Name: Retrobulbar Sinus 주사에 의한 출생 후, 청소년 및 Runted 성인 마우스에 대한 체계적인 치료 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 2 min 39 s
Description: 배우세요 소형 마우스에서 유전자 치료를 위한 눈 뒤쪽 정맥동 주사법을. 이 기술은 대사 장애 연구와 임상 시험으로의 전환을 촉진합니다.

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NHGRI 마우스 시설 직원, NCI 분자 병리학 연구소, 특히 Andrew Warner의 도움에 감사드립니다. R.J.C.는 1ZIAHG200318-16을 통해 NHGRI의 교내 연구 프로그램의 지원을 받고 있으며, 이 연구는 NCATS(National Center for Advancing Translational Sciences)의 일부 자금 지원을 받았습니다. 그림 2C 는 BioRender로 생성되었습니다.

이 프로토콜과 함께 제공되는 비디오는 retrobulbar sinus 주사에 의한 출생 후, 청소년 및 runted 성인 마우스의 retrobulbar 주입 공간을 위한 것입니다. 이 프로토콜은 프로토콜 번호 G-03-4에 따라 National Human Genome Research Institute의 ACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다. 교육기관마다 요구 사항 및 제한 사항이 다를 수 있으며, 교육기관에서 승인을 받기 위해 이 프로토콜을 수정해야 할 수 있습니다. 이 동물 시술이나 다른 동물 시술을 수행하기 전에 해당 기관의 ACUC로부터 승인을 받으십시오.
1. 주입 전 준비
<ol><li>각 주입에 대해 멸균 1.5mL 미세 원심분리 튜브에 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)를 사용하여 AAV를 원하는 주입 부피와 농도로 희석합니다. 일회용 멸균 주사기를 정확하게 주입할 수 있도록 각 주입에 대해 50%의 부피를 추가합니다. 참고: 여기서는 AAV8-CAG-eGFP 리포터를 희석하여 50μL의 부피에서 체질량(vg/kg) kg당 1 ×10 13바이러스 게놈의 투여량을 전달합니다. 주입할 50μL의 AAV의 양은 주입 시점의 동물의 무게를 사용하여 계산됩니다. 이 비디오에서 AAV는 인간에게 전신 전달을 복제하기 위해 후불 경로를 통해 주입되고 있습니다. 다른 유전자 치료 벡터(즉, 렌티바이러스, 아데노바이러스), RNA 치료제 및 소분자는 이 절차를 사용하여 전신적으로 전달할 수 있습니다.</li>
	<li>탁상용 실험실 동물 마취 시스템(LAAS)이 제조업체의 지침에 따라 올바르게 설정되고 올바르게 작동하는지 확인하십시오. 알림: 대체 마취 방법을 사용하는 경우 주사를 시작하기 전에 마취가 준비되었는지 확인하십시오. 후구(retrobulbar) 주사 절차는 대부분의 마취제(예: 케타민 및 자일라진과 같은 주사 가능한 화학적 억제제)와 호환되어야 합니다.</li>
	<li>일회용 멸균 주사기(여기서는 인슐린 주사기, 31G, 길이 8mm, 용량 3/10mL)를 채우기 전에 플런저를 위아래로 여러 번 움직여 플런저를 부드럽게 누를 수 있도록 합니다. 그런 다음 주사기를 원하는 양까지 채우고 기포가 없는지 확인합니다. 참고: 최대 150μL의 부피를 주입할 수 있습니다. 우리 실험실은 일반적으로 50μL의 부피를 주입합니다.</li>
</ol>2. 실험실 동물 마취 시스템(LAAS)으로 이소플루란 가스 투여를 통한 마우스 진정
