Name: 성장판 손상을 연구하기 위한 Tricolor Transgenic Murine 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-06T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: 배우세요 삼색 형광 트랜스제닉 마우스 모델을 이용한 성장판 손상 연구 방법을. 실시간 세포 반응 관찰과 뼈 다리 형성 방지를 위한 조직 공학 접근법을 탐색합니다.

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이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health), 국립관절염 및 근골격계 및 피부질환 연구소(National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases, NIAMS) 1R21AR079153의 보조금과 코네티컷 대학교 연구 향상 프로그램(University of Connecticut Research Enhancement Program, REP)의 보조금으로 지원되었습니다. 저자들은 코네티컷 대학교 MicroCT 이미징 코어 시설의 Renata Rydzik의 도움에 감사를 표하고자 합니다.

Trilineage Fluorescent Mice를 사용한 정확한 성장판 손상 연구

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</ol>

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

삼색 콜라겐 리포터 마우스의 혁신적인 사용은 미리 결정된 크기와 위치로 성장판 결손을 생성할 수 있게 하여 성장판 손상에 대한 쥐 실험 모델의 정확도를 크게 향상시킵니다. 생후 2주령 쥐의 작은 크기를 감안할 때, 사지가 약화되어 전층 골절이 발생하지 않도록 0.5mm의 작은 버를 사용하여 상처를 입히는 것이 중요합니다. 외과 의사는 또한 같은 이유로 뼈에 너무 깊게 구멍을 뚫지 않도록 결손을 만들 때 충분한 압력을 가해야 합니다. perioprobe의 사용은 일관된 부상 깊이를 확인하는 데 중요합니다.
여느 수술과 마찬가지로 적절한 마취 깊이를 확인하는 것이 중요하며, 가끔 발가락을 꼬집어 확인하고 무균 상태가 전체적으로 유지됩니다. 또 다른 중요한 외과적 요점은 조각가를 사용한 둔기 해부가 연조직 손상을 방지하고 마우스가 마취 회복 후 즉시 보행하여 영양과 편안함을 위해 어미 마우스에게 도달할 수 있도록 돕기 때문에 설명되었다는 것입니다. 우리의 경험에 따르면 봉합사로 봉합된 상처는 성공적으로 봉합된 상태로 유지되었으며 상처 클립이 필요하지 않습니다. 생후 2주에 생후 2주에 쥐를 대상으로 수술을 하는 것이 성장판 골절을 경험하는 어린 아이를 가장 잘 모방하기 위해 권장됩니다. 이 프로토콜의 한 가지 단점은 예측할 수 없는 출산의 특성을 감안할 때 이 마우스 모델을 사용하려면 단기간에 외과의가 사용할 수 있어야 한다는 것입니다.
결함을 생성하기 위한 bur의 위치와 관련하여, 프로토콜은 콜라겐 X 형광의 밝기 때문에 성장판 내의 비대 영역을 비추는 mCherry/Texas 적색 필터 세트를 사용하여 부상을 생성하는 방법을 설명합니다. 경골 성장판 내에 손상이 발생하도록 하려면 연조직 입구를 좌우로 약간 움직여 대퇴골이 아닌 근위 경골 성장판이 시야에 있는지 확인하는 것이 좋습니다. 증식성 연골세포 영역 또는 인접한 뼈 절편을 비추기 위해 필터 세트 채널 간 전환은 증식 연골 절편 및 인접 골 절편의 위치에 대한 정확한 배치를 확인하는 데 유용합니다.
