Name: 다세포 스페로이드의 생산 및 다중 파라미터 Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-09T13:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: 배우세요 다세포 스페로이드 형성 방법과 FLIM을 활용한 세포 대사 및 산소 분포 분석 기술입니다. 이 프로토콜은 3D 배양 모델의 재현성을 향상시키고 동물 실험 의존도를 줄이는 데 기여합니다.

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이 연구는 겐트 대학의 특별 연구 기금(BOF/STA/202009/003; BOF/IOP/2022/058), 연구 재단 플랑드르(FWO, I001922N) 및 유럽 연합, fliMAGIN3D-DN Horizon Europe-MSCA-DN No. 101073507.

FLIM 기반 대사 및 저산소증 분석을 위한 다세포 스페로이드 형성

공개할 것이 없습니다.

다세포 스페로이드는 종양 및 줄기세포 틈새 미세환경, 약물 발견 및 생체 제조를 위한 '조직 구성 요소' 개발 연구에서 선택되는 방법이 되고 있습니다. 스페로이드의 이질적인 내부 구조, 영양소의 기울기 및 산소화는 상대적으로 간단하고 접근하기 쉬운 환경에서 생체 내 조직 및 종양의 이를 모방할 수 있습니다. 더 많은 방법론적 투명성26,28 및 표준화71가 필요함에 따라, 이러한 프로토콜은 연구자들이 실시간 정량 형광 수명 이미징 현미경 실험에 가장 적합한 스페로이드 형성 방법을 선택하는 데 도움이 될 것으로 기대됩니다. 제시된 방법은 세포 염색 나노입자 센서와 고유 세포 자가형광을 활용하며, 이는 염색 세포 사멸과 쉽게 결합할 수 있습니다.
가장 중요한 단계는 스페로이드 형성 프로토콜에 있습니다. 따라서, 고처리량 ...