<ol><li>가스가 유도 챔버로만 흐르는지 확인하십시오. 비재호흡(NRB) 회로에 대한 양방향 스톱콕을 닫습니다.</li>
	<li>유량계 전면에 있는 녹색 산소 유량 손잡이를 켜서 1L/min의 유속이 되도록 합니다.</li>
	<li>기화기 상단의 레버를 누르고 다이얼을 원하는 농도로 돌려 이소플루란을 ≤4%로 돌립니다.</li>
	<li>투명 유도 챔버에 마우스를 놓습니다. 동물의 호흡과 움직임을 주의 깊게 관찰하십시오. 동물이 누워있으면 기화기 손잡이를 이소플루란의 2-2.5%로 낮춥니다.</li>
	<li>안면 마스크에 부착된 NRB 회로에 대한 양방향 마개를 열고 인덕션 박스로의 가스 흐름을 닫습니다.</li>
	<li>동물을 제거하고 NRB 회로의 안면 마스크에 넣습니다.</li>
	<li>자극에 대한 반응(예: 발가락 꼬집기 또는 발 쥐어짜기)에 따라 결정되는 이소플루란 농도 설정을 1.5%-1.75%로 낮추십시오.</li>
	<li>항상 쥐의 호흡과 점막 색을 지속적으로 모니터링하십시오(가능한 경우). 동물의 호흡이 힘들어지거나 점막색이 분홍색이 아닌 경우 마취 농도를 낮추십시오.</li>
	<li>전체 절차 동안 동물을 따뜻하게 유지하십시오. 언더패드 아래에 놓고 마우스 바로 아래에 있는 종이 타월로 감싼 손난로를 사용합니다.</li>
	<li>절차 완료 후 산소와 기화기를 끄십시오.</li>
</ol>3. 동물의 주사
<ol><li>오른손잡이인 경우 마우스의 오른쪽 눈을 주입하고 주둥이가 오른쪽을 향하도록 마우스를 왼쪽에 놓습니다. 왼손잡이인 경우 마우스의 왼쪽 눈을 주입하고 주둥이가 왼쪽을 향하도록 마우스를 오른쪽에 놓습니다.</li>
	<li>안구에 안과 마취제를 한두 방울 떨어뜨리고 주사합니다. 그런 다음 멸균 흡수성 거즈 패드를 사용하여 과도한 안과 마취 용액을 제거합니다. 손가락 끝으로 피부, 등쪽, 눈의 복부에 부드러운 압력을 가하여 쥐의 안구가 소켓에서 부분적으로 돌출되도록 합니다(그림 2A,B). NOTE: 눈을 돌출시킬 때 주변 자궁경부에 과도한 압력을 가하면 혈류와 주입을 방해할 수 있으므로 주의하십시오. 또한 기관에 압력을 가하면 쥐가 숨을 쉬는 것을 방해할 수 있습니다. 절차 내내 마우스가 숨을 쉴 수 있는지 확인하십시오.</li>
	<li>바늘을 약 30° 각도로 비스듬한 위치에 놓고 내측 안각에 놓습니다(그림 2C). 참고: 후구동에 도달하기 위한 바늘 위치의 깊이는 동물의 크기에 따라 다릅니다. 주사하는 동안 바늘을 비스듬한 위치에 있으면 안구 손상의 위험이 줄어듭니다. 바늘을 너무 깊게 놓거나 안와에 구멍을 뚫지 않도록 주의하십시오. 주사는 1분 이내에 완료됩니다.</li>
	<li>주사기 플런저에 천천히 부드럽게 압력을 가하여 주입액을 전달합니다. 이렇게 하면 사출의 가능성이 줄어듭니다.</li>
	<li>바늘을 천천히 부드럽게 제거하십시오.</li>
	<li>마취에서 회복할 수 있도록 마우스에서 안면 마스크를 제거합니다.</li>
</ol>4. 주입 후
<ol><li>절차 완료 후 산소와 기화기를 끄십시오.</li>
	<li>잔류 출혈이 발생하면 멸균 거즈를 사용하여 혈액을 제거하십시오.</li>
	<li>마우스가 따뜻한 곳(약 37°C)에 있는지 확인하되 과도하게 뜨거워지지 않도록 하여 마취에서 회복하는 동안 저체온증을 방지합니다.</li>
	<li>완전히 회복될 때까지 쥐를 격리하여 관찰한 후 마우스를 케이지와 랙에 다시 넣습니다. 참고: 회복 중에 마우스를 격리하면 케이지 메이트가 회복 중에 진정된 마우스를 다치게 하는 것을 방지할 수 있습니다.</li>
</ol>