증식성 연골 세포 영역과 epiphyseal 및 metaphyseal 뼈는 살아있는 마우스의 형광 현미경으로 구별 할 수 있지만 Type II 및 Type I 콜라겐 리포터의 실제 가치는 성장판의 조직 학적 분석 중에 실현됩니다. cryo-histological processes의 수성 특성을 감안할 때, 기존의 chromogenic dye precipitation protocol은 탈수 단계로 인한 형광 이미징과 색상의 잠재적인 불일치로 인해 적합하지 않습니다. 수성 프로토콜은 파라핀 절편에서와 유사한 염색 패턴을 생성하지만, 조직에서 염료가 확산되는 것을 방지하기 위해서는 신속한 염색 후 이미징이 필수적입니다. 증류수에 30% 글리세롤을 장착 매체로 사용하면 이러한 확산을 늦출 수 있으므로 Safranin O/Fast Green이 있는 연골을 포함하여 동일한 섹션에서 여러 발색 염색이 가능합니다.
내연골 골화 과정은 진화하는 뼈 다리를 감싸고 있는 붉은 연골세포와 함께 명확하게 볼 수 있습니다 (그림 6). 사용 가능한 많은 쥐 항체가 있는 면역조직화학 기술의 추가 사용은 이러한 형질전환 마우스에서 수행된 기계론적 연구를 더욱 향상시킬 수 있습니다. 이 형질전환 마우스 모델에서 팩스트론, 마이크로CT 및 냉동 조직학 이미징 기술의 조합은 성장판 손상에 대한 반응으로 발생하는 거시적 및 미시적 변화에 대한 포괄적인 이해를 제공하여 이러한 부작용을 완화하기 위한 향후 치료 개입을 위한 길을 닦습니다. 이러한 형질전환 마우스의 추가 유전자 조작을 수행하여 계통 추적 연구를 통해 시간적, 공간적으로 치유에 관여하는 세포의 기원을 이해할 수 있습니다. 추가 수정을 가한 쥐에 대한 실험은 성장판 근처의 연골과 뼈의 과잉 증식인 골연골종과 같은 연골 질환을 연구할 수 있게 해줍니다.
우리 모델의 일관성은 관절 연골 손상으로 인해 그룹에서 마우스를 버릴 필요 없이 모든 마우스에서 뼈 브리지의 재현 가능한 형성으로 입증됩니다. 이것은 성장판 아래의 피질 창에서 성장판에 접근하고 날카로운 도구나 굴을 성장판 쪽으로 위쪽으로 각도를 잡고 때때로 관절 연골로 오버슈트했던 이전 모델에 비해 개선된 것입니다. 관절 연골의 추가 손상은 어린이에서 일반적으로 발생하는 성장판 손상을 모방하지 않습니다. 이 동물 모델의 보다 정확한 손상은 실험당 필요한 마우스의 수를 줄이며 이는 또 다른 개선입니다. 형질전환 마우스를 사용하면 연구자는 관절 연골에 영향을 주지 않고 비대/임시로 석회화된 영역 또는 골단/휴식 영역/증식 영역 영역과 같은 성장판의 하위 섹션에 부상을 집중할 수 있습니다. 그러나 이 모델의 한계는 뼈 다리 부피의 변동성이며, 이는 부상당한 동물간에 최대 30%까지 차이가 날 수 있습니다. 결과적으로, 뼈 다리 형성에 대한 임상적으로 유의한 효과를 검출하기 위해서는 여전히 많은 수의 동물이 통계적 타당성을 달성해야 합니다.
7,9,10,14 이전에 발표된 랫트 또는 토끼 성장판 손상 모델과 비교하여 여기에 설명된 마우스 모델에 대한 이점에는 사용된 동물의 수 감소, 비용 절감, 재현 가능한 뼈 막대 형성으로 인한 효율적인 복제 크기, 더 짧은 연구 시간 프레임 및 삼중 형질전환 마우스의 실시간 이미징으로 인한 보다 정확한 손상 배치가 포함됩니다. 자세히 논의되지는 않았지만 이 마우스 모델은 조직 공학 임플란트 또는 성장 인자를 전달하는 생체 재료를 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 이 쥐 방법의 주목할만한 한계는 치료 약물 또는 세포를 전달하는 데 사용되는 임플란트의 크기가 대략 0.5mm 직경의 구의 결함 부피로 제한된다는 것입니다. 더 큰 동물 모델만이 인간 환자에게 사용될 수 있는 테스트 물질의 양을 수용할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 생성된 bur 결함은 얇은 골절과 동일한 기하학적 구조가 아니므로 실제 인체 부상과 다릅니다. 그럼에도 불구하고 이 마우스 모델의 이점은 많으며 측면 접근 방식은 경골 장축을 따라 성장판 위 또는 아래에 맹목적으로 접근할 때 발생하는 관절 연골의 손상을 방지합니다. 이 방법론은 성장판 손상 연구의 상당한 도약을 나타내며 병리학을 조사하고 새로운 치료 전략을 평가하기 위한 상세하고 재현 가능한 방법을 제공합니다.

