Name: 베이커의 미토콘드리아 변환 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-07T14:35:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: 배우세요 효모 미토콘드리아 변환 프로토콜을 통해 산화적 인산화에 필수적인 단백질 합성 조절과 내막 조립 메커니즘을 연구하는 방법을 Saccharomyces cerevisiae 모델로 알아보세요.

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이 출판물은 Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT), UNAM [IN223623 to XP-M]의 지원을 받았습니다. UPD는 CONAHCYT 펠로우(CVU:883299)입니다. 광학 현미경 이미지에 대한 기술적 도움을 주신 Ariann Mendoza-Martínez 박사님께 감사드립니다. Biorender 라이선스: DU26OMVLUU(그림 2); BK26TH9GXH(그림 3); GD26TH80R5(그림 4); PU26THARYD(그림 7); ML26THAIFG(그림 9).

참고: 미토콘드리아 변환 효율은 일반적으로 낮기 때문에 각 구조에 대해 6개의 변환을 수행하는 것이 좋습니다. 상이한 성장 매체의 조성은 표 2에 나타내어져 있다.
1. 텅스텐 입자 제조
<ol><li>마이크로튜브에서 0.7μm 텅스텐 입자(WP, 마이크로캐리어) 30mg을 칭량합니다. 1.5% 에탄올(EtOH) 70mL를 첨가하여 살균합니다. WP를 소용돌이치게 하고 실온에서 10분 동안 그대로 둡니다.</li>
	<li>실온에서 13,200 x g 에서 15분 동안 원심분리합니다. 입자에 1.5mL의 멸균수를 첨가하고 소용돌이치게 한 다음 실온에서 13,200× g 에서 15분 동안 원심분리하여 WP를 세척합니다. 상층액을 버립니다.</li>
	<li>500μL의 멸균 50% 글리세롤을 추가합니다(최종 농도는 WPs/μL 60μg). 알림: WP는 -20 °C에서 최소 6개월 동안 보관할 수 있습니다. 이 스톡에서 6 회 변형에 필요한 양 (100 μL)을 취하십시오.</li>
</ol>2. WPs DNA 코팅
<ol><li>미토콘드리아 서열을 포함하는 2 μ plasmid 5 μg과 박테리아 plasmid 15 μg을 얼음 위의 마이크로튜브에 추가합니다. 참고: DNA 코팅에 필요한 시약을 더 희석하지 않도록 최종 부피는 50μL를 초과해서는 안 됩니다.</li>
	<li>100μL의 WP 현탁액과 5초 동안 와류를 추가합니다(WP 6mg).</li>
	<li>1M 스퍼미딘 4μL를 추가합니다. 간단히 말해서 소용돌이.</li>
	<li>100 μL의 얼음처럼 차가운 2.5 M CaCl2 를 넣고 잠시 와류를 넣으십시오. 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다. 3분마다 믹스를 짧게 소용돌이칩니다. 알림: CaCl2 용액은 필터 멸균 처리되어 있으며 고압멸균해서는 안 됩니다.</li>
	<li>4°C에서 13,200× g 의 WP를 30초 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다. -20°C에서 200μL의 100% EtOH에 입자를 부드럽게 재현탁하여 세척합니다.</li>
	<li>4°C에서 13,200× g 의 WP를 30초 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다. 세탁을 반복하십시오.</li>
	<li>피펫 팁을 사용하여 60-70 μL의 실온 100% EtOH에 WP를 재현탁시킵니다. 소용돌이치지 마십시오. 참고: 플라스미드의 품질을 보장하기 위해, DNA 코팅은 biolistic transformation과 같은 날에 수행되어야 합니다.</li>
</ol>3. 생물학적 재료 준비
<ol><li>폭격하기 전에 오토클레이브에서 6개의 마크로캐리어 홀더(그림 5)를 멸균하고 완전히 건조시킵니다. 또는 EtOH에 담그고 겸자를 사용하여 화염을 사용하여 살균합니다. 멸균 유리판에 놓습니다.</li>
	<li>DNA 침전 중(2.4단계에서 얼음 위에서 10분 배양) 멸균 겸자를 사용하여 6개의 마크로캐리어 홀더 각각에 6개의 마크로캐리어(또는 플라잉 디스크)를 삽입합니다. 알림: 매크로캐리어를 멸균하지 마십시오.</li>
	<li>DNA 코팅된 WP를 피펫과 혼합합니다. 각 매크로캐리어 표면에 10μL의 WP를 추가하고 피펫 팁으로 전체 표면에 분포시킵니다. 필요한 경우 100% EtOH의 몇 마이크로리터를 매크로캐리어 표면에 추가하여 WP가 고르게 퍼지도록 합니다. 현탁액을 실온에서 ~20분 동안 건조시키십시오.</li>
</ol>4. 효모 세포 및 충격판의 준비
<ol><li>YPR 배지 2mL에 rho0 수용체 균주를 접종합니다(표 2). 회전하는 바퀴에서 30 °C에서 하룻밤 동안 성장시킵니다.</li>
	<li>배양액 300μL를 신선한 YPR 배지 30mL에 희석합니다. 30 °C 및 200 rpm에서 로터리 셰이커로 2박 동안 배양액이 포화될 때까지 성장시킵니다.</li>
	<li>효모 세포를 600× g 에서 실온에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버리고 600μL의 YPD 배지에 효모 세포를 재현탁시킵니다(표 2).</li>
	<li>멸균 유리 손잡이를 사용하여 100μL의 효모 세포 현탁액을 고체 폭격 배지 플레이트에 펴 바릅니다. NOTE: bombardment medium에는 transformation에 사용될 2 μ plasmid의 selection marker가 없어야 합니다.</li>
	<li>다른 5개의 플레이트에 대해 4.4단계를 반복합니다.</li>
	<li>액체 매체가 플레이트 표면에 완전히 흡수되도록 충격하기 전에 실온에서 1-3시간 동안 배양합니다.</li>
</ol>5. 생물학적 형질전환에 의한 합성 rho-균주의 생성
알림: 시작하기 전에 생물학적 장비의 사용 설명서를 반드시 읽으십시오. 참조된 장비의 프로토콜에 대해 설명합니다(재료 표 및 그림 5).