Retrobulbar 주입 기법을 사용한 마우스의 효과적인 전신 전달

<ol><li>Perlman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+human+disease%3A+An+evolutionary+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Evol+Med+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Mouse models of human disease: An evolutionary perspective.</a> Evol Med Public Health. 2016 (1), 170-176 (2016).</li>
<li>Samelson-Jones, B. J., George, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+gene+therapy+for+hemophilia%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Med%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus gene therapy for hemophilia.</a> Annu Rev Med. 74, 231-247 (2023).</li>
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<li>Chandler, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+gene+therapy+for+methylmalonic+acidemia+using+the+novel+adeno-associated+viral+vector+44.9%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Systemic gene therapy for methylmalonic acidemia using the novel adeno-associated viral vector 44.9.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 27, 61-72 (2022).</li>
<li>Chandler, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+aav9+gene+therapy+improves+the+lifespan+of+mice+with+niemann-pick+disease%2C+type+c1%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Systemic aav9 gene therapy improves the lifespan of mice with niemann-pick disease, type c1.</a> Hum Mol Genet. 26 (1), 52-64 (2017).</li>
<li>Venturoni, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+advantage+of+corrected+hepatocytes+in+a+juvenile+model+of+methylmalonic+acidemia+following+liver+directed+adeno-associated+viral+mediated+nuclease-free+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Genet+Metab%22%5BJournal%5D)">Growth advantage of corrected hepatocytes in a juvenile model of methylmalonic acidemia following liver directed adeno-associated viral mediated nuclease-free genome editing.</a> Mol Genet Metab. 137 (1-2), 1-8 (2022).</li>
<li>Ilyinskii, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immtor+nanoparticles+enhance+aav+transgene+expression+after+initial+and+repeat+dosing+in+a+mouse+model+of+methylmalonic+acidemia%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Immtor nanoparticles enhance aav transgene expression after initial and repeat dosing in a mouse model of methylmalonic acidemia.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 22, 279-292 (2021).</li>
<li>Davidson, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+systemic+aav+gene+therapy+with+a+neurotrophic+capsid+in+niemann-pick+disease+type+c1+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci+Alliance%22%5BJournal%5D)">Improved systemic aav gene therapy with a neurotrophic capsid in niemann-pick disease type c1 mice.</a> Life Sci Alliance. 4 (10), e202101040(2021).</li>
<li>Chandler, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+gene+therapy+using+an+aav44.9+vector+rescues+a+neonatal+lethal+mouse+model+of+propionic+acidemia%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Systemic gene therapy using an aav44.9 vector rescues a neonatal lethal mouse model of propionic acidemia.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 30, 181-190 (2023).</li>
<li>Rocha-Ferreira, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neonatal+rodent+model+of+retroorbital+vein+injection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A neonatal rodent model of retroorbital vein injection.</a> J Vis Exp. (204), e65386(2024).</li>
<li>Bohnert, B. N., Artunc, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+nephrotic+syndrome+in+mice+by+retrobulbar+injection+of+doxorubicin+and+prevention+of+volume+retention+by+sustained+release+aprotinin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Induction of nephrotic syndrome in mice by retrobulbar injection of doxorubicin and prevention of volume retention by sustained release aprotinin.</a> J Vis Exp. (135), e57642(2018).</li>
<li>Bohnert, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrobulbar+sinus+injection+of+doxorubicin+is+more+efficient+than+lateral+tail+vein+injection+at+inducing+experimental+nephrotic+syndrome+in+mice%3A+A+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Retrobulbar sinus injection of doxorubicin is more efficient than lateral tail vein injection at inducing experimental nephrotic syndrome in mice: A pilot study.</a> Lab Anim. 53 (6), 564-576 (2019).</li>
<li>Meijer, M. K., Spruijt, B. M., Van Zutphen, L. F., Baumans, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+restraint+and+injection+methods+on+heart+rate+and+body+temperature+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Effect of restraint and injection methods on heart rate and body temperature in mice.</a> Lab Anim. 40 (4), 382-391 (2006).</li>
<li>Nohara, M., Tohei, A., Sato, T., Amao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+response+to+restraint+stress+by+salivary+corticosterone+levels+in+adult+male+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vet+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Evaluation of response to restraint stress by salivary corticosterone levels in adult male mice.</a> J Vet Med Sci. 78 (5), 775-780 (2016).</li>
<li>Schoch, A., Thorey, I. S., Engert, J., Winter, G., Emrich, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+lateral+tail+vein+and+the+retro-orbital+venous+sinus+routes+of+antibody+administration+in+pharmacokinetic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus routes of antibody administration in pharmacokinetic studies.</a> Lab Anim (NY). 43 (3), 95-99 (2014).</li>
<li>Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+lateral+tail+vein+and+the+retro-orbital+venous+sinus+as+routes+of+intravenous+drug+delivery+in+a+transgenic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as routes of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model.</a> Lab Anim (NY). 37 (1), 26-32 (2008).</li>
<li>Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+aav+serotypes+1-9+mediated+gene+expression+and+tropism+in+mice+after+systemic+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Analysis of aav serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection.</a> Mol Ther. 16 (6), 1073-1080 (2008).</li>
</ol>

