Name: 고분해능 호흡 측정법을 통한 인간 및 생쥐 골격근 섬유의 미토콘드리아 호흡 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T13:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: 학습하세요 고분해능 호흡 측정법을 이용한 인간 및 생쥐 골격근 섬유의 미토콘드리아 호흡 측정 방법을. 이 기술은 대사 질환 연구에서 생리학적으로 관련성 높은 미토콘드리아 기능 평가를 가능하게 합니다.

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모든 마우스 시술은 워싱턴 대학의 기관 동물 보호 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다. 모든 성별, 연령 및 체중의 마우스가 이러한 실험에 사용될 수 있으며 다루고자 하는 실험 질문의 성격에 따라 달라집니다. 여기에 사용된 마우스는 성체(12-16주령) 수컷 야생형 C57BL/6 마우스입니다. 모든 인간 절차는 워싱턴 대학의 기관 검토 위원회(Institutional Review Board)의 승인을 받았습니다. 연구 대상자는 데이터 사용에 동의했으며, 이 프로토콜에 포함된 대표적인 인간 피험자 데이터는 발표된 연구14에서 발췌한 것이다. 이 데이터는 당뇨병이 없는 폐경 후(55-75세) 여성의 데이터입니다. 분석에 필요한 시약을 준비하기 위한 자세한 내용은 표 1에 나와 있습니다. 분석에 사용된 특정 시약, 도구 및 기계에 대한 정보는 재료 표에 나열되어 있습니다. 프로토콜의 개략도는 그림 1에 나와 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66834/66834fig01.jpg"> 그림 1: 투과성 골격근 샘플에 대한 고분해능 호흡 측정을 위한 개략도. 이 원고에 자세히 설명된 방법은 1) 호흡 완충액 및 시약 준비, 2) 분석 당일 기기 및 시약 준비, 3) 근육 샘플의 준비 및 투과화, 4) 샘플 및 기기 준비, 5) 호흡 분석 실행, 6) 데이터 분석의 6개 섹션으로 나뉩니다. Created with BioRender.com <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66834/66834fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
1. 분석 준비 및 기기 교정
<ol><li>분석 당일, 각 호흡 화합물(블레비스타틴, 팔미토일-카르니틴, 글루타메이트, 말레이트, ADP, 숙시네이트, 시토크롬 C, FCCP)의 필요한 수의 분취액을 제거하고 얼음에서 해동합니다. BIOPS 및 MiR05 바이알을 얼음에서 해동합니다.</li>
	<li>표 1과 같이 사포닌 및 피루브산 용액을 준비합니다. 표 05와 같이 MiR1의 작업 용액을 준비합니다. 기기당 MiR05 작업 용액 5mL(챔버 2개)를 준비합니다. 필요에 따라 확장합니다.</li>
	<li>고해상도 호흡 측정 시스템과 진공 시스템을 켭니다. 마개를 제거하고 70% 에탄올 저장 용액을 진공으로 제거한 다음 챔버를 초순수 분자 등급 H2O로 다시 채우고 진공 및 리필로 H2O를 제거합니다. 총 3회 세탁을 반복합니다. 최종 세척 후 각 챔버에 MiR05 2mL(크레아틴 또는 블레비스타틴 제외)를 추가합니다.</li>
	<li>호흡 측정 소프트웨어를 엽니다. 소프트웨어가 시작되면 기기 설정을 위한 팝업 상자가 열립니다. 챔버 교반 속도를 750rpm으로, 온도를 37°C로, 데이터 기록 간격을 2초로 설정합니다. 산소 센서의 경우 이득을 1로 설정하고 분극 전압을 800mV로 설정합니다. Connect to Oxygraph 를 클릭하여 기기와의 통신을 설정합니다.</li>
	<li>통신이 설정되면 실험 파일의 이름을 지정하고 저장할 수 있는 대화 상자가 열립니다. 현재 날짜 및 보정과 함께 파일을 저장합니다. 파일을 저장한 후 실험 세부 정보를 볼 수 있는 팝업 대화 상자가 나타납니다. 교정 실행에는 정보가 필요하지 않으며 상자를 닫을 수 있습니다.</li>
	<li>챔버가 예열될 수 있도록 최소 30분 동안 산소 농도를 기록하고 공기 보정을 위한 신호를 기록합니다. 이것은 아래 2단계에서 자세히 설명한 대로 근섬유를 준비하는 동안 수행할 수 있습니다.</li>