뼈성장판은 아동기와 청소년기에 장골의 종방향 성장에 중추적인 역할을 한다1. 긴 뼈의 끝에 위치한 성장판은 여러 구역으로 구성되어 있으며, 연골세포는 이 역동적인 성장 영역을 생성하고 유지하는 핵심 세포 구성 요소입니다. 성장판의 내연골 골화는 연골세포 증식, 비대, 세포자멸, 혈관 침범, 골전구세포 모집, 마지막으로 뼈 형성의 순차적인 진행을 통해 뼈를 늘리고 확장하는 것으로 발생한다2. 성장판은 뼈보다 상대적으로 부드럽기 때문에 스포츠나 기타 활동 중에 뼈에 과부하가 걸리면 골절에 매우 취약합니다. Salter-Harris 분류는 성장판 손상의 5가지 유형을 간략하게 설명합니다3. 성장판의 비후대와 인접한 하부 뼈 조직을 통한 II형 골절이 가장 흔하다4. 뼈 다리는 종종 비후대 또는 인접한 뼈의 손상에 대한 반응으로 형성되며, 인접한 긴 뼈 부분의 조기 융합을 유도한다5. 뼈 다리는 성장판의 정상적인 확장을 방해합니다. 현재로서는 골다리 형성에 대한 예방적 치료법이 없으며, 환자의 연령과 골다리 크기 및 위치에 따라 일부 치료가 이루어지지 않고 방치되고 있다6. 사지 기형이 심한 경우 수술 방법에는 제거 후 지방 또는 실리콘 고무와 같은 삽입 재료를 이식하거나 교정 절골술 및 뼈 연장 절차가 포함됩니다. 그러나 뼈가 굳은 다리는 여전히 개혁 될 수 있습니다6. 뼈 다리 형성을 예방하고 뼈 성장판 손상이 있는 어린이의 결과를 개선하기 위해서는 더 많은 연구가 필요합니다.
근본적인 메커니즘을 탐구하고 부상 후 성장판의 뼈 다리 손상을 예방하기 위한 새로운 전략을 개발하기 위해 여러 동물 모델이 확립되었습니다 7,8,9,10,11,12. 이러한 동물 모델은 근위 경골 성장판과 원위 대퇴골 성장판에 초점을 맞추는 경우가 많은데, 이는 일반적으로 인간의 부상이 발생하는 곳이라는 점을 감안할 때 주요 손상 부위입니다. 동물의 뼈 결손은 실제 골절 경로와 유사한 측면 접근 방식 또는 성장판의 중앙 드릴 구멍으로 이어지는 성장판 위 또는 아래에서 접근하는 방식으로 생성됩니다. 이전에 보고된 랫트 모델에서, 성장판 결손은 경골 중축의 피질 창을 통해 치아 버를 삽입하고 골수를 통해 무릎 관절을 향해 위쪽으로 드릴링하여 성장판 7,13을 중앙에 손상시킴으로써 생성된다. 대안적으로, 최근의 마우스 모델은 소구경 바늘을 이용한 측면 접근법을 사용하여 성장 플레이트(8)를 관통하는 평면 바늘 트랙을 생성한다. 널리 사용되는 랫트 모델에서, 결손은 과두(9,14) 사이의 관절 연골을 뚫음으로써 원위 대퇴골의 성장판에서 생성됩니다. 토끼와 양과 같은 더 큰 동물에서, 성장판 결손은 근위 경골과 원위 대퇴골에서 직접 측면으로 유도되었으며, 성장판에 구멍을 뚫거나 절단하거나 아래에서 접근하여 성장판의 가장자리를 변경하지 않고 중앙 결손을 생성함으로써 유발되었습니다 10,11,12,15.
성장판 손상에 대한 쥐 모델은 줄기세포 계통 추적 연구와 같은 유전자 변형 마우스로 수행할 수 있는 기계론적 연구에 유리하다8. 그러나 쥐 또는 쥐 동물 모델에서 중요한 과제는 성장판의 특정 하위 영역에 일관되고 정확한 손상을 입히는 것입니다. 성장판과 인접 뼈의 특정 부위의 손상은 Salter-Harris 분류에 의해 설명된 임상적으로 관련된 골절 경로 중 하나를 모방해야 합니다. 설치류 모델에서 현재까지의 도전은 주로 부상의 외과적 생성 중에 성장판의 하층을 식별할 수 있는 시각적 수단이 없기 때문입니다. 이 프로토콜은 콜라겐 I, II 및 X 형광 리포터(16,17,18)를 발현하는 삼중 형질전환 마우스를 활용하여 쥐 성장판의 표적 하층에서 성장판 결손을 생성하기 위한 정제된 기술을 설명합니다. 성장판의 각 1차 영역에서 이러한 콜라겐의 다양한 색상의 형광은 성장판 손상의 외과적 생성 중에 형광 실체 현미경으로 성장판의 다양한 부분을 시각적으로 구별할 수 있습니다. 이러한 형질전환 마우스의 사용은 부상당한 아이들과 유사한 발달 단계에 있는 어린 마우스에서 전례 없는 손상 정확도를 허용합니다.