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retrobulbar 주입은 소분자, 단백질 및 게놈 요법을 전달하는 신뢰할 수 있는 방법이지만, 신뢰할 수 있고 복제 가능한 전신 전달을 보장하기 위해서는 염료로 이 기술을 연습하는 것이 필요합니다. 염료의 사용은 실험에서 이 전달 경로를 사용하기 전에 마우스에서 retrobulbar 주입을 연습하는 데 적극 권장됩니다. 염료는 마우스 조직에서 육안으로 확인할 수 있어 일관된 전신 전달을 보장할 수 있습니다.
retrobulbar 주입 기술에 대한 우리의 시연에서, 이소플루란 가스는 절차 전에 마우스를 마취하기 위해 사용되었다. 시술 전에 다른 형태의 마취를 사용할 수 있지만 주사가 완료되기 전에 마우스가 진정제에서 회복되지 않도록 하는 것이 중요합니다. 다행히도 실제 주입은 일반적으로 1분 미만이 소요되며 마우스를 완전히 마취해야 하는 시간은 짧습니다. 주사하는 동안 마우스를 완전히 진정시켜야 하며, 주사 전에 마우스가 의식을 갖게 되면 마취를 다시 투여해야 합니다. 마취 사용과 관련된 위험이 있기 때문에 마우스가 진정되는 시간을 최소화해야 합니다. 우리는 메틸말론산혈증과 프로피온산혈증이 있는 작고 아픈 쥐를 진정시키기 위해 이소플루란을 사용하는 데 문제가 없었습니다. 그러나 일부 마우스 모델은 진정 및 특정 마취에 더 민감할 수 있습니다. 연구에서 진정제를 사용하려고 시도하기 전에 이 잠재적인 문제를 고려해야 합니다. 마지막으로, 후구 주사와 함께 진정제를 사용하면 진정제가 일반적으로 사용되지 않는 TVI에 비해 주사 과정에서 쥐가 보이는 명백한 고통을 크게 줄일 수 있습니다.
주사 후 관련 문제는 관찰되지 않았지만 모든 주사에 감염이 발생할 수 있습니다. 감염 가능성을 줄이기 위해 멸균된 AAV를 희석하기 위한 멸균 일회용 주사기와 멸균 PBS가 사용됩니다. 우리 동물 시설의 모든 쥐는 잠재적인 건강 문제의 징후가 있는지 매일 확인하고 필요한 경우 건강 문제를 해결하기 위해 수의학적 치료를 받습니다.
후구동 주사의 대안이자 청소년 및 성인 마우스에 대한 전신 전달의 더 널리 사용되는 방법은 TVI입니다. TVI 및 retrobulbar sinus 주입은 작은 분자 및 항체의 경우 유사한 생체 분포를 초래하며, 외삽에 의해 바이러스 벡터에 대해서도 동일한 결과가 예상됩니다15,16. 그러나 TVI와 후불동 주사에 의한 유전자 치료 벡터의 전신 전달을 비교한 예는 문헌에서 찾을 수 없었다. 우리의 의견으로는, retrobulbar sinus 주사는 성장 표현형이 감소하거나 조기 치사율이 있는 마우스에서 수행하기가 더 쉽습니다.
TVI 는 인간에게 후구동이 있지만 꼬리가 없음에도 불구하고 인간의 전신 분만과 더 유사한 것으로 간주되는 경우가 많습니다. 일 측면에서, 후구동 주사제는 말초에 삽입된 중앙 카테터(PICC Line) 또는 팔에 배치된 정맥 카테터에 의해 주사제가 사람에게 전달된 것과 동일하게 주사제가 상부 정맥계로 진입한다는 점에서 인간 전신 전달과 유사합니다. 반대로, 주사제는 꼬리 정맥 주사 후 쥐의 하부 정맥 시스템으로 들어갑니다. 불행히도, 이러한 방법 중 어느 것도 인간에서 전신 전달에 사용되는 방법을 정확히 복제하지 않지만, 둘 다 마우스에서 전신 전달에 효과적인 방법입니다.