	<li>교정 기간이 끝나면 산소 농도(파란색 선)가 안정적인 지역을 가로질러 교정 지역을 표시합니다. 이렇게 하려면 Shift 키와 마우스 왼쪽 버튼을 누른 상태에서 타임라인의 영역을 가로질러 드래그합니다.</li>
	<li>Oxygraph &gt; O2 Calibration으로 이동하여 보정 창을 엽니다. Air Calibration(공기 보정)의 경우 1.8단계에서 생성된 마크를 선택합니다. Calibrate and Copy to Clipboard(보정 및 클립보드에 복사)를 클릭합니다.</li>
	<li>나머지 챔버에 대해 1.6-1.8단계를 반복합니다. 매일 공기 보정을 수행하십시오. 공기 보정 기록을 중지하고 기기와의 연결을 끊어 파일을 저장합니다. 샘플이 준비되면 3단계로 진행하여 분석을 수행합니다.</li>
</ol>2. 골격근 섬유의 수확 및 투과화
<ol><li>마우스 조직 분리<ol><li>분석할 각 샘플에 대해 12웰 배양 접시의 웰 하나를 1mL의 BIOPS로 채웁니다. 얼음 위에 접시를 올려 식힙니다.</li>
		<li>이산화탄소 흡입 후 자궁 경부 탈구로 쥐를 안락사 시킨 후 관심 골격근을 적출하고 모든 결합 조직과 지방을 제거해야 합니다(그림 2A). BIOS가 들어 있는 웰 중 하나에 근육을 놓습니다. 섬유질이 준비될 때까지 얼음 위에 놓습니다. 참고: 이 프로토콜을 사용하여 모든 골격근을 검사할 수 있습니다 - 검사되는 근육 유형은 다루고자 하는 실험적 질문에 따라 다릅니다. 비복근과 같은 혼합 섬유 유형을 가진 골격근의 경우, 조직을 백색과 적색 절편으로 분리하여 주로 빠른 경련(백색 절편)과 주로 느린 경련(적색 절편) 섬유를 측정할 수 있습니다(그림 2B).</li>
	</ol></li>
	<li>인체 조직 분리<ol><li>임상 프로토콜에 따라 조직 수집14. 차갑고 멸균된 PBS로 조직을 빠르게 헹구고 2mL의 BIOPS 용액이 들어 있는 원추형 튜브에 넣습니다. 섬유질이 준비될 때까지 티슈를 얼음 위에 두십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>섬유질 준비<ol><li>투과화는 6웰 조직 배양 플레이트에서 이루어집니다. 한 웰 세트에 2mL의 BIOPS 용액을 추가하고 다른 웰 세트에 MiR05 2mL를 추가합니다. 분석되는 각 샘플에 대해 한 세트의 웰이 필요합니다.</li>
		<li>쟁반에 얼음을 채우고 유리 페트리 접시를 얼음 위에 거꾸로 놓습니다. 항상 근육을 얼음 위에 두십시오.</li>
		<li>채취한 근육 샘플을 겸자를 사용하여 냉각된 페트리 접시 플랫폼으로 옮깁니다. 끝이 가는 두 개의 집게와 광원이 있는 해부 현미경을 사용하여 근육에 붙어 있는 힘줄, 근막 및 지방 조직을 제거하여 조직을 부드럽게 청소합니다.</li>
		<li>근육이 아닌 외부 조직을 모두 제거한 후, 끝이 가는 집게로 근육 섬유를 부드럽게 잡아당겨 길이가 0.75 - 1.0 mm인 반투명 섬유의 작은 다발이 될 때까지 잡아당깁니다(그림 2C-D). 섬유를 분리한 후 겸자를 사용하여 섬유 다발을 얼음에 BIOPS 용액이 들어 있는 6웰 플레이트의 웰로 옮깁니다.</li>
		<li>각 BIOPS 웰에 20μL의 5mg/mL 사포닌 용액을 추가하고 차가운 방에서 20분 동안 부드럽게 흔들면서 플레이트를 얼음 위에 배양합니다.</li>
		<li>사포닌 처리 후 근육 섬유를 MiR05가 들어있는 웰로 옮겨 분석 전에 헹굽니다. 차가운 방에서 15분 동안 부드럽게 흔들면서 얼음 위에서 배양합니다.</li>
		<li>MiR05에서 섬유 배양이 완료되면 날카로운 집게로 섬유를 모으고 작업 와이프에 근육 섬유를 부드럽게 닦아내어 건조시킵니다. 1.5mL 플라스틱 미세 원심분리기 튜브를 미세한 균형으로 갈아잣고 튜브에 2-3mg의 섬유를 넣습니다. 각 튜브의 측면에 최종 섬유 무게를 기록합니다. 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 다른 샘플로 반복합니다. 즉시 3단계로 진행합니다.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66834/66834fig02.jpg"> 그림 2: 쥐의 골격근 섬유의 분리. (A) 수확 후 마우스 gastrocnemius의 총 형태. (B) 비복근을 적색(왼쪽)과 백색(오른쪽)으로 해부. (C) 기계적으로 분리된 근섬유. (D) 성공적으로 분리된 근육 섬유의 10x 이미지. 눈금 막대는 1mm입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66834/66834fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