<table><tbody><tr><td>2-메틸 부탄</td><td>시그마 Aldrich</td><td>M32631</td><td></td></tr><tr><td>알코올 소독 패드</td><td>Acme United Corporation</td><td>H305-200</td><td></td></tr><tr><td>Axio Scan.Z1</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>Axio Scan.Z1</td><td></td></tr><tr><td>AxioVision 소프트웨어</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>베타딘 용액(10% 포비돈-요오드)</td><td>Avrio Health L.P.</td><td>67618-150-01</td><td></td></tr><tr><td>칼세인</td><td>시그마 알드리치</td><td>C0875</td><td></td></tr><tr><td>칼세인 블루</td><td>시그마 알드리치</td><td>M1255</td><td></td></tr><tr><td>CFP 필터 세트</td><td>크로마 테크놀로지 코퍼</td>레이션<td>49001</td><td></td></tr><tr><td>크라이오매트릭스</td><td>써모 사이언티픽</td><td>6769006</td><td></td></tr> 크라이오<tr><td>몰드</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>Fisherbrand #22-363-554</td><td></td></tr><tr><td>크라이오스타트</td><td>라이카 바이오시스템</td><td>즈 3050s</td><td></td></tr><tr><td>크라이오스태트 블레이드</td><td>Thermo Scientific</td><td>3051835</td><td></td></tr><tr><td>크라이오테이프</td><td>섹션 랩</td><td>크라이오필름 2C</td><td></td></tr><tr><td>곡선 미세사 가위&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>14061-11</td><td></td></tr><tr><td>곡선 모기 지혈 집게</td><td>HuFriedyGroup</td><td>H3</td><td></td></tr><tr><td>cy5 필터 세트</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49009</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62247</td><td></td></tr><tr><td>DAPI 필터 세트</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49000</td><td></td></tr><tr><td>치과 버 (직경 0.5 mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>치과 클리오이드 원반형 조각가</td><td>ACE Surgical Supply Inc.</td><td>6200097A-EA</td><td></td></tr><tr><td>건식 유리 구슬 살균기(Inotech Steri 350)</td><td>Inotech Bioscience, LLC</td><td>IS-250</td><td></td></tr><tr><td>귀 펀치</td><td>Fine Science Tools</td><td>24212-01</td><td></td></tr><tr><td>전기 가열 패드</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>전자 풋 컨트롤</td><td>Nouvag AG</td><td>1866nou</td><td></td></tr><tr><td>전자 모터 31 ESS</td><td>Nouvag AG</td><td>2063nou</td><td></td></tr><tr><td>환경 표면 장벽 (3 x 12 인치 튜브 sox)</td> <td>Patterson Companies, Inc.</td><td>BB-0312H</td><td></td></tr><tr><td>에탄올(70%)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, Ethiqa XR(부프레노르핀 서방형 주사 현탁액) 1.3mg/mL</td>, <td>Fidelis Animal Health</td><td>86084-100-30</td><td></td></tr><tr><td>Faxitron X-ray 캐비닛</td><td>Kubtech Scientific</td><td>Parameter</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence Stereomicroscope</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>Lumar V12</td><td></td></tr><tr><td>GFP 필터 세트</td><td>Chroma 테크놀러지 코퍼레이션</td><td>49020</td><td></td></tr><tr><td>빙초산</td><td>Sigma Aldrich</td><td>ARK2183</td><td></td></tr><tr><td>유리 현미경 슬라이드</td><td>Thermo Scientific</td><td>3051</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Graefe 겸자</td><td>Fine Science Tools</td><td>11051-10</td><td></td></tr><tr><td>핸드피스(콘트라 각도 32:1 푸시 버튼)</td><td>Nouvag AG</td><td>5201</td><td></td></tr><tr><td>임플란트학/구강 외과 시스템 제어 장치 (Straumann)</td><td>Nouvag AG</td><td>SEM&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>이중 내부/외부 공정 지시자 (3 1/2 x 5 1/4&nbsp; 인치)가 있는 즉시 밀봉 살균 파우치</td> <td>Fisher Scientific</td><td>01-812-50</td><td></td></tr><tr><td>이중 내부/외부 공정 지시자 (5 4/1 x 10 인치)가 있는 즉시 밀봉 살균 파우치</td> <td>Fisher Scientific</td><td>01-812-54</td><td></td></tr><tr><td>인슐린 주사기 (29 G)</td><td>Exel International</td><td>26028</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane& 주의;</td><td>Dechra Pharmaceuticals plc</td><td>17033-091-25</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane 마취 시스템</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mCherry 필터 세트</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>39010</td><td></td></tr><tr><td>미세 해부 가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>바늘(20G)</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>305178</td><td></td></tr><tr><td>바늘 홀더</td><td>HuFriedyGroup</td><td>NHCW</td><td></td></tr><tr><td>중성 완충 포르말린(10%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>비멸균 애플리케이터 면봉</td><td>Allegro Industries</td><td>205</td><td></td></tr><tr><td>부직포 거즈(3 x 3인치)</td><td>Fisher Scientific</td><td>22028560</td><td></td></tr><tr><td>Norland Optical Adhesive, 61</td><td>Norland Optical</td><td>Optics, 61</td><td></td></tr><tr><td>Ophthalmic ointment (Optixcare eye lube)CLC</td> <td>Medica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5368</td><td></td></tr><tr><td>치주 프로브</td><td>HuFriedyGroup</td><td>PQW</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS) pH 7.4 (1x)</td><td>Gibco, by Life</td><td>Technologies 10-010-023</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 현미경 슬라이드</td><td>전자 현미경 과학</td><td>71890-01</td><td></td></tr><tr><td>전문 클리퍼/트리머(Wahl Classic Peanut)</td><td>Wahl Clipper Corporation</td><td>8685</td><td></td></tr><tr><td>롤러</td><td>전자 현미경 과학</td><td>62800-46</td><td></td></tr><tr><td>Scanco 의료 소프트웨어</td><td>SCANCO Medical</td><td>Scanco &mu; CT 50</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 아세테이트 무수</td><td>시그마 알드리치</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 아질산염</td><td>시그마 알드리치</td><td>S2252</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 주석산염 이염기성 이수화물</td><td>시그마 알드리치</td><td>T6521</td><td></td></tr><tr><td>표본 디스크</td><td>라이카 바이오시스템</td><td>즈 14037008587</td><td></td></tr><tr><td>스테인레스 스틸 #15 수술용 칼날&nbsp;</td><td>아스펜 수술 제품, Inc.</td><td></td><td></td>371615</tr><tr><td>멸균 수술용 장갑</td><td>Cardinal Health, Inc.</td><td>2D72PT65X</td><td></td></tr><tr><td>멸균 타월 드레이프(18 x 26인치)</td><td>IMCO</td><td>4410-IMC</td><td></td></tr><tr><td>자당</td><td>시그마 Aldrich</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>주사기(1mL)</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>염색되지 않은 꼰 코팅 비크릴 봉합사(5-0)</td><td>Ethicon Inc.</td><td>J490G</td><td></td></tr><tr><td>UV 블랙 라이트</td><td>제너럴 일렉트릭</td><td>F15T8-BLB</td><td></td></tr></tbody></table>