다세포 스페로이드는 세포의 자체 응집에 의해 얻어지고 구형을 나타내는 3D 조직 모델 그룹을 나타냅니다. 체외에서 세포-세포 및 세포-매트릭스 상호 작용을 모방하고 다수의 암 및 줄기 세포 유래 구조 내에서 3D 컨텍스트를 재현하는 데 널리 사용됩니다. 세포 부착을 줄이고 응집을 촉진하기 위해 몇 가지 기술이 사용됩니다. 여기에는 표면 장력1에 의존하는 행잉 드롭 방법이 포함됩니다. 초저 부착 플레이트, 마이크로 몰드 및 마이크로 웰과 같은 세포 부착 방지 방법 2,3; 음향 파동 기반 접근법4; 흐름 유도 응집 방법(스피너 플라스크, 생물 반응기 및 미세유체 장치)5; 자기 입자 보조 형성6 및 응집 촉진 합성 및 ECM 기반 매트릭스 및 스캐폴드의 사용 7,8,9.
암 연구, 개발 및 신약 요법의 검증에서 스페로이드는 영양분, 폐기물 및 O2 의 공간 확산 제한 구배를 요약 할 수있는 능력으로 인해 매력적인 모델이며, 종종 고형 종양10,11에 전형적인 괴사 코어의 형성으로 이어집니다. 이처럼 보다 신뢰할 수 있고 정교한 체외 모델은 동물 연구(대체, 환원 및 정제)의 3R 원칙에 따라 동물 모델의 광범위한 사용(미국 식품의약국(FDA) 현대화법 2.0,12)에 대한 필요성에 도전합니다. 암 외에도 스페로이드는 줄기 세포 연구에 응용되고 있습니다. 예를 들어, 만능줄기세포는 배아체(EB)를 형성할 수 있는 능력을 가지고 있으며, 이는 유도만능줄기세포(iPSC)를 신경 전구세포(neural precursor cells)13 또는 난소 과립세포(ovarian granulosa cells)13,14와 같이 환자로부터 직접 얻기 어려운 특수 세포 유형으로 분화하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, EB의 형성은 종종 더 복잡한 오가노이드 모델, 예를 들어 신경15, 망막16, 심장17, 간18, 위19 및 장 오가노이드20의 개발에서 첫 번째 단계입니다. 크기, 재현성, 처리량 및 다운스트림 응용 분야를 포함한 요소는 실험에 적합한 스페로이드 형성 방법을 선택할 때 고려해야 합니다.
3D 문화의 복잡성이 증가하면 2D 문화에 비해 변동성이 커질 수 있습니다. 영양 조성(21), 매체 증발(22), 점도(23), pH 조절(24), 스페로이드 형성 방법 및 배양 시간 (25,26)과 같은 요인은 다양한 형태, 크기, 생존도 및 다른 화학 저항 성(27,28)을 얻을 수 있습니다 . 최근 연구에 따르면 스페로이드 산소 구배가 항상 정적인 것은 아니며 형성 방법, 스페로이드 크기 및 세포외 점도에 의해 영향을 받아 스페로이드 이질성에 영향을 미친다는 것이 입증되었습니다29. 스페로이드에 대한 재현성 및 데이터 접근성을 개선하기 위해 MISpheroID 지식 기반이 개발되었으며26, 세포주, 배양 배지, 형성 방법 및 스페로이드 크기를 재현성 있는 결과를 위한 최소 정보로 식별합니다. 따라서 웰 크기(최대 스페로이드 크기 추정치 제공), 사용된 소모품, 준비 시간 및 스페로이드를 현미경 접시로 운반하지 않고 모니터링할 수 있는 가능성을 포함하여 여러 고처리량(SphericalPlate 5D, 실험실에서 제작한 마이크로몰드 및 마이크로티슈 몰드)과 저부착 방법(즉, Biofloat 및 Lipidure-coated 96-well plate, 스캐폴드가 없는 플레이트 및 스캐폴드 기반)에 대한 자세한 비교가 이루어졌습니다(그림 1 및 표 1). 후자는 장기 연구를 가능하게 하는 반면, 고처리량 방법으로 생산된 스페로이드는 종종 종말점 실험으로 이어집니다. 5DspheriPlate의 그리드를 제외한 모든 방법은 원치 않는 자가형광을 가져오지 않으므로 현미경 검사에서 직접 사용할 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66845/66845fig01.jpg"> 그림 1: 스페로이드 형성 방법 설명. 플레이트에 특허받은 마이크로웰을 통합한 SphericalPlate 5D와 같은 고처리량 방법, 실험실에서 생산한 마이크로몰드 및 마이크로티슈 몰드는 스탬프를 사용하여 아가로스(파란색)로 여러 마이크로웰을 만듭니다. Lipidure(Amsbio) 및 Biofloat(Sarstedt)와 같은 저부착 플레이트는 세포 표면 접착을 억제하고 세포 자기 응집을 촉진하는 비접착 코팅을 사용합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66845/66845fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>5D 스페리플레이트</td>
