-resident+thymopoiesis+and+long-term+in+vitro+culture+of+adult+thymic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Funct+Mater%22%5BJournal%5D)">Thymus extracellular matrix-derived scaffolds support graft-resident thymopoiesis and long-term in vitro culture of adult thymic epithelial cells.</a> Adv Funct Mater. 31 (20), 2010747(2021).</li>
<li>Villegas, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultured+human+thymic-derived+cells+display+medullary+thymic+epithelial+cell+phenotype+and+functionality%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cultured human thymic-derived cells display medullary thymic epithelial cell phenotype and functionality.</a> Front Immunol. 9, 1663(2018).</li>
<li>Hauri-Hohl, M., Zuklys, S., Holländer, G. A., Ziegler, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+regulatory+role+for+TGF-%CE%B2+signaling+in+the+establishment+and+function+of+the+thymic+medulla%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">A regulatory role for TGF-β signaling in the establishment and function of the thymic medulla.</a> Nat Immunol. 15 (6), 554-561 (2014).</li>
<li>Campinoti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+a+functional+human+thymus+by+postnatal+stromal+progenitor+cells+and+natural+whole-organ+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of a functional human thymus by postnatal stromal progenitor cells and natural whole-organ scaffolds.</a> Nat Commun. 11 (1), 6372(2020).</li>
<li>Ramos, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+thymic+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Generation of functional thymic organoids from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 18 (4), 829-840 (2023).</li>
<li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineering+thymus+organoids+to+restore+thymic+function+and+induce+donor-specific+immune+tolerance+to+allografts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Bioengineering thymus organoids to restore thymic function and induce donor-specific immune tolerance to allografts.</a> Mol Ther. 23 (7), 1262-1277 (2015).</li>
<li>Provin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatory+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+generates+thymic+epithelium+that+supports+thymic+crosstalk+and+directs+dendritic-+and+CD4%2FCD8+T-cell+full+development%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Combinatory differentiation of human induced pluripotent stem cells generates thymic epithelium that supports thymic crosstalk and directs dendritic- and CD4/CD8 T-cell full development.</a> bioRxiv. 2023, 572664(2023).</li>
<li>Parent, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+thymic+epithelium+from+human+embryonic+stem+cells+that+supports+host+T+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of functional thymic epithelium from human embryonic stem cells that supports host T cell development.</a> Cell Stem Cell. 13 (2), 219-229 (2013).</li>
<li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+thymic+epithelial+progenitor-like+cells+reconstitutes+the+thymic+microenvironment+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human embryonic stem cells into thymic epithelial progenitor-like cells reconstitutes the thymic microenvironment in vivo.</a> Cell Stem Cell. 13 (2), 230-236 (2013).</li>