3. 호흡계에서 근육 샘플 준비
<ol><li>위의 1단계에서 자세히 설명한 대로 기기 교정에 사용되는 MiR05를 진공 청소기로 청소하고 각 챔버에 2.1mL의 작동 MiR05 용액을 추가합니다.</li>
	<li>1.5단계에서 자세히 설명한 것과 동일한 기기 설정을 사용하여 실험을 위한 새 파일을 시작합니다. 위. 파일 이름을 설정하고 설정을 저장합니다.</li>
	<li>파일 이름을 설정하면 다음 화면 대화 상자가 특정 실험 세부 정보에 표시됩니다. 각 챔버에 추가된 각 샘플의 무게와 샘플 정보를 입력합니다. 대화 상자를 닫습니다.</li>
	<li>새 실험 파일에 들어가면 O2 보정 창을 열어 보정을 설정합니다. 파일에서 복사 를 클릭하고 1.9단계에서 저장한 파일을 선택합니다. 위. Calibrate and Copy to Clipboard 버튼을 클릭합니다. 나머지 챔버에 대해 이 과정을 반복합니다.</li>
	<li>미세한 집게를 사용하여 근섬유 다발을 적절한 챔버의 호흡 용액으로 조심스럽게 옮깁니다. 나머지 챔버에 대해 반복합니다.</li>
	<li>스토퍼를 챔버에 놓고 스토퍼를 바닥의 절반 정도 밀어 챔버를 조심스럽게 반쯤 닫습니다. 스토퍼의 O-링이 챔버 벽에 맞물리고 저항이 있으면 아래로 눌러 닫으면서 비틀림 동작을 사용합니다. 챔버가 반쯤 닫히면 챔버 상단에서 작은 기포가 관찰될 수 있습니다. 알림: 투과성 섬유는 정기적인 호흡 조건에서 산소 확산 제한이 적용됩니다. 이러한 제한을 피하기 위해, 분석은 상승된 산소 농도 하에서 수행된다11.</li>
	<li>10mL 플라스틱 주사기에 산소 탱크의 순수 산소를 채웁니다. 기기와 함께 제공된 길고 뭉툭한 바늘을 주사기에 놓습니다. 첫 번째 챔버에 바늘을 놓고 약 1mL의 산소를 챔버로 천천히 전달합니다.</li>
	<li>호흡 측정 소프트웨어에서 챔버 산소 농도를 모니터링합니다. 챔버 산소 농도가 350-400 nmol/mL에 도달하면 스토퍼를 부드럽게 비틀면서 아래로 눌러 챔버를 완전히 닫습니다. 챔버를 들여다보고 기포가 남아 있지 않은지 확인합니다. 기포가 있는 경우 챔버를 신중하고 빠르게 다시 열고 100μL의 추가 작동 MiR05 용액을 추가한 다음 챔버를 빠르게 다시 닫습니다. 나머지 챔버로 반복합니다.</li>
	<li>분석 중 산소 농도는 250nmol/mL 이상으로 유지되어야 합니다. 챔버를 부분적으로 열고 주사기에서 기포로 더 많은 산소를 추가한 다음 챔버를 다시 조심스럽게 닫아 필요에 따라 추가 산소를 추가합니다.</li>
	<li>산소 플럭스 데이터를 실험에 사용된 조직 질량으로 정규화합니다. 그래프를 조정하려면 O2 플럭스 (pmol O2 / (s x mg))를 반영하도록 레이아웃을 변경하십시오. 레이아웃 메뉴에서 06 - Specific Flux per Unit Sample 레이아웃을 선택합니다. 이제 데이터가 각 챔버의 조직 양으로 정규화되어 표시됩니다.</li>
</ol>4. 고해상도 호흡 측정법
<ol><li>산소 첨가 후 산소(파란색 선) 농도와O2 플럭스(빨간색 선)가 안정화되면 호흡 프로토콜을 시작합니다. 산소는 파란색 선이 평평하거나 천천히 감소할 때 안정적인 것으로 간주할 수 있습니다. O2 플럭스도 평평하고 5 pmol O2 / s x mg 이내여야합니다.</li>
	<li>유리 주사기를 사용하여 모든 시약을 추가합니다. substrate, inhibitor 및 uncoupler에 동일한 주사기를 사용하지 않는 것이 중요합니다. 각각에 대해 별도의 주사기를 준비하십시오. 각 화합물을 첨가한 후 호흡수가 안정된 후 다음 시약을 첨가하기 전에 1-2분 동안 산소 플럭스를 기록하십시오.</li>
	<li>호흡 측정<ol><li>10μL 유리 주사기를 사용하여 각 챔버에 0.8M 말레이트 2.5μL를 추가합니다. F4 를 눌러 타임라인을 표시하고 표시에 M이라는 레이블을 지정합니다.1-2 분 동안 안정적인 O 2 플럭스를 기록합니다.</li>
		<li>아래 설명된 대로 영양소 특이적 시약을 추가합니다.<ol><li>호기성 해당작용: 10μL 유리 주사기를 사용하여 각 챔버에 10μL의 2M 글루타메이트와 5μL의 2M 피루브산을 추가합니다. F4 를 눌러 타임라인을 표시하고 표시에 GP로 레이블을 지정합니다. 2-1분 동안 안정적인 O2 플럭스를 기록합니다.</li>