			<td>자체 생산 마이크로몰드</td>
			<td>미세조직</td>
			<td>낮은 부착 방법</td>
		</tr><tr><td>스페로이드/웰의 수</td>
			<td>750</td>
			<td>1589</td>
			<td>81</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>지름 웰</td>
			<td>90 마이크로미터</td>
			<td>400 마이크로미터</td>
			<td>800 마이크로미터</td>
			<td>1의 mm</td>
		</tr><tr><td>배양량</td>
			<td>1mL</td>
			<td>5mL</td>
			<td>1mL</td>
			<td>200 마이크로리터</td>
		</tr><tr><td>다른 소모품</td>
			<td>/</td>
			<td>3% 아가로스 7mL</td>
			<td>500μL의 2% 아가로스</td>
			<td>/ *</td>
		</tr><tr><td>준비 시간</td>
			<td>10분</td>
			<td>2시간 + 3일 미디어 적응</td>
			<td>0.5시간 + 15분 미디어 적응</td>
			<td>10–30분 + 1시간 건조</td>
		</tr><tr><td>모니터링</td>
			<td>예</td>
			<td>아니요**</td>
			<td>예</td>
			<td>예</td>
		</tr><tr><td>자가형광등</td>
			<td>예</td>
			<td>아니요</td>
			<td>아니요</td>
			<td>아니요</td>
		</tr><tr><td>재사용할 수 있는</td>
			<td>아니요</td>
			<td>예</td>
			<td>예</td>
			<td>아니요**</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">비용</td>
			<td rowspan="2">€€</td>
			<td rowspan="2">€</td>
			<td rowspan="2">€€€€</td>
			<td>€€€€: 코팅 및 재료</td>
		</tr><tr><td>€€: 상업용 96웰 플레이트</td>
		</tr><tr><td colspan="3">*일부 세포주는 소형 스페로이드를 형성하기 위해 ECM(즉, 2%–5% Matrigel)을 추가해야 합니다.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="5">**코팅은 고갈될 때까지 재사용할 수 있습니다. 그러나 각 플레이트는 소량의 매체를 소비하고 시간이 지남에 따라 먼지가 쌓일 수 있습니다. 필터 멸균은 정기적으로 필요합니다.</td>
		</tr></tbody></table>표 1: 다중 스페로이드 형성 방법 비교29. "모니터링": 현미경 접시로 옮길 필요 없이 스페로이드를 모니터링할 수 있는 기능. 0-50유로, 50-150유로, 150-500&gt;유로, 500유로