성장판 손상을 연구하기 위한 tricolor transgenic murine 모델

Tricolor Transgenic Murine Model for Studying Growth Plate Injury

어린이의 뼈에 있는 연골 성장판은 사지를 늘릴 수 있지만 뼈에 비해 약하기 때문에 뼈에 과부하가 걸리면 골절되기 쉽습니다. 심하게 골절된 성장판에 대한 더 나은 치료가 필요한데, 부상에 대한 반응은 성장판을 조기에 융합시키는 뼈 다리와 같아서 발육이 부진하거나 구부러진 팔다리를 유발하기 때문입니다. 성장판 손상의 쥐 모델은 기계론적 연구에 유리하지만, 어린 쥐의 작은 성장판을 시각화하고 정확하게 손상시키기 어렵기 때문에 까다롭습니다. 여기에서는 콜라겐 유형 I, II 및 X에 대한 tri-lineage 형광 리포터와 함께 형질전환 마우스를 사용하여 개선된 성장판 손상 모델을 설명합니다.
이 마우스는 성장판의 3가지 주요 하부층과 관련된 기본 형광을 보여줍니다. Salter-Harris Type II 손상과 유사한 성장판 손상은 형광 실체 현미경 유도 하에 실시간 이미징 중에 성장 플레이트의 비대 부분을 기준으로 사용하는 bur로 재현성 있게 생성됩니다. 네이티브 형광의 동결 조직학 분석은 손상에 대한 세포 반응을 평가하는 것을 단순화합니다. 이 방법론은 성장판 손상 연구의 상당한 도약을 나타내며 병리학을 조사하고 새로운 치료 전략을 평가하기 위한 상세하고 재현 가능한 방법을 제공합니다.