<li>Inami, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+induced+pluripotent+stem+cells+to+thymic+epithelial+cells+by+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of induced pluripotent stem cells to thymic epithelial cells by phenotype.</a> Immunol Cell Biol. 89 (2), 314-321 (2011).</li>
<li>Gras-Pena, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+stem+cell-derived+thymic+epithelial+cells+enhance+human+T+cell+development+in+a+xenogeneic+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human stem cell-derived thymic epithelial cells enhance human T cell development in a xenogeneic thymus.</a> J Allergy Clin Immunol. 149 (5), 1755-1771 (2022).</li>
<li>Lai, L., Jin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+thymic+epithelial+cell+progenitors+by+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Generation of thymic epithelial cell progenitors by mouse embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 27 (12), 3012-3020 (2009).</li>
<li>Ramos, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+human+thymic+cells+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Generation of functional human thymic cells from induced pluripotent stem cells.</a> J Allergy Clin Immunol. 149 (2), 767-781 (2022).</li>
<li>Provin, N., Giraud, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+pluripotent+stem+cells+into+thymic+epithelial+cells+and+generation+of+thymic+organoids%3A+Applications+for+therapeutic+strategies+against+APECED%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of pluripotent stem cells into thymic epithelial cells and generation of thymic organoids: Applications for therapeutic strategies against APECED.</a> Front Immunol. 13, 930963(2022).</li>
<li>Montel-Hagen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+recapitulation+of+murine+thymopoiesis+from+single+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">In vitro recapitulation of murine thymopoiesis from single hematopoietic stem cells.</a> Cell Rep. 33 (4), 108320(2020).</li>
<li>Park, J. -E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+atlas+of+human+thymic+development+defines+T+cell+repertoire+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A cell atlas of human thymic development defines T cell repertoire formation.</a> Science. 367 (6480), 3224(2020).</li>
<li>Flippe, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+reproducible+differentiation+of+hematopoietic+and+T+cell+progenitors+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Rapid and reproducible differentiation of hematopoietic and T cell progenitors from pluripotent stem cells.</a> Front Cell Dev Biol. 8, 577464(2020).</li>
<li>Padonou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aire-dependent+transcripts+escape+Raver2-induced+splice-event+inclusion+in+the+thymic+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Aire-dependent transcripts escape Raver2-induced splice-event inclusion in the thymic epithelium.</a> EMBO Rep. 23 (3), e53576(2022).</li>