			<li>지방산: 10μL 유리 주사기를 사용하여 각 챔버에 10μL의 2M 글루타메이트와 10μL의 10mM 팔미토일-카르니틴을 추가합니다. F4 키를 눌러 타임라인을 표시하고 G PC로 마크에 레이블을 지정합니다. 2-1분 동안 안정적인 O2 플럭스를 기록합니다.</li>
		</ol></li>
		<li>25μL 유리 주사기를 사용하여 각 챔버에 0.5M(MgCl2 포함) ADP 20μL를 추가합니다. F4 키를 눌러 타임라인을 표시하고 ADP로 마크에 레이블을 지정합니다. 2-1분 동안 안정적인 O2 플럭스를 기록합니다.</li>
		<li>25μL 유리 주사기를 사용하여 각 챔버에 20μL의 1M 숙시네이트를 추가합니다. F4 를 눌러 타임라인을 표시하고 표시에 S라는 레이블을 지정합니다.1-2 분 동안 안정적인 O 2 플럭스를 기록합니다.</li>
		<li>10μL 유리 주사기를 사용하여 각 챔버에 5μL의 4mM 사이토크롬 C를 추가합니다. F4 를 눌러 타임라인을 표시하고 표시에 Cyt C로 레이블을 지정합니다. 1-2분 동안 안정적인 O2 플럭스를 기록합니다.</li>
		<li>10 μL 유리 주사기를 사용하여 1 mM FCCP의 1 μL 볼루스 3개에서 적정합니다. FCCP를 첨가할 때 일반적으로O2 플럭스 레벨이 잠시 감소하는 혼합 효과가 있습니다. 다음 단계로 진행하기 전에O2 플럭스가 증가하고 안정화될 때까지 기다립니다. 추가할 때마다 F4 키를 눌러 타임라인을 표시하고 FCCP로 표시를 레이블 지정합니다. 각 첨가 후 2분 동안 안정적인 O1 플럭스를 기록합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>호흡 분석이 완료되면 비틀거나 위로 당겨 마개를 부드럽게 제거합니다. 분출병의 초순수 H2O로 챔버를 3번 헹구고 분출병에서 3% 에탄올로 70배를 헹굽니다. 최종 에탄올 헹굼 후 보관을 위해 챔버를 70% 에탄올로 채웁니다.</li>
	<li>저항이 느껴질 때까지 챔버에 스토퍼를 설정하십시오. 스토퍼를 끝까지 닫지 마십시오. 스토퍼 위에 캡을 씌우고 분석 파일을 저장한 다음 호흡 측정 소프트웨어에서 기기를 분리합니다. 악기를 끕니다.</li>
</ol>5. 데이터 분석
<ol><li>호흡 측정 소프트웨어에서 분석 파일을 엽니다. 호흡 화합물 주입 후 얻은 안정적인 산소 플럭스 영역에서 데이터를 추출합니다.</li>
	<li>관심 영역을 표시하려면 Shift 키를 누른 상태에서 마우스 왼쪽 버튼을 클릭하고 아래에 자세히 설명된 분석 단계에 대한 안정적인 O2 플럭스 속도 영역을 가로질러 상자를 드래그합니다.</li>
	<li>분석 단계 14,15,16,17,18,19,20<ol><li>말레이트/글루타메이트/피루브산(호기성 해당작용 프로토콜) 또는 말레이트/글루타메이트/팔미토일-카르니틴(지방산 프로토콜)을 첨가한 후 타임라인을 표시합니다. 이 속도는 복합 I 상태 2 호흡(LEAK(n)) 속도를 나타냅니다.</li>
		<li>ADP를 추가한 후의 타임라인을 표시합니다. 이 속도는 복합체 I 상태 3 호흡(CI OXPHOS) 속도를 나타냅니다.</li>
		<li>숙시네이트를 추가한 후 타임라인을 표시하십시오. 이 비율은 복합 I+II 상태 3 호흡(CI+II OXPHOS) 속도를 나타냅니다.</li>
		<li>Cytochrome C를 추가한 후 타임라인을 표시합니다. 이 속도는 복합 I+II+사이토크롬 상태 3 호흡(CI+II+Cyt C OXPHOS) 속도를 나타냅니다.</li>
		<li>가장 높은 O2 플럭스 속도로 FCCP 적정 타임라인을 표시하십시오. 이 비율은 최대 호흡수(MAX ETS)를 나타냅니다.</li>
	</ol></li>
	<li>Mark &gt; Statistics를 선택하여 타임라인에서 표시된 영역에 대한 데이터 값을 검색합니다. 표시된 챔버의 O2 플럭스 속도(pmol O2/(s x mg))를 스프레드시트에 복사합니다.</li>
	<li>추가 챔버에 대해 마킹 및 데이터 추출을 반복합니다.</li>
	<li>복합체 I+II 상태 3(숙시네이트 추가 후)을 복합체 I 상태 2(ADP 추가 전)로 나누어 호흡 조절 비율(RCR)을 계산합니다.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>근육 섬유의 미토콘드리아 호흡에 대한 실시간 정량화