유전 질환의 쥐 모델은 일반적으로 소분자, 유전 및 세포 치료의 효능을 입증하는 데 사용됩니다1. 생쥐에서 인간에게 전신 전달을 복제하는 데 가장 널리 사용되는 방법은 꼬리 정맥 주사(TVI)이며, 이는 일반적으로 생후 약 6-8주에 성인 생쥐에서 정맥이 접근할 수 있을 만큼 충분히 큰지 확인하기 위해 수행됩니다. TVI는 혈우병과 같은 유전 질환에 대한 수많은 전임상 원리 증명 연구에서 성공적으로 사용되어 왔으며, 유전자 치료를 위한 인간 임상 시험을 지원했다2. 그러나 유전 질환의 많은 쥐 모델에는 성장 및/또는 조기 치사 표현형이 있어 성인 마우스의 연령이나 크기에 도달하는 데 방해가 됩니다(그림 1). TVI를 통해 이러한 마우스를 치료하는 것은 치사율의 연령 및/또는 동물이 달성할 수 있는 최대 크기에 따라 불가능하지는 않더라도 매우 어려울 수 있습니다.
대조적으로, retrobulbar(빈번하고 부적절하게 retro-orbital이라고 함) 부비동 주사에 의한 치료제의 전신 전달은 연령이나 크기에 관계없이 마우스에서 매우 쉽게 수행할 수 있습니다3. 아데노 관련 바이러스(AAV)의 후불 주사는 메틸말론산혈증(MMA) 및 Niemann-Pick C형 질환 4,5,6,7,8과 같은 유전 질환의 젊은 성장 지연 쥐 모델에서 성공적으로 사용되었습니다. (이 절차는 신생아 3,4,9,10을 주입하는 데에도 사용할 수 있습니다. 그러나 이 기술은 이 프로토콜이나 함께 제공되는 비디오에 자세히 설명되어 있지 않습니다.) 독소루비신(doxorubicin)과 같은 독성이 강한 물질조차도 후불 주사에 의해 안전하게 전달될 수 있다11,12. TVI와 달리, 마우스는 후구동 주사 중에 마취되는데, 이는 마우스에 대한 절차를 덜 스트레스 받게 하고 마우스를 물리적으로 제지할 필요가 없는 작업자에게 더 쉽게 만든다13,14. 또 다른 우려는 TVI가 꼬리 정맥을 확장하기 위해 열 램프를 자주 사용한다는 것인데, 이는 잠재적으로 어린 쥐에서 탈수를 유발할 수 있고 열 관련 스트레스가 더 의심되는 유전 질환의 쥐 모델에서 문제가 될 수 있습니다. TVI를 사용할 때 발생할 수 있는 또 다른 문제는 색소가 많은 마우스에서 꼬리 정맥을 시각화하기가 특히 어려울 수 있다는 것입니다. 그러나, TVI와 같이, 후구동 주사는 광범위한 전신 생체 분포를 초래한다15,16.