이 프로토콜은 삼계통 형광 리포터 마우스를 사용하여 수술 지도를 위해 X형 콜라겐에서 방출되는 고유한 적색 형광을 활용하여 근위 경골의 측면 성장판 결손을 정밀하게 유도합니다. 외과의가 mCherry 필터 세트가 있는 실체현미경 접안렌즈를 통해 보는 동안 보이는 모습은 그림 2D에 나와 있습니다. 기본 X형 형광을 통해 외과의는 bur를 비대 영역에 배치하고 뼈 브리지로 이어지는 일반적인 유형의 성장판 손상을 모방한 부상을 생성할 수 있습니다(그림 2F). 적색 채널 아래의 형광이 가장 밝으므로 bur 배치 중에 사용하는 것이 좋습니다. 대안적으로, 실험의 목표가 비대 영역 및 인접한 석회화 영역보다 성장판의 다른 영역에 대한 손상을 연구하는 것이라면, 삼중 형질전환 마우스의 기본 형광의 다른 색상을 사용하여 결함 생성을 유도할 수 있습니다.
0.5mm 직경의 치과용 버를 사용하여 성장판의 비후대와 인접한 하부 뼈 조직에서 Salter-Harris Type II와 같은 결손의 생성은 N = 3 마우스의 손상되지 않은 측면 대조군과 비교하여 손상된(시간 0) 근위 경골의 microCT 및 냉동 조직학 이미징을 통해 검증되었습니다(그림 4). 결함은 3D microCT 이미지에서는 보기 어려웠지만 2D 단면에서는 감지할 수 있었습니다(그림 3A,B,E,F). 그림 3G는 I형 콜라겐 생성 뼈 세포(녹색 형광), II형 콜라겐 생성 증식성 연골세포(청록색 형광) 및 X형 콜라겐 생성 비대성 연골세포의 분포를 보여줍니다. 부상당한 쥐의 이미지(그림 4G)에서는 비대대(hypertrophic zone), 잠정적으로 석회화된 층, 그리고 증식 영역(proliferative zone)이 약간만 흐트러진 대조군에 비해 가장 최근에 형성된 뼈 중 일부가 파괴되어 있습니다. Safranin O/Fast Green 염색(그림 4H)은 모든 세포가 명확하게 보이기 때문에 손상된 성장판 내 결손의 위치를 가장 잘 보여줍니다.
X선 분석은 이러한 유형의 성장판 손상이 시간이 지남에 따라 경골 길이와 뼈 다리 형성에 미치는 영향에 대해 살아있는 쥐에 대한 통찰력을 제공합니다(그림 3). 수술 전과 수술 후 3주 동안 촬영한 비손상(그림 3A)과 부상(그림 3B) 경골을 비교 촬영한 결과, 사지 성장이 많이 진행되고 성장판이 얇아지며 3주에 손상된 성장판 부위에 뚜렷한 불투명 영역이 나타나는 것을 볼 수 있습니다. 성장판 내의 이러한 불투명도는 손상되지 않은 상대 개체나 수술 전의 마우스에서는 나타나지 않습니다. 따라서 Faxitron은 뼈 다리의 형성 및 사지 길이의 변화와 같은 살아있는 쥐의 부상으로 인한 병리학적 변화를 관찰하는 한 가지 방법입니다.
절개된 뼈의 MicroCT 영상은 수술 3주 후 손상된 성장판 내의 뼈 다리 형성을 자세히 시각화합니다 (그림 5). 그림 5에 표시된 6마리의 서로 다른 부상 마우스의 이미지에서 볼 수 있듯이, 모든 마우스에서 일관된 뼈 다리 발달이 있습니다. Scanco Medical 소프트웨어를 사용하여 근위 경골 성장판의 각 섹션을 검토하고 선택 도구로 뼈 브리지의 면적을 묘사한 다음 (그림 5B) 전체 성장판 부피에 걸쳐 각 절편 영역을 통합하여 총 부피24를 얻어 뼈 브리지 부피를 계산했습니다. 이 방법으로 계산 된 골격 브리지 부피는 0.0761 mm3 ± 0.0246 (평균 ± 표준 편차, N = 6)이었습니다. 대부분의 뼈 다리는 측면 접근에도 불구하고 성장판의 중앙 근처에 형성되며, 이는 성장판의 중심뿐만 아니라 바깥쪽 가장자리를 다치게 합니다. 이러한 현상은 골주위(perichondrium)가 아닌 골수(bone marrow)의 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cells, MSCs)가 뼈 다리 형성을 담당한다는 사실에 기인할 수 있다25.
이러한 삼색 형질전환 마우스에서 손상된 성장판의 동결 조직학적 분석은 천연 콜라겐 형광에 의해 강화됩니다(그림 6). 이는 부상 부위에서 뼈 세포와 연골 세포의 복잡한 상호 작용을 보여줍니다. 그림 6J,K에 표시된 MicroCT 이미지는 임베딩 및 절편을 안내하기 위해 조직학 기술자에게 제공되었습니다. I형 콜라겐 생성 뼈 세포는 그림 6L,O,P(녹색 형광)에서 볼 수 있으며, II형 콜라겐 생성 증식 연골세포는 그림 6L,O,Q(청록색 형광)에서 볼 수 있습니다. X형 콜라겐 생성 비대성 연골세포는 그림 6L,O,R(적색 형광)에서 볼 수 있습니다. 이 다색 형광 접근법은 광물화된 조직을 배경으로 뼈 다리 영역 내에서 수술 후 연골 세포 분화를 자세히 검사할 수 있습니다. DAPI 염색을 사용하여 성장판 영역 내의 모든 세포 유형의 분포를 확인했습니다(그림 6M). Safranin O/Fast Green 염색은 손상된 성장판 내 연골과 뼈의 복합적이고 구조적인 조직을 보여줍니다(그림 6N). Cy5 필터 세트에서 이러한 염색된 부분을 이미징하면 골단골과 연골 사이의 계면에 있는 휴지 영역 세포가 눈에 띄게 밝아집니다.