<table><tbody><tr><td>10 & 마이크로; L Hamilton 주사기 (유리 주사기)</td><td>ThermoFisher</td><td>14-813-125</td><td>호흡 분석 적정</td></tr><tr><td>25 &micro; L Hamilton 주사기 (유리 주사기)</td> <td>ThermoFisher</td><td>14-813-133</td><td>호흡 분석 적정</td></tr><tr><td>ADP</td><td>Merck</td><td>117105</td><td>호흡 측정 분석</td></tr><tr><td>검정 유리 해부 접시</td><td>Scintica</td><td>DD-90-S-BLK</td><td>샘플 준비</td></tr><tr><td>용 Blebbistatin</td><td>Sigma</td><td>B0560</td><td>Working MiR05 Solution</td></tr><tr><td>BSA, 지방산 무료</td><td>Sigma</td><td>A6003</td><td>MiR05 솔루션</td></tr><tr><td>탄산칼슘</td><td>시그마</td><td>C4830</td><td>BIOPS 솔루션</td></tr><tr><td>크레아틴</td><td>시그마</td><td>27900</td><td>작동 MiR05</td></tr><tr><td>솔루션 사이토크롬 C</td><td>시그마</td><td>C7752</td><td>폐활량 측정 분석</td></tr><tr><td>DatLab</td><td>Oroboros 기기</td><td>N/A</td><td>폐활량 측정 소프트웨어</td></tr><tr><td>디티오트레이톨(DTT)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D0632</td><td>BIOPS 솔루션</td></tr><tr><td>D-Sucrose</td><td>Sigma</td><td>84097</td><td>MiR05 솔루션</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E4378</td><td>BIOPS & MiR05 솔루션</td></tr><tr><td>FCCP</td><td>시그마</td><td>C2920</td><td>호흡량 측정 분석</td></tr><tr><td>글루타메이트</td><td>시그마</td><td>G1626</td><td>호흡량 측정 분석</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>시그마</td><td>H7523</td><td>MiR05 솔루션</td></tr><tr><td>이미다졸&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>56750</td><td>BIOPS 솔루션</td></tr><tr><td>KH2PO4&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P5379</td><td>MiR05 솔루션</td></tr><tr><td>락토비온산</td><td>Sigma</td><td>153516</td><td>MiR05 솔루션</td></tr><tr><td>말라테</td><td>Sigma</td><td>M1000</td><td>호흡계 분석</td></tr><tr><td>MES 수화물&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M8250</td><td>BIOPS 솔루션</td></tr><tr><td>MgCl2 - 6 H2O&nbsp;</td><td>시그마</td><td>M2670</td><td>BIOPS 및 MiR05 솔루션</td></tr><tr><td>Oroboros Oxygraph-2K (O2K) 시스템</td><td>Oroboros Instruments</td><td>10203-03</td><td>고해상도 호흡계</td></tr><tr><td>Palmitoyl-Carnitine</td><td>Sigma</td><td>P4509</td><td>폐활량 측정 분석</td></tr><tr><td>수산화칼</td>륨 <td>Sigma</td><td>P1767</td><td>BIOPS 솔루션</td></tr><tr><td>정밀 핀셋</td><td>Fisher</td><td>17-467-168</td><td>샘플 준비용</td></tr><tr><td>사포닌</td><td>Sigma</td><td>S2149</td><td>섬유 투과화용</td></tr><tr><td>나트륨 ATP</td><td>Sigma</td><td>A2383</td><td>BIOPS 솔루션</td></tr><tr><td>Sodium Phosphocreatine</td><td>Sigma</td><td>P7936</td><td>BIOPS 솔루션</td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Sigma</td><td>P2256</td><td>호흡계 분석</td></tr><tr><td>숙시네이트</td><td>Sigma</td><td>S2378</td><td>호흡계 분석</td></tr><tr><td>Taurine&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T0625</td><td>BIOPS 및 MiR05 솔루션</td></tr></tbody></table>