<table><tbody><tr><td>AAV8-CAG-eGFP</td><td>Univ. Penn. Vector Core</td><td>특별 주문</td><td>AAV 기자 및 대체 AAV 기자의 대체 소스는 사용 가능합니다</td></tr><tr><td>Barrier (Filter) Tips, 20 &mu; 주입</td>량<td>과 농도를 줄이기 위해 AAV를 희석하기 위한</td>L 크기 <td>ThermoFisher</td><td>AM12645</td></tr><tr><td>Barrier (Filter) Tips, 100 &mu; L 크기 (멸균)</td> <td>ThermoFisher</td><td>AM12648</td><td>주입량과 농도를 줄이기 위해 AAV를 희석하기위한</td></tr> 이중 <tr><td>Prodedure Circuit&nbsp;</td><td>VetEquip</td><td>921400</td><td>대체 마취 방법은 Gilsen</td></tr><tr><td>PIPETTEMAN Classic P20 피펫</td><td>Gilson</td><td>F123600</td><td>주입량과 농도를 줄이기 위해 AAV를 희석하는</td></tr> 데 사용할 수 있습니다. <tr><td>Gilsen PIPETTEMAN Classic&nbsp; P100 피펫</td><td>Gilson</td><td>F123615</td><td>주입량과 농도를 줄이기 위해 AAV를 희석하기 위한</td></tr><tr><td>핸드 워머 (HOTHANDS)</td><td>ULINE</td><td>S-1497B</td><td>를 마취시키는 동안 마우스를 따뜻하게 유지하기 위한</td></tr> 인<tr><td>슐린 주사기, 31 G,&nbsp; 길이 8 mm, 용량 3/10 mL</td><td>Becton Dickson</td><td></td><td>328438 비디오에 사용됨; 주입당 하나의 주사기</td></tr><tr><td>Isoflurane (Fluriso)</td><td>VETONE</td><td>502017</td><td>대체 마취를 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>Medline Protection Plus 일회용 언더패드</td><td>ThermoFisher</td><td>23-666-062</td><td>주사 중 마우스를 놓기 위해</td></tr><tr><td>Oak Ridge Phlebotomy Sharps 용기 투명 뚜껑이 있는</td><td>ThermoFisher</td><td>22-730-434</td><td>바늘 처리용</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 PBS, pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>AAV를 원하는 농도 및 부피로 희석하기 위해</td></tr><tr><td>Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes (sterile)</td> <td>ThermoFisher</td><td>3451</td><td>주입량과 농도를 줄이기 위해 AAV를 희석하는 데 사용됩니다</td></tr><tr><td>sterile 거즈 스폰지 4"x"4</td><td>Covidien</td><td>3033</td><td></td></tr><tr><td>Trecaine Hydrochloride Ophthalmic (0.5%)</td> <td>Ocenanside Pharmaceuticals</td><td>AK102D5DS</td><td>local&nbsp;</td></tr><tr><td>27.0 G (또는 그 이하)Any 마취제 투베르큘린 주사기</td><td></td> 비디오 VetEquip<td>에 사용된 인슐린 주사기의 대안</td> <td>N/A</td></tr><tr><td> 테이블 탑 및 이동식 실험실 동물 마취 시스템에 대한 사용 설명서 및 작동 설명서.&nbsp;</td><td>VetEquip</td><td>chrome-extension://efaidnbmnnnibpcajpcglclefindmkaj/https://www.vetequip.com/pdfs/LAAS%20Manual.pdf</td><td>사용자 가이드 및 매뉴얼 링크</td></tr></tbody></table>

retrobulbar sinus 주사에 의한 출생 후, 청소년 및 runted 성인 마우스에 대한 체계적인 치료

Systemic Treatment for Postnatal, Juvenile, and Runted Adult Mice by Retrobulbar Sinus Injection

꼬리 정맥 주사는 성체 마우스에서 전신 분만 경로로 자주 사용되지만, 후구 주사는 제한이 적은 전신 분만을 위한 대체 방법입니다. 첫째, 꼬리 정맥 주사(TVI)는 꼬리 정맥의 크기가 접근에 적합한 성인 마우스로 제한됩니다. 성체 마우스를 치료하는 것으로 제한되는 것은 성인이 될 때까지 생존하지 않는 마우스 모델을 다룰 때 문제가 될 수 있습니다. 둘째, TVI는 마우스가 성인 야생형 마우스의 크기를 달성하지 못하는 성장 지연 표현형을 가진 마우스 모델에는 적합하지 않습니다. 따라서 retrobulbar 주사는 젊은 쥐와 작은 성인 쥐 모두를 치료하는 데 성공적으로 사용될 수 있습니다. 마지막으로, 후구근 주사는 마취 하에 수행되는데, 이는 일반적으로 마취 없이 수행되는 TVI보다 마우스에 대한 스트레스가 적습니다. 이 논문에서는 작고 어린 마우스에 대한 전신 전달에 사용할 수 있는 retrobulbar 주사에 대한 프로토콜과 자세한 지침을 제시합니다.