<ol><li>오염을 방지하기 위해 70% 에탄올로 생물학적 입자 전달 시스템의 챔버를 청소하고 최소 10분 동안 그대로 두십시오. 폭격 직전에 깨끗한 종이 타월로 표면을 닦으십시오.</li>
	<li>헬륨 탱크 밸브를 열어 약 2,000psi를 설정합니다.</li>
	<li>장비의 전원을 켜고 진공 소스를 켭니다.</li>
	<li>집게를 사용하여 매크로캐리어를 매크로캐리어 홀더에 아래를 향하게 놓습니다. 알림: 장비와 함께 제공되는 정지 화면을 사용하지 마십시오.</li>
	<li>매크로캐리어 위에 매크로캐리어 뚜껑을 나사로 고정합니다. 모든 부품이 함께 마이크로캐리어 발사 시스템을 구성합니다(그림 5).</li>
	<li>마이크로캐리어 발사 시스템을 바닥에서 다섯 번째 레벨의 진공 챔버 내부에 놓습니다.</li>
	<li>rho0 변형 잔디를 포함하는 플레이트 중 하나를 챔버 바닥에서 두 번째 레벨에 놓습니다. 접시가 위를 향하고 뚜껑이 없는지 확인하십시오.</li>
	<li>멸균 겸자를 사용하여 고정 캡에 하나의 파열 디스크를 놓습니다. 가속 튜브의 고정 캡을 조입니다. 고정 캡이 꼭 맞는지 확인하십시오. 알림: 변형 효율이 감소하는 것을 관찰한 결과 설명서에서 제안한 대로 파열된 디스크를 이소프로판올로 처리하지 마십시오.</li>
	<li>진공 챔버의 문을 닫습니다.</li>
	<li>VAC/VENT/HOLD 스위치를 VAC 위치에 놓습니다. 25-28 inHg 진공에 도달하면 VAC/VENT/HOLD 스위치를 HOLD 위치로 변경합니다. 알림: 달성 가능한 진공은 해수면에 따라 달라질 수 있습니다. 우리는 25 inHg에 도달하는 데 성공했습니다.</li>
	<li>FIRE 스위치를 눌러 WP를 쏘십시오. 파열 디스크가 파손되어 팝 소리가 날 때 1,300psi에 도달할 때까지 가속 튜브에 압력이 형성될 때까지 기다립니다.</li>
	<li>파열 디스크가 파손된 직후 VAC/VENT/HOLD 스위치를 VENT 위치로 변경하여 FIRE 스위치와 진공을 해제합니다.</li>
	<li>멸균 겸자를 사용하여 플레이트 표면에 있는 파열 디스크의 파편을 조심스럽게 제거하고 플레이트를 뚜껑으로 덮습니다.</li>
	<li>나머지 5개의 플레이트에 대해 절차를 반복하여 각 라운드에 새 파열 디스크와 매크로캐리어를 배치합니다.</li>
	<li>마지막에 헬륨 탱크의 메인 밸브를 닫습니다.</li>
	<li>챔버를 닫고 VAC/VENT/HOLD 스위치를 VAC 위치로 가져와 진공을 만듭니다. FIRE 스위치를 몇 번 눌렀다 놓아 헬륨 압력에서 시스템을 해제합니다. 문을 연 상태에서 반복합니다.</li>
	<li>진공 펌프와 폭격 장비를 끕니다.</li>
	<li>70% EtOH로 전달 시스템을 청소합니다. 매크로캐리어 지지대를 0.1% SDS 용액으로 세척하십시오. 멸균 증류수와 100% EtOH로 헹굽니다.</li>
</ol>6. 합성 rho- 콜로니 선택
<ol><li>30 °C에서 5-7 박 동안 폭격 플레이트를 배양합니다. 알림: 플레이트에 오염이 있는지 매일 확인하는 것이 중요합니다. 필요한 경우 추가 오염을 방지하기 위해 멸균 주걱으로 오염된 부위를 잘라낼 수 있습니다.</li>
	<li>반대쪽 결합 유형의 테스터 균주를 밤새 YPD 배지 2mL에 접종합니다(그림 2D,E의 특정 예 참조).</li>