고분해능 호흡 측정법을 통한 인간 및 생쥐 골격근 섬유의 미토콘드리아 호흡 측정

Measurement of Mitochondrial Respiration in Human and Mouse Skeletal Muscle Fibers by High-Resolution Respirometry

그림 3 과 그림 4 는 적절하게 준비된 쥐 적색 및 백색 비복근 섬유에 대한 호기성 해당작용 및 지방산 호흡 측정 프로토콜의 산소 플롯을 보여줍니다. 또한 참조를 위한 대표적인 정량화된 결과도 표시됩니다. 그림 5 는 적절하게 준비된 인간 근육 생검 샘플에서 호기성 해당작용 호흡 측정법의 산소 플롯을 보여줍니다. 대표적인 정량화된 결과도 표시됩니다. 그림 3, 그림 4 및 그림 5의 경우 ADP 첨가 후 사이토크롬 C를 첨가해도 산소 플럭스에 영향을 미치지 않으며, 이는 샘플의 외부 미토콘드리아 막이 손상되지 않았음을 나타냅니다. 그림 6 은 ADP 후 사이토크롬 C를 첨가하면 산소 플럭스가 급증(40% 증가)하는 호기성 해당작용 호흡 측정법의 산소 플롯을 보여주며, 이는 외부 미토콘드리아 막이 손상되어 샘플을 호흡 측정에 사용해서는 안 된다는 것을 나타냅니다 - 이 결과의 잠재적 원인은 조직의 부적절한 취급 또는 동결/해동일 수 있습니다. 조직의 투과성을 연장하고 갓 분리된 조직을 사용하지 않습니다.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66834/66834fig03v3.jpg"> 그림 3: 마우스의 산소 소비량. 결과는 피루브산 프로토콜을 사용하여 (A) 적색 및 (B) 백색 비복근의 산소 소비량을 보여줍니다. 말레이트, 글루타메이트 및 피루브산(파란색 음영, CI LEAK)을 첨가한 후 상태 2 플럭스. O2 소비의 상당한 자극은 ADP 투여 후 관찰되며(녹색 음영, CI OXPHOS), 숙시네이트(보라색 음영, CI+II OXPHOS)를 첨가한 후 호흡이 더욱 촉진됩니다. 사이토크롬 C는 유의한 증가를 유도하지 않았으며(&lt;15%), 이는 외부 미토콘드리아 막이 손상되지 않았음을 나타냅니다(주황색 음영, CI+II+Cyt C OXPHOS). 미토콘드리아는 FCCP(노란색 음영, MAX ETS)가 추가된 후 분리됩니다. 파란색 선은 밀폐된 챔버의 산소 농도를 나타냅니다. 빨간색 선은 산소 소비량(O2 플럭스)을 나타냅니다. 첨가 화합물 : 말레이트 (m), 글루타메이트 (g), 피루브 산 (p), 아데노신 이인산 (ADP), 시토 크롬 C (cyt c), 카르 보닐 시안화물 -p- 트리 플루오로 메 톡시 페닐 히드라존 (FCCP). (C) 막대 그래프는 대표 결과(n=8)를 반영합니다. 데이터는 ± SEM으로 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66834/66834fig03largev2.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66834/66834fig04v2.jpg"> 그림 4: 마우스의 산소 소비량. 결과는 팔미토일-카르니틴 프로토콜을 사용하여 (A) 적색 및 (B) 백색 비복근의 산소 소비량을 보여줍니다. 말레이트, 글루타메이트 및 팔미토일 카르니틴(파란색 음영, CI LEAK)을 첨가한 후 상태 2 플럭스. O2 소비의 상당한 자극은 ADP 투여 후 관찰되며(녹색 음영, CI OXPHOS), 숙시네이트(보라색 음영, CI+II OXPHOS)를 첨가한 후 호흡이 더욱 촉진됩니다. 사이토크롬 C는 유의한 증가를 유도하지 않았으며(&lt;15%), 이는 외부 미토콘드리아 막이 손상되지 않았음을 나타냅니다(주황색 음영, CI+II+Cyt C OXPHOS). 미토콘드리아는 FCCP(노란색 음영, MAX ETS)가 추가된 후 분리됩니다. 파란색 선은 밀폐된 챔버의 산소 농도를 나타냅니다. 빨간색 선은 산소 소비량(O2 플럭스)을 나타냅니다. 첨가 화합물 : 말레이트 (m), 글루타메이트 (g), 팔미토일 카르니틴 (pc), 아데노신 디 포스페이트 (ADP), 시토크롬 C (cyt c), 카르보닐 시안화물 -p- 트리 플루오로 메톡시 페닐 히드라존 (FCCP). (C) 막대 그래프는 대표 결과(n=7)를 반영합니다. 