Retrobulbar sinus 주사는 소분자, 항체 및 아데노 관련 바이러스(AAV)4,5,9,15,16를 전신적으로 전달하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 그림 3에서는 PBS(vehicle) 처리된 마우스의 간과 AAV8 처리된 마우스의 간을 AAV 주입 및 retrobulbar 주입 후 발현의 예로 나타냈습니다. AAV8은 자연적으로 발생하는 많은 AAV 벡터와 마찬가지로 간 영양성(liver trophic)입니다. 따라서, 5 × 1012vg/kg17의 전신 투여량을 받은 마우스에서 상당한 간 형질도입이 예상된다. 그림 3에서 볼 수 있듯이 AAV 전이유전자에 의해 발현되는 메틸말로닐-CoA 돌연변이효소(MMUT) RNA를 발현하는 많은 수의 간세포는 성공적인 후궤도 주입을 나타냅니다.
<img alt="프로피온산혈증 대 야생형 마우스 비교, 체중 차이, 4주, 연구 결과." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66809/66809fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 그림 1: 프로피온산혈증을 앓고 있는 성장 지연 마우스. 이것은 유전 질환의 쥐 모델에서 발생할 수 있는 극단적인 성장 지연의 예입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66809/66809fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="마우스 눈 주입 과정; 다이어그램은 실험실 실험에서 안구 주입 설정을 보여줍니다." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66809/66809fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 그림 2: 후구동 주사의 이미지 및 다이어그램. (A) 안구를 돌출시키기 위해 털에 손가락을 놓은 이미지(흰색 화살표로 표시). (B) 바늘을 놓고 주입하기 전에 털에 아래쪽 압력을 가한 후 돌출된 안구(흰색 화살표로 표시) 이미지. (C) 바늘 경사 방향(안구를 기준으로 아래로 경사지), 바늘 각도(30°) 및 후구동 바늘 배치의 다이어그램. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66809/66809fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="현미경 이미지, 세포 구조 분석; 면역조직화학; 단백질 발현 검출." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66809/66809fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 그림 3: AAV8을 사용한 retrobulbar sinus 주입 후 RNA in situ hybridization. MMUT RNA로 염색된 (A) 10x 차량 처리 간, (B) 10x AAV8 처리 간, (C) 20x 차량 처리 간 및 (D) 20x AAV8 처리 간의 이미지. 메틸말론산혈증이 있는 마우스는 생후 1개월에 AAV8-LPS-MMUT의 5 ×10 12 vg/kg의 용량 또는 차량 대조군(PBS)으로 치료하였다. 간 조직은 치료 1개월 후에 수집하였다. MMUT (영 문) RNA는 갈색으로 염색됩니다(검은색 화살표는 양성 염색 영역을 나타냄). 헤마톡실린으로 염색된 간. 스케일 바 = 이미지의 경우 100 μm 10배, 20x 이미지의 경우 50 μm(B). 약어: AAV = 아데노 관련 바이러스; LPS = 간 특이적 프로모터; MMUT = 메틸말로닐-CoA 돌연변이효소. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66809/66809fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 기사는 산후, 청소년 및 런트 성인 마우스에 대해 최대 총 150μL의 후불동 주사에 대한 프로토콜과 동반 비디오를 제공합니다. 이 시술은 꼬리 정맥 주입이 불가능한 작은 마우스(15g)의 주사에 특히 적합합니다.

Retrobulbar Sinus 주사에 의한 출생 후, 청소년 및 Runted 성인 마우스에 대한 체계적인 치료

While tail vein injections are frequently used as a systemic route of delivery in adult mice, retrobulbar injections are an alternative method for ...

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

이 수술 기법은 마우스 눈의 subretinal 공간으로 유전자 치료 벡터와 줄기 세포의 주입을 보여줍니다.

마우스 눈에 유전자 치료 벡터와 줄기 세포의 Subretinal 주입

여기서 우리는 신생아 마우스 뇌에 아데노 관련 바이러스를 뇌실 내 주입하여 광범위한 신경 세포 전달을 위한 기술을 보여줍니다.  이 방법은 바이러스로 전달된 transgenes의 평생 발현을 달성하는 빠르고 쉬운 방법을 제공합니다.