형광 현미경 검사를 사용하면 세포 사멸, 생존력, 증식, 대사, 점도 및 기계적 특성을 포함한 스페로이드 내의 주요 생물학적 측면을 직접 모니터링할 수 있습니다30. 형광 수명 이미징 현미경(FLIM)은 (미세) 환경(31,32,33,34) 내에서 형광 프로브 상호 작용을 연구하기 위한 추가적인 정량적 차원을 제공하여 서로 다른 방출 수명(35,36)에 따라 중첩 방출 스펙트럼을 해결할 수 있습니다 그리고 intrinsic cellular autofluorescence에 기반한 세포 대사를 조사합니다. 따라서 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트(NAD(P)H), 플라빈 모노뉴클레오티드(FMN), 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드(FAD), 프로토포르피린 IX 등과 같은 광범위한 세포 자가형광 화합물은 1광자 및 2광자 FLIM으로 측정할 수 있으며 포도당 이화작용, 산화적 인산화(OxPhos)의 고유한 '센서' 역할을 하며 세포 산화 환원 상태에 대한 일반적인 개요를 제공합니다. NAD(P)H는 유리 세포질 또는 단백질 결합 미토콘드리아 형태37,38에 존재합니다. 유사하게, FAD의 산화 된 상태는 자유 형태의 수명이 더 긴 형광성입니다. NAD(P)H 및 FAD 현미경은 일반적으로 시료 광손상을 방지하는 것을 목표로 하는 2광자 여기 FLIM을 사용합니다39. 스페로이드 또는 오가노이드 대사, 산소화, 증식 및 세포 생존율에 대한 보다 완전한 그림을 제공하기 위해 '광학 대사 이미징' FLIM을 염료 기반 프로브, 유전적으로 인코딩된 바이오센서, 인광 수명 이미징 현미경(PLIM) 및 비율계량 강도 기반 측정과 결합할 수 있습니다 29,30,31. 또한 FLIM은 Förster 공명 에너지 전달(FRET) 방법과 결합하여 수용체와 밀접하게 접촉할 때 공여체 형광단의 수명 변동을 측정하여 표적 도메인 33,40,41과 약물의 결합을 조사할 수 있습니다.
획득된 FLIM 이미지는 일반적으로 픽셀 단위로 수명을 계산하기 위해 분석됩니다. 현재 형광 수명을 얻기 위해 사용되는 최소 3가지 일반적인 전략이 있습니다: 반정량적 'fast FLIM'42('tau sense'43,44라고도 함), 1, 2 또는 3 지수 피팅을 사용하는 감쇠 곡선 피팅, 페이저 변환 및 페이저 플롯 분석을 통한 '피팅이 없는' 접근 방식입니다. 공급업체에 따라 제공된 소프트웨어(LAS X, Symphotime, SPCImage 등) 또는 오픈 소스 소프트웨어(예: FLIMfit45, FLIMJ46 또는 기타(47))를 사용하여 측정된 FLIM 데이터를 처리할 수 있습니다. 일반적으로 공급업체에서 제공하는 소프트웨어는 예비 데이터 분석에 유용하며, 오픈 소스 솔루션은 페이저 플롯 및 3D 시각화 등을 사용하여 보다 정확한 연구를 제공할 수 있습니다.
스페로이드를 연구하는 방법으로서 FLIM의 유용성과 매력에도 불구하고 사용할 수 있는 실험 프로토콜은 거의 없으며 FLIM과 관련된 성공적인 라이브 다중 파라메트릭 현미경 실험을 위해 가장 적합한 형성 방법을 선택하는 데 일반적으로 지식이 부족합니다. 여기에서는 일반적으로 사용되는 스페로이드 형성 프로토콜의 형태, 생존력 및 산소화를 기반으로 최근에 검증되고 특성화된 원적외선 및 근적외선(NIR) 산소 감지 나노센서(MMIR1)를 기반으로 자세히 비교합니다. 양이온성 나노입자는 두 개의 리포터 염료, 즉 기준 O2-민감하지 않은 aza-BODIPY(여기 650nm, 방출 675nm)와 NIR O2-민감성 메탈로포르피린, PtTPTBPF(여기 620nm, 방출 760nm)로 함침됩니다. MMIR1을 사용하면 세포 독성을 유발하지 않고 기존 형광 현미경(비율계량 분석 사용) 또는 인광 수명 현미경(PLIM)에서 산소 구배를 실시간으로 분석할 수 있으며 안정적인 신호, 장기 모니터링 및 다중화가 가능합니다25,29. 염료 또는 나노센서로 염색해야 하는 필요성, 스페로이드 처리량 또는 세포 유형에 따라 가장 적합한 형성 프로토콜을 선택할 수 있습니다. 스페로이드 생존력 및 산소화에 대한 연구는 암 및 줄기세포 유래 스페로이드 연구와 관련이 있기 때문에 제시된 프로토콜에는 이러한 모델에서 NAD(P)H-FLIM 및 FAD-FLIM의 예와 예상되는 일반적인 결과도 포함됩니다. 제시된 이미징 및 분석 파이프라인은 가장 인기 있는 시간 상관 단일 광자 계수 기반 FLIM 현미경 플랫폼을 대상으로 합니다.