<li>Han, J., Zúñiga-Pflücker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-oxygen+submersion+fetal+thymus+organ+cultures+enable+FOXN1-dependent+and+-independent+support+of+T+lymphopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">High-oxygen submersion fetal thymus organ cultures enable FOXN1-dependent and -independent support of T lymphopoiesis.</a> Front Immunol. 12, 652665(2021).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>아프로티닌</td><td>시그마 Aldrich</td><td>616370</td><td></td></tr><tr><td>BMP4</td><td>Miltenyi</td><td>130-111-165</td><td></td></tr><tr><td>CCR7 (CD197)</td><td>BD Biosciences</td><td>PE</td><td>클론 : 3D12; 희석 : 1 : 200</td></tr><tr><td>CD14</td><td>BD Biosciences</td><td>FITC</td><td>클론 : M5E2; 희석 : 1 : 200</td></tr><tr><td>CD19</td><td>BD Biosciences</td><td>PE</td><td>클론 : HIB19; 희석 : 1 : 200</td></tr><tr><td>CD205</td><td>BioLegend</td><td>FITC</td><td>클론 : MG38; 희석 : 1 : 200</td></tr><tr><td>CD3</td><td>BD Biosciences</td><td>PE</td><td>클론 : HIT3a; 희석 : 1 : 200</td></tr><tr><td>CD34</td><td>BD Biosciences</td><td>FITC</td><td>클론 : 8G12; 희석 : 1 : 100</td></tr><tr><td>CD4</td><td>BD Biosciences</td><td>PE</td><td>클론 : RPA-T4; 희석 : 1 : 100</td></tr><tr><td>CD4</td><td>BD Biosciences</td><td>BV711</td><td>클론 : L200; 희석 : 1 : 200</td></tr><tr><td>CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>PerCP</td><td>클론 : HI30; 희석 : 1 : 200</td></tr><tr><td>CD56</td><td>BD Biosciences</td><td>PE</td><td>클론 : B159; 희석 : 1 : 200</td></tr><tr><td>CD62L</td><td>BD Biosciences</td><td>BV605</td><td>클론 : DREG-56; 희석 : 1 : 200</td></tr><tr><td>CD69</td><td>BD Biosciences</td><td>BV510</td><td>클론 : FN50; 희석 : 1 : 200</td></tr><tr><td>CD7</td><td>BD Biosciences</td><td>APC</td><td>클론 : M-T701; 희석 : 1 : 200</td></tr><tr><td>CD8</td><td>BD Biosciences</td><td>PeCy7</td><td>클론 : RPA-T8; 희석 : 1 : 200</td></tr><tr><td>CD8</td><td>BD Biosciences</td><td>PE</td><td>클론 : HIT8a; 희석 : 1 : 200</td></tr><tr><td>Dynabeads 팬 마우스 IgG</td><td>Invitrogen</td><td>11041</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Miltenyi</td><td>130-097-751</td><td></td></tr><tr><td>EPCAM (CD326)</td> <td>BD Biosciences</td><td>PE</td><td>클론 : HEA-125; 희석 : 1 : 200</td></tr><tr><td>EPCAM (CD326)</td> <td>Miltenyi</td><td>BV711</td><td>클론 : EBA-1; 희석 : 1 : 200</td></tr><tr><td>FGF10</td><td>Miltenyi</td><td>130-127-858</td><td></td></tr><tr><td>FGF8</td><td>Biotechne R & ; D</td><td>423-F8</td><td></td></tr><tr><td>피브리노겐</td><td>시그마 알드리치</td><td>341578</td><td></td></tr><tr><td>FLT3 L</td><td>Peprotech</td><td>AF-300-19</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-61</td><td></td></tr><tr><td>IGF1</td><td>Miltenyi</td><td>130-093-886</td><td></td></tr><tr><td>IL7</td><td>Peprotech</td><td>AF-200-07</td><td></td></tr><tr><td>RANK L</td><td>Biotechne R & ; D</td><td>6449-TEC</td><td></td></tr><tr><td>적혈구 용해 용액</td><td>Miltenyi</td><td>130-094-183</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>SCF</td><td>Peprotech</td><td>AF-300-07</td><td></td></tr><tr><td>트롬빈</td><td>시그마 Aldrich</td><td>605190</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco</td><td>2605010</td><td></td></tr><tr><td>XVIVO10</td><td>Lonza</td><td>LONBE04-380Q</td><td></td></tr></tbody></table>