영구와 광범위한 신경 세포의 형질 도입에 대한 신생아 마우스 뇌의 뇌실 바이러스 감염

소아 질환의 동물 모델은 초기 발병과 적극적인 질병의 진행을 경험할 수 있습니다. 임상 어린 마우스 모델에 관련된 치료 전달 기술적 어려울 수있다. 이 프로토콜은 생후 두 생후 일 이내 신생 쥐 비 침습적 정맥 주입 방법을 설명한다.

신생아 마우스의 정맥 주사

여기에서는 바이러스 입자 또는 형광 마이크로비즈를 신생아 쥐의 뇌에 뇌내실 및 혈관 내 주입하는 간단한 방법을 설명합니다. 바이러스와 나노 입자의 국소화 패턴은 현미경 평가 또는 현장 혼성화에 의해 검출될 수 있습니다.

신생아 뇌에 바이러스 성 입자와 형광 마이크로 비즈의 뇌실과 혈관 내 주입

망막하 주사는 단백질 및 바이러스 벡터와 같은 큰 치료제를 광수용체와 망막 색소 상피에 전달하는 가장 일반적인 기술입니다. 최소한의 부수적 손상과 빠른 회복 시간으로 망막하 공간을 성공적으로 표적으로 삼는 마우스의 대체 방법이 여기에 설명되어 있습니다.

망막 하 공간에 액세스하기위한 대안의 검증 사출 방법<i&gt;를 통해</i&gt;를 Transcleral 후방 접근

여기, 우리는 독 소 루비의 신속한 retrobulbar 주입 하 여 129S1/SvImJ 마우스에 있는 실험적인 신 증후군의 유도 설명합니다. 우리는 또한 aprotinin 요도 떠들고 효소 활동을 억제 하 고 나트륨 보존 방지를 포함 하는 지속적인된 출시 펠 릿을 가진 신 쥐를 취급 합니다.

독 소 루비의 Retrobulbar 주입 및 예방의 지속적인된 출시 Aprotinin 여 볼륨 유지에 의해 쥐에서 신 증후군의 유도

이 프로토콜은 전방 화학 유전 변형제를 체성 운동 피질에 주입하고 역행 수송 가능한 Cre 재조합 효소를 자궁 경부 척수에 주입하여 출생 후 5-10 일에 신생아 쥐의 세포 하위 집단에 유전자 요법을 적용하는 새로운 방법을 보여줍니다.

뇌 및 척추 결합 수술을 사용하여 이중 바이러스 벡터로 신생아 쥐의 피질척수관 표적화

이 프로토콜은 신생아 기간 동안 쥐와 생쥐에서 사용할 수 있는 재현 가능한 정맥 투여 경로를 입증하는 것을 목표로 합니다. 이 절차는 주로 정맥 투여를 사용하는 신생아 치료실에서 약물 투여를 미러링하고자 하는 전임상 설치류 연구에 중요합니다.

후안와 정맥 주입의 신생아 설치류 모델

어린 쥐의 요추 수조에 주사를 놓는 수술 절차가 설명되어 있습니다. 이 접근법은 유전자 치료 벡터의 척수강내 전달에 사용되어 왔지만, 이 접근법은 세포 및 약물을 포함한 다양한 치료제에 사용될 수 있을 것으로 예상됩니다.

Intrathecal vector delivery in juvenile rats via lumbar cistern injection(요추 수조 주입을 통한 어린 쥐의 척수강내 벡터 전달)

이 연구는 성체 쥐의 망막과 시신경에 치료제를 전달하는 방법론을 제시합니다. 또한, 성체 쥐의 시신경과 망막을 하향식으로 일괄적으로 수집하기 위해 독특한 조직 회수 방법이 도입되었습니다.

성체 쥐의 안구 치료 전달 및 고급 조직 회수(Ocular Therapeutic Delivery and Advanced Tissue Retrieval in adult rats)

배우세요 소형 마우스에서 유전자 치료를 위한 눈 뒤쪽 정맥동 주사법을. 이 기술은 대사 장애 연구와 임상 시험으로의 전환을 촉진합니다.

Retrobulbar Sinus 주사에 의한 출생 후, 청소년 및 Runted 성인 마우스에 대한 체계적인 치료

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