데이터는 ± SEM으로 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66834/66834fig04largev2.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66834/66834fig05v2.jpg"> 그림 5: 피루브산 프로토콜을 사용한 인간 vastus lateralis의 산소 소비량에 대한 대표적인 결과. (A) 말레이트, 글루타메이트 및 피루브산을 첨가한 후 상태 2 플럭스(파란색 음영, CI LEAK). O2 소비의 상당한 자극은 ADP 투여 후 관찰되며(녹색 음영, CI OXPHOS), 숙시네이트(보라색 음영, CI+II OXPHOS)를 첨가한 후 호흡이 더욱 촉진됩니다. 사이토크롬 C는 유의한 증가를 유도하지 않았으며(&lt;15%), 이는 외부 미토콘드리아 막이 손상되지 않았음을 나타냅니다(주황색 음영, CI+II+Cyt C OXPHOS). 미토콘드리아는 FCCP(노란색 음영, MAX ETS)가 추가된 후 분리됩니다. 파란색 선은 밀폐된 챔버의 산소 농도를 나타냅니다. 빨간색 선은 산소 소비량(O2 플럭스)을 나타냅니다. 첨가 화합물 : 말레이트 (m), 글루타메이트 (g), 피루브 산 (p), 아데노신 이인산 (ADP), 시토 크롬 C (cyt c), 카르 보닐 시안화물 -p- 트리 플루오로 메 톡시 페닐 히드라존 (FCCP). (B) 막대 그래프는 vastus lateralis 생검에서 얻은 대표 결과를 반영합니다(n = 24). 데이터는 ± SEM으로 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66834/66834fig05largev2.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66834/66834fig06.jpg"> 그림 6: mouse red gastrocnemius에서 손상된 외부 미토콘드리아 막 무결성을 보여주는 대표적인 결과. 말레이트, 글루타메이트 및 피루브산(파란색 음영, CI LEAK)을 첨가한 후 상태 2 플럭스. O2 소비의 상당한 자극은 ADP 투여 후 관찰되며(녹색 음영, CI OXPHOS), 숙시네이트(보라색 음영, CI+II OXPHOS)를 첨가한 후 호흡이 더욱 촉진됩니다. 시토크롬 C는O2 소비의 현저한 증가(&gt;15%)를 유도했으며, 이는 외부 미토콘드리아 막의 손상을 나타냅니다. 파란색 선은 밀폐된 챔버의 산소 농도를 나타냅니다. 빨간색 선은 산소 소비량(O2 플럭스)을 나타냅니다. 첨가 화합물 : 말레이트 (m), 글루타메이트 (g), 피루브 산 (p), 아데노신 이인산 (ADP), 시토 크롬 C (cyt c), 카르 보닐 시안화물 -p- 트리 플루오로 메 톡시 페닐 히드라존 (FCCP). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66834/66834fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 1: 호흡 화합물 및 호흡 용액의 시약 준비. 최종 스톡 농도 및 준비 및 보관 방법을 포함하여 분석에 필요한 시약 준비에 대한 세부 정보가 제공됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66834/Reagent_Prep_7-31-24.zip" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Mitochondrial function, a cornerstone of cellular energy production, is critical for maintaining metabolic homeostasis. Its dysfunction in skeletal muscle ...

measurement-mitochondrial-respiration-human-mouse-skeletal-muscle

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

광근의 lateralis의 조직 검사, 정제 미토콘드리아의 준비, 호흡계 프로파일 링하는 방법이 설명되어 있습니다. 작은 부피의 근육 사용은 임상 연구 애플리케이션이 기술에 적합하다.

