다세포 스페로이드의 생산 및 다중 파라미터 Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM)
2024년 8월 9일
여기에서는 후속 다중 파라미터 라이브 셀 현미경을 수행하기 위한 다양한 다세포 스페로이드 형성 방법을 설명합니다. 형광 평생 이미징 현미경(FLIM), 세포 자가형광, 염색 염료 및 나노 입자를 사용하여 살아있는 3차원(3D) 암 및 줄기 세포 유래 스페로이드에서 세포 대사, 저산소증 및 세포 사멸을 분석하는 접근 방식을 시연합니다.
본 연구에서는 생세포 현미경을 이용하여 세포 대사 및 산소 분포를 분석할 수 있는 스페로이드 형성 방법을 제시하고 비교합니다. 최근 몇 년 동안 형광 수명 이미징 현미경은 살아있는 세포에서 NADPH 및 FAD와 같은 대사 바이오마커를 조사하는 데 광범위하게 사용되었으며, 세포 및 조직 산소화의 이미징과 함께 이러한 측정을 다중화하기 위해 여러 형광 나노입자가 개발되었습니다. 다세포 스페로이드, 오가노이드 및 장기 칩(organ-on-a-chip)은 복잡한 생체 내 미세환경을 복제할 수 있어 동물 연구의 필요성을 최소화할 수 있습니다.
스페로이드 생산을 위해 우리는 다양한 형성 방법을 보여주며 낮은 처리량에서 높은 처리량에 이르기까지 다양할 수 있습니다. 또한 광학 접근성, 형광 수명 이미징 현미경과의 호환성, 세포외 기질 구성 요소를 포함할 수 있는 가능성을 강조합니다. 따라서 3D in vitro 모델이 2D 배양에 비해 더 나은 컨텍스트를 제공하더라도 높은 변동성, 낮은 재현성 및 불완전한 실험 보고가 여전히 문제로 남아 있습니다.
스페로이드 크기, 영양소 조성, 세포외 점도, 심지어 스페로이드 형성 방법과 같은 매개변수는 모두 세포 이질성을 증가시킬 수 있습니다. 이 프로토콜을 통해 우리는 스페로이드 생산 방법을 조화시키고 표준화하는 것을 목표로 하며, FLIM 현미경을 사용하여 스페로이드의 연속 및 다중 파라미터 분석에 중요한 핵심 측면을 강조합니다.
개요
이 기사는 생체 현미경을 사용하여 세포 대사와 산소 분포를 분석하기 위해 다세포 구형체를 형성하는 다양한 방법을 제시합니다. 이 연구는 생체 세포에서 대사 바이오마커를 조사하기 위해 형광 수명 영상 현미경(FLIM)의 사용을 강조합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 세포 생물학
- 생체 현미경 이미징
배경
- 다세포 구형체와 오르가노이드는 체내와 유사한 미세환경을 복제합니다.
- 형광 수명 영상 현미경은 대사 바이오마커를 연구하는 데 사용됩니다.
- 3D 체외 모델의 주요 과제는 높은 변동성과 낮은 재현성입니다.
- 다양한 용도에 따라 다른 구형체 형성 방법을 사용할 수 있습니다.
연구 목적
- 생체 현미경을 위한 구형체 형성 방법을 비교합니다.
- 3D 모델에서 세포 대사, 저산소증 및 세포 사멸을 분석합니다.
- 다세포 시스템에서의 산소 분포에 대한 이해를 향상시킵니다.
사용된 방법
- 형광 수명 영상 현미경(FLIM)
- 세포 자가 형광 분석
- 염색 염료 및 형광 나노 입자의 사용
- 다양한 구형체 형성 기술
주요 결과
- 3D 구형체에서 세포 대사를 분석하는 방법을 시연했습니다.
- 대사 연구를 위한 구형체의 FLIM 호환성을 보여주었습니다.
- 구형체 형성에서 세포외 기질 성분의 중요성을 강조했습니다.
- 3D 배양의 재현성 및 변동성 문제를 다루었습니다.
결론
- 다양한 구형체 형성 방법은 생체 현미경 분석을 향상시킬 수 있습니다.
- FLIM은 3D 모델에서의 대사 과정에 대한 귀중한 통찰을 제공합니다.
- 이러한 방법의 지속적인 개발은 동물 모델에 대한 의존성을 줄일 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Standardized production and multi-parameter FLIM analysis of multicellular spheroids address critical challenges in modeling tumor microenvironments for drug discovery. Harmonizing spheroid formation and live-cell imaging workflows enhances predictive confidence in metabolic and hypoxia-related readouts, supporting robust early-stage decision-making. This approach strengthens translational continuity and reduces biological risk across oncology and stem cell R&D portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of metabolic pathways and oxygen gradients in physiologically relevant 3D models.
- Supports functional target validation by quantifying NADPH and FAD biomarkers in live spheroids.
- Facilitates biological de-risking through multiplexed metabolic and hypoxia measurements.
- Improves predictive confidence for target engagement and pathway modulation in complex systems.
Screening & Assay Development
- Prepares reproducible 3D spheroid models compatible with widefield, confocal, and two-photon FLIM platforms.
- Standardizes assay conditions to reduce variability and enhance quantitative output reliability.
- Enables scalable, high-throughput screening of compound effects on cell metabolism and viability.
- Supports robust evaluation of bio- and nanosensor integration for multiplexed readouts.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro metabolic and hypoxia profiles with disease-relevant tumor microenvironments.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by minimizing animal model reliance.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on quantitative, multiparametric data.
- Facilitates translational biomarker development using live-cell FLIM outputs.
Pipeline & Workflow Integration
This harmonized workflow integrates from early discovery through lead identification and preclinical validation, leveraging standardized spheroid production and FLIM analytics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification in 3D, in vivo-like contexts.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative metabolic and hypoxia readouts for compound triage.
- Analytics: Provides multiplexed fluorescence lifetime measurements for robust condition comparison.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical models by recapitulating tumor microenvironment features.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for diverse oncology and stem cell R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in 3D model systems.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of live-cell imaging workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust, quantitative data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of candidates with validated biological relevance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in 3D cell culture, live-cell microscopy, and FLIM analytics.
- Demands access to widefield, confocal, or two-photon FLIM instrumentation and compatible analysis software.
- Necessitates cross-team standardization of spheroid production and imaging protocols.
- May require adaptation for different cell types, extracellular matrices, or sensor integration.
- Variability in spheroid size and composition can impact reproducibility and data interpretation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:51
High‐Throughput Generation of Multicellular Spheroids from Human Cancer Cell Line for Live 3D Imaging
4:15
Assessing the Impact of Spheroid Formation Methods in 3D Cell Culture Systems Using Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM)