3차원 피브린 하이드로겔에서 인간 흉선 오가노이드의 형성

Formation of Human Thymus Organoids in Three-Dimensional Fibrin Hydrogels

프로토콜의 워크플로는 그림 4에 요약되어 있습니다. 이 3D 오가노이드 배양 모델을 위해 우리는 이전에 우리 팀이 제공한 물리적, 기계적 단서 덕분에 몇 일 동안 주요 마우스 mTEC를 유지하기 위해 사용했던 트롬빈과 피브리노겐 하이드로겔을 채택했습니다34. 중합 후 겔은 느슨한 스펀지 같은 메쉬 구조를 보여야 합니다(그림 5).
초기 파종 및 부착 단계 후, 오가노이드는 겔의 표면과 최상층 모두에서 점진적으로 성장하고 발달했습니다. 겔 특성, 파종 조건 및 겔에 파종된 오가노이드의 수에 따라 오가노이드는 구형에서 직사각형 구조로 형성되었으며(그림 6) 때때로 병합되어 더 큰 구조를 형성했습니다. 배양 첫 주 이후 오가노이드 내에서 조직의 두 가지 특정 하위 수준이 관찰되었습니다: 첫 번째는 오가노이드에서 방사선을 조사하고 하이드로겔을 모든 방향으로 식민지화하는 큰 세포에 의해 형성된 긴 세포 표면 돌출부와 같은 구조를 관찰했습니다(그림 6 및 그림 7). 둘째, 우리는 이러한 세포 돌출부 주위에 집중된 작은 세포에 의해 형성된 클러스터와 같은 구조를 관찰했습니다. 연구 가설을 확인하기 위해 두 세포 유형을 모두 분리할 수는 없었지만, 이 현상은 흉선 간호사 세포 복합체(thymic nurse cell complexes)로 알려진 다수의 훨씬 더 작은 발달 T 세포와 개별 cTEC의 상호 작용에 의해 형성된 흉선 피질 내에서 발견되는 3D 배열을 연상시킵니다11 (그림 8).
오가노이드 배양 단계의 여러 시점에서 유세포 분석을 통해 흉선 오가노이드의 세포 구성을 평가하고 TEC(EPCAM+ CD45-로 특징지어짐), 흉선세포(EPCAM-CD45+ CD3+)(그림 9) 및 흉선 조혈 비흉선 세포 subset으로 구성된 EPCAM-CD45+ CD3- 구획과 같은 몇 가지 주요 구획을 식별했습니다. 자세한 내용은 Provin et al.23에서 확인할 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig01.jpg"> 그림 1: iPSC에서 TEP로의 차별화 특성화. (A) D13에서 iPSC에서 TEP로의 분화의 예, 도립 위상차 현미경, 400x. 스케일 바: 500 μm. (B) 도트 플롯 예, 분화 14일째에 DAPI- 세포 중 EPCAM+ 세포의 비율, FlowJo 10.0.7의 이미지. (C) iPSC에서 TEP로 분화 16일째에 DAPI(파란색), PAX9(빨간색) 및 KRT8(녹색)에 대한 면역염색, 면역형광 및 컨포칼 이미징. 흰색 화살표는 anti-PAX9 염색의 예를 나타냅니다. 척도 막대: 50 μm (D) iPS에서 TEP로 분화하는 동안 FOXN1의 발현 수준(RQ에서 GAPDH까지). TEC: 양성 대조군 참조, 소아 흉선 샘플에서 분리한 1차 인간 TEC. Prism의 그래프(GraphPad 버전 8.0.1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig02.jpg"> 그림 2: 하이드로겔 형성, 오가노이드 파종 및 배양 배지 분포를 위한 실험 설정. (A) 하이드로겔이 주조된 배양 플레이트는 상단 및 하단 열에 배치된 행잉 인서트에 주조됩니다. (B) 오가노이드 시딩: 1개의 오가노이드가 포함된 절단된 피펫 콘을 하이드로겔 위에 건드리지 않고 놓고 오가노이드를 겔 표면에 부드럽게 파종합니다. (C) 배양 배지는 피펫의 팁을 행잉 인서트의 암 사이에 위치시켜 배양 웰에 증착됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig03.jpg"> 그림 3: 파종 전 흉선 오가노이드 배양의 D0(전체 프로토콜의 13-15일). (A) Lon71.019 iPS 라인에서 파생된 TEC로 생산된 오가노이드. (B) MIPS203.003 iPS 라인에서 파생된 TEC로 생산된 오가노이드. 도립 위상차 현미경, 1000×. 스케일 바: 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig04.jpg"> 그림 4: 프로토콜의 모든 단계를 요약한 표현. 소아 흉선 샘플을 수집하고 해리하고, 1차 Lin-CD34+ CD7+ ETP를 유세포 분석으로 분류했습니다. iPS 세포의 분화는 TEP 정체성을 위해 수행되었습니다. ETP 및 iPS 유래 TEP를 저결합 96웰 플레이트에 모아서 파종하고 하룻밤 사이에 흉선 오가노이드로 응집했습니다. 피브린 하이드로겔은 아프로티닌, 피브리노겐 및 트롬빈으로 제조되어 교수형 인서트에 주조되었습니다. 중합 후, 오가노이드를 하이드로겔 위에 파종하고 1상 배양 배지를 웰에 첨가했습니다. 오가노이드는 최대 6주 동안 배양액에 보관되었습니다. BioRender에서 제작, 출판 라이선스 AG26EFCZOM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig05.jpg"> 그림 5: 하이드로겔의 조직과 구조. 도립 위상차 현미경, 1000×. 