<table><tbody><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>Sigma</td></tr><tr><td>10 mL 혈청학 피펫</td><td>VWR</td><td>612-3700</td>에서도 사용 가능 <td>Sarstedt, Corning, VWR 및 기타 회사에서도 유사한 제품을 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>12 웰 세포 배양 플레이트, 멸균</td><td>Greiner bio-one</td><td>665-180</td><td>Sarstedt, Corning 및 기타 회사에서도 유사한 제품을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>12웰 챔버 슬라이드, 탈착식</td><td>Ibidi</td><td>81201</td><td>Grace Bio-Labs, ThermoFisher Scientific 등에서도 사용 가능</td></tr><tr><td>15mL 원심분리기 튜브</td><td>Nerbe plus</td><td>02-502-3001</td><td>Sarstedt, Corning, VWR 및 기타 회사에서도 유사한 제품을 구입할 수 있습니다</td></tr><tr><td>. 3D 페트리 접시 마이크로몰드</td><td>마이크로티슈</td><td>Z764000-6EA</td><td></td></tr><tr><td>6웰 세포 배양 플레이트, 멸균</td><td>Greiner bio-one</td><td>657160</td><td>Sarstedt, Corning, VWR 및 기타 회사에서도 유사한 제품을 구입할 수 있습니다</td></tr><tr><td>70% 에탄올</td><td>ChemLab</td><td>CL02.0537.5000</td><td></td></tr><tr><td>Biofloat</td><td>Sarstedt</td><td>83.3925.400</td><td>스페로이드 형성을 위한 상용 코팅 96웰 플레이트</td></tr><tr><td>Calcein Green-AM</td><td>Tebubio</td><td>AS-89201</td><td>희석에 적용 1:1000</td></tr><tr><td>CellSens Dimension 소프트웨어</td><td>Olympus</td><td>버전 3</td><td></td></tr><tr><td>인간 태반의 콜라겐, 유형 IV</td><td>Sigma</td><td>C5533</td><td>0.07 mg/mL 콜라겐 및 0.03 mg/mL Poly-D-lysine 코팅 현미경 접시 제조용</td></tr><tr><td>Confocal FLIM 현미경</td><td>Leica Microsystems</td><td>N/A</td><td>Stellaris 8 Falcon 도립 현미경, 백색광 레이저, HyD X 검출기, 기후/T 제어 챔버(OkoLab), 25x/0.95W 대물</td></tr>렌즈 <tr><td>D(+)-포도당</td><td>Merck</td><td>8342</td><td>이미징 배지 준비를 위한 1M 원액, 1:100 준비(최종 농도 10mM)</td></tr><tr><td>Dulbecco의 변형된 독수리 배지(DMEM), 페놀 레드, 포도당, 피루베이트 및 글루타민이 없는</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5030-10X1L</td><td>이미징 배지</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum&nbsp;( FBS)</td><td>Gibco</td><td>10270-098</td><td>Sigma에서도 구할 수 있습니다. 사용하기 전에 열을 비활성화해야 합니다.</td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td> <td>Gibco</td><td>15630-080</td><td>이미징 배지 준비를위한 희석 1/100 (최종 농도 10 mM)</td></tr> <tr><td>인간 결장 암 세포 HCT116</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>버전 1.54f</td><td></td></tr><tr><td>Leica Application Suite X (LAS X)</td> <td>Leica Microsystems</td><td>버전 4.6.1.27508</td><td></td></tr><tr><td>L- 글루타민</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td>시그마에서도 사용할 수 있습니다. 1:100 희석액으로 도포합니다.</td></tr><tr><td>Lipidure-CM5206</td><td>Amsbio</td><td>AMS.52000034GB1G</td><td></td></tr><tr><td>McCoy's 5A, 1mM 피루브산나트륨 및 10mM HEPES</td><td>VWR</td><td>추가</td> 필요 <td>HCT116 세포용 표준 성장 배지</td></tr><tr><td>마이크로 패턴 3D 프린팅 PDMS 스탬프</td><td>N/A</td> N<td>/A</td><td>마이크로시스템 기술 센터 제공, 겐트 대학교</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Chemlab</td> <td>Jan Vanfleteren 교수CL00.1429.100</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer cout chamber</td><td>Fisher Scientific</td><td>15980396</td><td></td></tr><tr><td>O2 프로브: MMIR1</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>전체 특성화, 검증 및 일부 응용 프로그램은 다음에서 찾을 수 있습니다: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.12.11.571110 v1</td></tr><tr><td>PBS Fisher</td><td>scientific</td><td>Gibco18912014</td><td>PBS 정제를 500mL의 증류수에 용해시킵니다.</td></tr><tr><td>펜 연쇄상구균 :P에니실린 (10,000 U/mL) / 스트렙토마이신 (10,000 &mu; g/mL) 100x 용액</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Sigma에서도 사용할 수 있습니다. 1:100 희석액으로 도포합니다.</td></tr><tr><td>Poly-D-lysine</td><td>Sigma</td><td>P6407-5mg</td><td>0.07 mg/mL 콜라겐 및 0.03 mg/mL Poly-D-lysine 코팅 현미경 접시</td></tr><tr><td>Propidium</td><td>Iodide Sigma-Aldrich</td><td>25535-16-4</td><td>세포 사멸 염색 준비를 위해 1 &micro를 사용하십시오. 1시간 배양에서 g/mL</td></tr><tr><td>PVDF 주사기 필터 0.22 & 마이크로; m</td><td>Novolab</td><td>A35149</td><td>Sarstedt, Corning, VWR 및 기타 회사에서도 유사한 제품을 구입할 수</td></tr> 있습니다<tr><td>.피루브산 나트륨 (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td>이미징 배지 준비를 위한 희석 1/100 (최종 농도 1mM)</td></tr><tr><td>SphericalPlate 5D 24-well</td><td>Kugelmeiers</td><td>SP5D-24W</td><td></td></tr><tr><td>sterile petridish</td><td>Greiner bio-one</td><td>633181</td><td>Sarstedt, Corning, VWR 및 기타 회사에서도 유사한 제품을 구입할 수 있습니다</td></tr><tr><td>. 조직 배양 플라스크 (25 cm&sup2; )</td><td>VWR</td><td>734-2311</td><td>유사한 제품들도 Sarstedt, Corning, VWR 및 기타 회사들로부터 구할 수</td></tr> 있습니다<tr><td>. 조직 배양 플라스크 (75 cm&sup2;)</td><td>VWR</td><td>734-2313</td><td>Sarstedt, Corning, VWR 및 기타 회사에서도 유사한 제품을 구입할 수 있습니다</td></tr><tr><td>U-bottom 96-well plate</td><td>VWR</td><td>10062-900</td><td>Sarstedt, Corning, Greiner Bio-one 및 기타 회사에서도 유사한 제품을 사용할 수</td></tr> 있습니다 <tr><td>Ultrapure Agarose</td><td>Invitrogen (Life Technologies)</td><td>16500-500</td><td>아가로스 저융점(A-9414, Sigma), 일상적인 사용용 아가로스(A-9539, Sigma),</td></tr> <tr><td>광시야 형광 도립 현미경</td>, <td>Olympus</td><td>N/A</td><td>도립 형광 현미경 IX81, 전동 Z축 제어 기능, CoolLED pE4000(16채널, 365-770nm), ORCA-Flash4.0LT(Hamamatsu) cMOS 카메라, 유리 온난화 플레이트, Okolab, CellSens Dimension v.3 소프트웨어 및 공기 대물렌즈 4x/0.13 UPlanFLN 및 40x/0.6 LUCPlanFLN. (옵션, 고해상도 이미징용) 60x/1.0 LUMPLFLN 물</td></tr></tbody></table>