경피적 바늘 생검에 의해 획득 골격근 조직에서 고립 된 미토콘드리아의 준비 및 호흡계 평가

제시된 방법은 최소한의 마우스 골격근에서 분리된 미토콘드리아를 사용하여 마이크로플레이트 기반 호흡 측정 분석 모음의 수행을 위한 단계별 지침을 제공합니다. 이러한 분석은 일반적으로 사용되는 동물 모델에서 미토콘드리아 산소 소비량의 기계론적 변화/적응을 측정할 수 있습니다.

높은 처리량 마이크로 호흡 측정을위한 마우스 골격근의 최소 수량에서 미토콘드리아 격리 사용

여기에서는 소량의 마우스 골격근에서 고품질의 정제된 미토콘드리아를 분리할 수 있도록 이전에 보고된 방법의 변형을 제시합니다. 이 절차는 마이크로플레이트 기반 호흡기 분석 중에 높은 기능으로 호흡하는 고도로 결합된 미토콘드리아를 생성합니다.

높은 처리량 마이크로 호흡 측정을위한 마우스 골격근의 최소 수량에서 미토콘드리아의 분리

고해상도 호흡율은 미토콘드리아의 산소 소비를 결정하는 데 사용된다. 이것은 미토콘드리아 호흡 사슬 복합체 '(I-IV) 호흡 속도, 최대 미토콘드리아 전자 전달계 용량 및 미토콘드리아 외막 무결성을 결정하기위한 간단한 기술이다.

고해상도 호흡율은 투과성이 그대로 세포에서 미토콘드리아 기능을 평가하는

여기서, 마취된 돼지에서 대퇴사두근 표본을 채취하고 미토콘드리아를 차등 원심분리로 분리합니다. 그런 다음 미토콘드리아 호흡 사슬 복합체 I, II 및 IV의 호흡수를 고해상도 호흡 측정을 사용하여 결정합니다.

고해상도 호흡율 측정을위한 차동 원심 분리에 의한 골격근에서 본래 미토콘드리아의 분리

고분해능 호흡계를 사용하여 산화 인산화를 평가하는 것은 미토콘드리아와 세포 에너지 대사의 기능 분석의 필수적인 부분이되었습니다. 여기에서는 챔버 및 마이크로 플레이트 기반 고해상도 호흡계를 사용하여 세포 에너지 대사를 분석하기위한 프로토콜을 제시하고 각 장치의 주요 이점에 대해 논의합니다.

챔버 및 플레이트 기반 호흡계를 사용하여 세포 및 조직의 생물 에너지를 평가하기위한 고해상도 호흡 측정법

여기에서는 마우스 골격근으로부터의 미토콘드리아를 분리하는 상세한 방법과 마이크로플레이트 기반 호흡 측정법을 사용하여 산소 소모율(OCR)에 의한 호흡의 후속 분석을 설명한다. 이 파이프 라인은 미토콘드리아 대사에 대한 여러 환경 또는 유전 적 개입의 효과를 연구하는 데 적용될 수 있습니다.

호흡 측정을 위한 마우스 골격근으로부터 미토콘드리아의 분리

말은 뛰어난 유산소 운동 능력을 가지고 있어 말 골격근을 말 운동 생리학 연구와 포유류 미토콘드리아 생리학 연구 모두에 중요한 조직으로 만듭니다. 이 기사에서는 말 골격근의 미토콘드리아 기능을 종합적으로 평가하는 기술을 설명합니다.

말 골격근의 고분해능 불소 호흡 측정

엑기스의 관찰을위한 새로운 다양한 방법을 제시합니다. 이것은 장기 관찰에 적합 간주하고, pharmacophysiological 또는 분자 생물 학적 중재와 함께입니다.

내부 핵심 현미경에 의해 골격근의 생체내 미세 순환 측정

이 프로토콜은 골격 근육에서 격리 mitochondria의 호흡을 연구하는 절차를 설명합니다. 이 방법은 Scorrano에서...

골격근에서 Mitochondrial 절연

학습하세요 고분해능 호흡 측정법을 이용한 인간 및 생쥐 골격근 섬유의 미토콘드리아 호흡 측정 방법을. 이 기술은 대사 질환 연구에서 생리학적으로 관련성 높은 미토콘드리아 기능 평가를 가능하게 합니다.

고분해능 호흡 측정법을 통한 인간 및 생쥐 골격근 섬유의 미토콘드리아 호흡 측정

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