스케일 바: 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig06.jpg"> 그림 6: 성숙한 오가노이드와 3차원 구조. (A) 3D 배양 24일째의 흉선 오가노이드, MIPS203.003 iPS 라인. (B) 3D 배양 32일째 흉선 오가노이드의 합성 이미지, Lon71.019 iPS 라인. 도립 위상차 현미경. 스케일 바: 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig07.jpg"> 그림 7: 흉선 오가노이드의 구조 세부 정보. (A) 3D 배양 32일째의 흉선 오가노이드, L71.019 iPS 라인. (B) 3D 배양 27일째의 흉선 오가노이드, L80.002 iPS 라인. 도립 위상차 현미경, 400x. 스케일 바: 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig07large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig08.jpg"> 그림 8: 3D 배양 32일째 시점의 흉선 오가노이드의 구조 세부 정보. 흰색 화살표는 TEC 세포에 근접하여 증식하는 작은 흉선 세포 클러스터를 가리킵니다. 도립 위상차 현미경, 400x. 스케일 바: 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig08large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig09.jpg"> 그림 9: 흉선 오가노이드 내 T 세포 구획의 비율. (A) 점도표 예, 3D 배양 35일째에 흉선 오가노이드의 살아있는(DAPI-) 세포 내 CD45+ CD3+ 세포의 비율, FlowJo 10.0.7의 이미지. CD45+ CD3- 분획은 조혈 비흉선 세포로 구성됩니다. (B) 3D 배양 17일, 24/25일, 32일, 39/40일에 흉선 오가노이드의 살아있는 세포 내 CD45+ CD3+ 세포의 비율, 기술적 중복 또는 삼중의 경우 n=2, Prism(GraphPad 버전 8.0.1) 그래프. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig09large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>단위</td>
			<td>1단계 매체 14일차부터 18일차까지</td>
			<td>2단계 중형 19일차 이후</td>
		</tr><tr><td>기지</td>
			<td></td>
			<td>XVIVO10</td>
			<td>XVIVO10</td>
		</tr><tr><td>BMP4</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>50</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>FGF8</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>FGF10 시리즈</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>IGF1 (이그에프1)</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>EGF (영문)</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>랭크 L</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
		</tr><tr><td>일리노이7</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>FLT3 패</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>증권 시세 표시기</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr><tr><td>글루타맥스</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>1%</td>
			<td>1%</td>
		</tr></tbody></table>표 1: 보충제 및 각각의 농도.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>아프로티닌(μL)</td>
			<td>트롬빈(μL)</td>
			<td>피브리노겐 (μL)</td>
			<td>1단계 매체</td>
			<td>오가노이드(단위)</td>
		</tr><tr><td>24웰 플레이트</td>
			<td>5</td>
			<td>75</td>
			<td>75</td>
			<td>1</td>
			<td>3 대 5</td>
		</tr><tr><td>12웰 플레이트</td>
			<td>9.2</td>
			<td>138.2</td>
			<td>138.2</td>
			<td>1.8</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>6웰 플레이트</td>
			<td>16</td>
			<td>240.8</td>
			<td>240.8</td>
			<td>3.2</td>
			<td>8에서 9</td>
		</tr></tbody></table>표 2: 6웰, 12웰 및 24웰 플레이트에서 하이드로겔을 준비하고 오가노이드를 파종하는 데 필요한 성분 비율.