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66841/66841fig03.jpg"> 그림 3: 반대측 대조군과 손상된 쥐 경골의 X선 이미지. (A) 반대측 대조 경골의 X선 이미지는 생후 2주일 때 부상 직전과 생후 5주일 때 수술 후 3주에 촬영한 것으로, 이 기간 동안 발생하는 성장 정도를 보여줍니다. (B) (A)와 같은 시점에 동일한 마우스에서 손상된 경골. 경골 길이 측정에 사용되는 랜드마크는 근위 경골 머리의 정점에서 발목 관절의 경골 끝까지(빨간색 양두 화살표)입니다. 불투명한 뼈 브리지는 5주에 손상된 근위 경골 성장판에서 볼 수 있습니다. 축척 막대 = 5.00mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66841/66841fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66841/66841fig04.jpg"> 그림 4: Time Zero 반대측 대조군 및 손상된 마우스 근위 경골의 MicroCT 및 조직학적 이미지. (A,E) 및 (B,F)는 3D 및 횡방향 2D microCT 뷰를 나타내며 (E) 및 (F)에서 빨간색 화살표로 결함이 표시됩니다. (씨,지) 3개의 타고난 형광 층과 광물화된 조직 층을 병합한 복합 병합 cryo-histological image. 녹색 세포(Col3.6GFPtpz)는 I형 콜라겐 생성 뼈 세포, 청록색 세포(Col2A1GFPcyan)는 II형 콜라겐 생성 증식 연골 세포, 적혈구(Col10A1RFPchry)는 X형 콜라겐 생산 비대성 연골 세포입니다. (D,H) (C) 및 (G)와 동일한 영역의 Safranin O/Fast Green 염색. 축척 막대 = 1.0mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66841/66841fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66841/66841fig05.jpg"> 그림 5: 이 프로토콜에 의해 형성된 뼈 브리지의 MicroCT 이미지. (A,C,E,G,I,K) BUR 결손 생성 후 3주에 6마리의 다른 마우스의 근위 경골 성장판의 횡단 단면. (A)에서 빨간색 점선으로 윤곽선이 표시된 뼈 다리. (B,D,F,H,J,L) 세로 평면을 잘라낸 3D 재구성. (B)에서 빨간색 점선으로 윤곽선이 표시된 뼈 다리. 축척 막대 = 1.0mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66841/66841fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66841/66841fig06.jpg"> 그림 6: 뼈 다리 형성이 있는 반대측 대조군 및 손상된 마우스 근위 경골의 MicroCT 및 조직학적 이미지. (A,J) 및 (B,K)는 3D 및 횡방향 2D microCT 뷰를 나타내며, (J)와 (K)에서 뼈 브리지는 노란색 화살표로 표시됩니다. (씨,엘) 3개의 타고난 형광 층과 광물화된 조직 층을 병합한 복합 병합 cryo-histological image. 녹색 세포(Col3.6GFPtpz)는 I형 콜라겐 생성 뼈 세포, 청록색 세포(Col2A1GFPcyan)는 II형 콜라겐 생성 증식 연골 세포, 적혈구(Col10A1RFPchry)는 X형 콜라겐 생산 비대성 연골 세포입니다. 흰색 상자는 패널 F 와 O에 표시된 더 높은 배율을 나타냅니다. (D,M) 패널 C 와 L의 성장판 영역에서 염색되는 광물화된 조직. (E,N) cy5 형광으로 스캔한 (D) 및 (M)과 동일한 영역의 Safranin O/Fast Green 염색. (에프,오) 패널 C 와 L의 병합된 이미지에서 성장판 영역의 더 높은 배율. (지-나,P-R) 천연 형광의 개별 채널은 광물화된 조직 배경으로 표시됩니다. 스케일 바 = 1.0mm(A-E) 및 (J-N), = 250μm(F-I) 및 (O-R). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66841/66841fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 프로토콜은 청소년 뼈 성장판 손상에 대한 개선된 마우스 모델을 설명합니다. 성장판의 3개의 서로 다른 하층과 관련된 주요 매트릭스인 콜라겐 유형 I, II 및 X에 대한 삼계 형광 리포터가 있는 형질전환 마우스를 사용하여 현미경 아래의 기본 형광에 의해 손상 배치를 안내합니다.