다세포 스페로이드의 생산 및 다중 파라미터 live cell fluorescence lifetime imaging microscopy (flim)

Production and Multi-Parameter Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) of Multicellular Spheroids

다세포 종양 스페로이드는 종양 미세환경을 재현하고, 약물 요법을 테스트 및 최적화하고, 3D 컨텍스트에서 바이오 및 나노 센서를 사용하기 위해 널리 사용되는 3D 조직 미세응집 모델입니다. 생산 용이성, 예측 가능한 크기, 성장, 관찰된 영양소 및 대사 산물 구배는 3D 틈새와 같은 세포 미세환경을 요약하는 데 중요합니다. 그러나 스페로이드 이질성과 생산 방법의 가변성은 전반적인 세포 대사, 생존력 및 약물 반응에 영향을 미칠 수 있습니다. 이로 인해 크기, 가변성, 생체 제조 요구 사항, 줄기 세포 및 암세포 생물학에서 체외 3D 조직 모델로 사용하는 요구 사항을 고려할 때 가장 적합한 방법론을 선택하기가 어렵습니다. 특히, 스페로이드 생산은 광학 대사 이미징, 형광 수명 이미징 현미경(FLIM), 나노 센서를 사용한 스페로이드 저산소증 모니터링 또는 생존력과 같은 정량적 라이브 현미경과의 호환성에 영향을 미칠 수 있습니다. 여기에는 여러 가지 기존의 스페로이드 형성 프로토콜이 제시되어 실시간 광시야, 공초점 및 이광자 현미경과의 호환성을 강조합니다. 다양한 유형의 암 및 줄기세포 스페로이드를 사용하는 다중 자가형광 FLIM을 사용한 후속 이미징에서 분석 파이프라인에 대한 후속 이미징도 제시됩니다.

적절한 스페로이드 형성 방법 선택 선택한 스페로이드 형성 방법은 스페로이드의 크기, 모양, 세포 밀도, 생존력 및 약물 민감성에 큰 영향을 미칠 수 있습니다(그림 2). 이전에는 여러 고처리량(SphericalPlate 5D, 실험실에서 만든 마이크로몰드 및 MicroTissue 몰드)과 '중간 처리량' 저부착(Biofloat 및 Lipidure-coated 96-well 플레이트) 방법의 효과를 스페로이드 생존력 및 산소화에 비교했습니다29.
여기에서 다양한 형성 방법으로 인해 초기 농도가 500개 세포/스페로이드로 동일하더라도 크기가 다른 스페로이드가 생성됩니다. low attachment 96 well plate에서 형성된 HCT116 스페로이드는 형성 후 5일 후 고처리량 방법에 비해 훨씬 더 컸습니다(<stro...

여기에서는 후속 다중 파라미터 라이브 셀 현미경을 수행하기 위한 다양한 다세포 스페로이드 형성 방법을 설명합니다. 형광 평생 이미징 현미경(FLIM), 세포 자가형광, 염색 염료 및 나노 입자를 사용하여 살아있는 3차원(3D) 암 및 줄기 세포 유래 스페로이드에서 세포 대사, 저산소증 및 세포 사멸을 분석하는 접근 방식을 시연합니다.

다세포 스페로이드의 생산 및 다중 파라미터 Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM)

Multicellular tumor spheroids are a popular 3D tissue microaggregate&#160;model for reproducing tumor microenvironment, testing and optimizing drug ...

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

형광 수명 이미징 (FLIM)는 이미지 환경과 특정 단백질과 생활 세포에있는 염료의 상호 작용에 핵심 기술로 부상하고있다. 형광 분자 rotors의 FLIM은 살아있는 세포의 점도 매핑 있습니다.

생활 세포의 분자 Rotors의 형광 수명 이미징

여기에 제시된 스페로이드 이미징 장치의 제조를 위한 프로토콜이 있습니다. 이 장치는 암 세포 스페로이드의 동적 또는 세로 형광 이미징을 가능하게합니다. 이 프로토콜은 또한 암세포 침입의 분석을 위한 간단한 화상 처리 절차를 제공합니다.