Generation of a functional and self-tolerant T cell repertoire is a complex process dependent on the thymic microenvironment and, primarily, on the ...

formation-human-thymus-organoids-three-dimensional-fibrin

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 비디오에의 준비 2 dGuo - 처리 증명 thymus 문화를 reaggregate.

Thymus 문화 Reaggregate

현재의 2D 배양 시스템이 in vivo 시나리오를 모방하지 않기 때문에 in vitro에서 수질 흉선 상피 세포를 연구하는 것은 대체로 성공적이지 못했습니다. 본 명세서에 기술된 3D 배양 시스템(변형된 피부 유기형 배양 모델)은 mTEC 증식, 분화 및 난잡한 유전자 발현의 유지를 재현하는 데 탁월한 것으로 입증되었습니다.

수질 흉선 상피 세포의 증식, 분화 및 무차별 유전자 발현을 지원하는 3D의 Organotypic 공동 문화 모델

이 비디오는 FACS 분리를 위해 밀도 구배로 흉선 상피 세포(TECH)를 강화하는 프로토콜을 보여줍니다. 또한 EAK16-II/EAKIIH6 펩타이드를 사용하여 TEC 응집체 형성을 촉진하는 것을 보여줍니다. EAK16-II/EAKIIH6 하이드로겔의 미세환경은 TEC의 생존과 기능을 유지하는 데 필요한 3D 구성을 제공합니다.

EAK 16-II와 FACS 정화 흉선 상피 세포의 3 차원 집계를 홍보 / EAKIIH6 자기 조립 하이드로 겔을

이 프로토콜의 목표는 심장 조직 공학, 약물 스크리닝 및 질병 모델링을 위해 심장 섬유아세포(CFs)와 공동 배양된 줄기 세포 유래 심근세포(CFs)로 구성된 고도로 정렬된 인간 심장 조직의 3차원(3D) 미세유체 모델의 개발을 설명하고 시연하는 것이다.

미세 유체 플랫폼 내에서 3D 조직 된 인간 심장 조직 개발

여기에서는 힘줄 기초 연구를 위한 유망한 도구이자 힘줄 조직 공학을 위한 잠재적인 스캐폴드 없는 방법을 제공하는 3단계 오가노이드 모델(2차원[2D] 확장, 2D 자극, 3차원[3D] 성숙)을 시연합니다.

Human Dermal Fibroblast를 이용한 Self-Assembled Cell Sheet Culture 및 3D Tendon/Ligament-like Organoid의 수동 생성 시연

이 프로토콜은 인간 만능 줄기세포를 사용하여 혈관 오가노이드를 생성하는 방법을 제시합니다.

인간 유도 만능 줄기 세포(Human-Induced Pluripotent Stem Cells)에서 혈관 오가노이드 생성

이 프로토콜은 통제된 3차원 배양 시스템에서 유선의 형태형성의 주요 특징을 재현하는 인간 유방 오가노이드를 생성하는 정의된 하이드로겔 기반 방법을 설명합니다.

유방 형태 형성을 재현하는 3차원 인간 유방 오가노이드를 생성하는 정의된 하이드로겔 기반 방법

분화된 인간 신경 줄기세포(hNSCs)에서 miRNA의 변화를 특성화하기 위한 목적으로 3차원 시스템에서의 hNSC 분화, miRNA PCR 어레이에 의한 microRNA 발현 변화 평가, miRNA 표적 예측을 위한 컴퓨터 분석 및 이중 루시페라제 분석에 의한 검증에 대해 설명합니다.

3 차원 문화, 마이크로 RNA의 분석 및 추정 적 표적 유전자에 인간의 신경 줄기 세포 라인의 차별화

피라미드 신경 세포의 돌기 쪽은 포유류의 뇌 피질에있는 대부분의 흥분성 시냅스의 사이트입니다. 이 방법은 유도 된 다 능성 줄기 세포로부터 유래 된 인간 피질 피라미드 글루타메이트 성 뉴런의 척추 모폴로지의 3D 정량 분석​​을 설명한다.

인간 유도 만능 줄기 세포에서 파생 된 피라미드 뉴런에서 돌기 쪽의 3 차원 정량화

이 프로토콜 상피 장벽 침투성 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 인간의 창 자 organoids에서 실시간 다음 약리학 적인 치료에서의 측정을 설명 하 고 라이브 셀 현미경 검사 법.

인간의 장 Organoids에 상피 장벽 침투성의 실시간 측정

학습하세요 3D 피브린 하이드로겔에서 인간 흉선 오가노이드 형성 방법을. 이 기술은 흉선 상피세포 성숙과 체포이식을 지원하여 자가면역 질환 연구와 세포 치료에 활용됩니다.

3차원 피브린 하이드로겔에서 인간 흉선 오가노이드의 형성

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