성장판 손상을 연구하기 위한 Tricolor Transgenic Murine 모델

The cartilage growth plates in the bones of children enable limb lengthening but are weak relative to the bone, making them prone to fracturing when bones ...

tricolor-transgenic-murine-model-for-studying-growth-plate-injury

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

골절 치료에 뼈 전구 기능의 정량적 측정은 고해상도 시리얼 이미징 기술을 필요로한다. 여기에, 프로토콜은 이미지를 순차적으로 골절을 수리하는 과정에서 내생 골 형성 줄기 / 전구 세포의 이동, 증식과 분화를 정량화의 intravital 현미경과 osteo-혈통 추적을 사용하여 제공됩니다.

순차<em&gt; 생체 내</em&gt; 골절 치료시 골 형성 줄기 / 전구 세포의 이미징

동물 모델은 생물 의학 연구에서 심각한 뼈 손상을 모방하기 위해 자주 사용됩니다. 크기가 작기 때문에 생쥐에서 안정화된 뼈 병변을 확립하는 것은 대부분의 연구 그룹의 능력을 넘어섭니다. 여기에서는 마우스의 실험적 대퇴골 결함을 확인하고 분석하는 간단한 방법을 설명합니다.

마우스의 간단한 임계 크기의 대퇴 결함 모델

이 원고는 형질도입-이식 마우스 모델을 확립하는 데 사용되는 방법론에 대한 설명을 제공합니다. 골수 이식을 수행할 때 피해야 할 기술적 오류에 대한 자세한 설명이 제공됩니다. 높은 바이러스 역가, transfection/transduction 및 방사선 조사의 중요성에 대한 명확한 이해를 얻어야 합니다.

골수 증식 종양의 전달-이식 마우스 모델

우리는 배아 15일(E15) 쥐 중족골을 해부하고 배양하는 프로토콜을 제시합니다. 이 고도의 생리학적 체외골화 모델은 단층 또는 3D 배양의 세포보다 체내 상황에 더 가까운 조건을 제공하며 뼈 성장 및 발달을 조사하는 데 필수적인 도구입니다.

쥐 배아 중족골의 문화 : 연골 골화의 생리 학적 모델

여기, 선물이 혈관 형성에서 vivo에서 시각화 하는 프로토콜에 multiphoton 현미경 검사 법에 의해 3 차원 건설 기계에서 실시간. 유전자 변형된 건설 기계에서 신생 murine calvarial 중요 한 뼈 결함 모델에서 연구 했다. 더 많은 새로운 혈관 컨트롤에서 보다 처리 그룹에서 발견 했다.

Calvarial 중요 한 뼈 결함 수리 다 현미경 Vivo에서 유전자 변형 3D-PLGA/nHAp 비 계에 의해 신생 시각화

성장판은 종아리 성장이 일어나는 어린이의 긴 뼈에서 연골 부분입니다. 부상을 입으면 뼈 조직이 형성되어 성장을 저해 할 수 있습니다. 우리는 뼈 복구 조직으로 이어지는 성장 플레이트 손상의 쥐 모델을 설명하고, 복구 메커니즘 및 성장 플레이트 재생 전략에 대한 연구를 허용합니다.

쥐 경골 성장 플레이트 손상 모델 수리 메커니즘을 특성화하고 성장 플레이트 평가 재생 플레이트 전략

이 방법은 R26R-Confetti (Confetti) 마우스 모델을 사용하여 광물화된 조직을 연구하고 번식 전략에서 이미지 획득에 이르는 모든 단계를 포괄하는 방법을 설명합니다. 모든 연조직에 적용될 수 있는 일반적인 프로토콜과 광물화된 조직에 적용될 수 있는 변형된 프로토콜이 포함된다.

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쥐에 있는 Periosteal 골격 줄기 세포의 CCL5 유도된 이동의 실시간 화상 진찰

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쥐 골수 손상 모델에서 골수내 골화를 통한 출생 후 골형성을 연구하기 위한 개선된 방법론

배우세요 삼색 형광 트랜스제닉 마우스 모델을 이용한 성장판 손상 연구 방법을. 실시간 세포 반응 관찰과 뼈 다리 형성 방지를 위한 조직 공학 접근법을 탐색합니다.

성장판 손상을 연구하기 위한 Tricolor Transgenic Murine 모델

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