3D 스페로이드 모델에서 암세포 침입의 시간 해결 형광 화상 진찰 및 분석

이 프로토콜은 표준 형광 현미경 상에서 그들의 산소화 및 세포 사멸에 대한 다중 파라메트릭 분석을 사용하여 바이오프린팅을 위한 고처리량 스페로이드 생성을 기술한다. 이러한 접근법은 구상체 생존력을 제어하고 표준화를 수행하기 위해 적용될 수 있으며, 이는 3D 조직, 종양 미세환경 및 성공적인 (마이크로)조직 생물제작을 모델링하는데 중요하다.

다세포 구상체의 저렴한 산소 현미경 보조 생물 제조

라이브 셀 마이그레이션 연구에 대한 현미경 챔버의 접착제 및 가용성 그라디언트의 조립 방법이 설명되어 있습니다. 엔지니어링 환경 솔루션 기울기와 antifouling 표면과 접착제 트랙을 결합하기 때문에 하나가지도 단서의 상대적 중요성을 확인할 수 있습니다.

형광 현미경과 영상 셀 마이그레이션을위한 접착제 및 가용성식이 그라디언트를 만들기

이 프로토콜은 전반사 형광 현미경을 사용하여 살아있는 세포 표면의 단일 수용체를 시각화 및 추적하여 수용체 측면 이동성, 수용체 복합체의 크기를 분석하고 일시적인 수용체-수용체 상호 작용을 시각화하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 다른 막 단백질로 확장될 수 있습니다.

단일 분자 형광 현미경에 의한 수용체 역학의 고해상도 시공간 분석

원형질막 단백질과 지질의 공간 분포와 시간 역학은 생물학에서 뜨거운 주제입니다. 여기서 이 문제는 개념적으로 동일한 단일 입자 추적의 물리량을 제공하지만 작은 분자 레이블과 표준 현미경 설정을 사용하는 시공간 이미지 변동 분석을 통해 해결됩니다.

상용 현미경에서 라이브 세포막에 분자 확산 법률에 빠른 형광 이미징

살아있는 세포의 기계적 변형률에 대한 실시간 반응을 측정할 수 있도록 맞춤형 모터 구동 기계식 액추에이터를 사용하여 새로운 이미징 프로토콜이 개발되었습니다. 기계생물학과 관련된 이 시스템은 컨포칼 또는 원자력 현미경으로 거의 실시간 이미징을 허용하면서 최대 20%까지 균주를 적용할 수 있습니다.

기계 스트레치 동안 라이브 세포 이미징

신속 하 고 높은 해상도 허용 하는 고급 현미경, 고립 된 플라즈마 멤브레인와 주변 세포내 볼륨의 이미지를 제시 한다. 회전 디스크 및 총 내부 반사 형광 현미경 검사 법 한 설정의 통합 3.5까지 높은 수집 속도에서 라이브 이미징 실험을 허용 이미지 스택 당 s.

회전 디스크-총 내부 반사 형광 현미경 검사 법 고급 시각화에 의해 세포 접착 형성

우리는 세포 스페로이드를 재배 할 수있는 모터 구동 원심 미세 유체 장치를 제시합니다. 이 장치를 사용하여, 단일 또는 다중 세포 모형의 스페로이드는 높은 중력 조건 하에서 쉽게 cocultured 될 수 있었습니다.

다세포 3차원 스페로이드 생성을 위한 랩 온 어 CD 플랫폼

제시된 방법은 실리콘 고무에 내장된 3D 소프트 하이드로겔의 단종 스트레칭을 포함하면서 살아있는 공초점 현미경 검사를 허용합니다. 섬유 정렬뿐만 아니라 외부 및 내부 하이드로겔 균주의 특성화가 입증된다. 개발된 장치 및 프로토콜은 다양한 변형 정권에 대한 세포의 반응을 평가할 수 있다.

라이브 현미경 이미징 에서 3D 하이드로겔의 제어 변형

배우세요 다세포 스페로이드 형성 방법과 FLIM을 활용한 세포 대사 및 산소 분포 분석 기술입니다. 이 프로토콜은 3D 배양 모델의 재현성을 향상시키고 동물 실험 의존도를 줄이는 데 기여합니다.

다세포 스페로이드의 생산 및 다중 파라미터 Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM)

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