	<li>YPD 플레이트에 150μL의 테스터 균주 배양액을 접종합니다. 멸균 유리 손잡이를 사용하여 테스터를 플레이트 표면에 고르게 펴 바릅니다. 접시를 최소 5분 동안 건조시키십시오.</li>
	<li>벨벳 복제 패드와 복제기 스탬프를 사용하여 폭격판의 복제품을 만드십시오.<ol><li>형질전환된 2 μ plasmid auxotrophy marker에 해당하는 dropout medium plate에 복제합니다. 성장은 30 °C에서 한 번의 하룻밤 배양이 필요합니다. 그 후 4 °C에서 계속 사용할 때까지 보관하십시오. 이 플레이트가 마스터 플레이트입니다.</li>
		<li>6.3단계에서 테스터의 잔디밭이 포함된 YPD 플레이트에 복제합니다. 30°C에서 2박 동안 배양합니다. 그 후, 이 플레이트를 선택적 배지에 복제하여 관심 미토콘드리아 유전자(예: 호흡기 배지 또는 아르기닌이 결핍된 배지)의 존재를 검출하고 30°C에서 밤새 배양합니다. 미토콘드리아에 합성 박테리아 플라스미드를 품고 있는 세포만이 테스터 균주와 교배한 후 선택적 배지에서 자랍니다.</li>
	</ol></li>
	<li>마스터 플레이트(단계 6.4.1)에서 단계 6.4.2에서 성장한 해당 콜로니를 식별합니다. 알림: 폭격 플레이트(및 마스터 플레이트)는 변형 콜로니로 붐비기 때문에 테스터의 결합 플레이트에서 관찰된 양성 콜로니를 식별하기 어려울 수 있습니다. 이러한 이유로 영구 마커로 모든 판의 양쪽에 몇 개의 작은 선을 그리는 것이 좋습니다. 복제 스탬프의 링에 비슷한 선을 그립니다. 이 선은 마스터 플레이트에서 양극 콜로니의 방향을 지정하고 위치를 찾는 데 도움이 됩니다( 그림 2D의 예 참조).</li>
	<li>6.4.1단계에서와 같이 마스터 플레이트에서 두 번째 선택적 드롭아웃 플레이트로 줄무늬를 만들어 양극 콜로니를 정제합니다. 30 °C에서 2박 동안 배양합니다. 참고 : 줄무늬는 순수한 변형을 보장하기 위해 단일 식민지의 성장을 허용하는 것이 중요합니다.</li>
	<li>선택 과정(단계 6.2-6.5)을 반복하여 미토콘드리아에 박테리아 플라스미드가 있는지 확인합니다. 참고: 일반적으로 이 과정을 두 번 더 반복하여 안정적인 합성 rho-strain 을 선택할 수 있습니다.</li>
	<li>합성 rho-train 이 미토콘드리아에서 플라스미드 DNA를 안정적으로 유지하면 3-5개의 서로 다른 양성 콜로니를 선택하고 2mL의 YPD에 접종합니다. 이 배양액을 사용하여 cryovial stock을 준비하고(600μL의 배양액과 600μL의 50% 글리세롤을 혼합하여 -70°C에서 보존) 세포유도를 통해 플라스미드 염기서열을 관심 mtDNA에 삽입합니다(단계 6.7). 주의: 합성 rho-strain 으로부터 미토콘드리아에서 형질전환된 플라스미드를 유지하기 위한 선택적 압력이 없기 때문에, 플라스미드는 쉽게 손실될 수 있습니다. 따라서 가능한 한 빨리 세포 유도를 하는 것이 좋습니다.</li>
</ol>7. 세포유도에 의해 미토콘드리아 게놈의 표적 부위에 합성 rho-train에 존재하는 구조를 통합합니다.
<ol><li>두 개의 튜브에 3mL의 YPD 배지를 접종하는데, 하나는 공여 세포(합성 rho- 세포)로, 다른 하나는 수용체 세포(최종 구조가 예상되는 효모 세포)로 접종합니다. 30 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.</li>
	<li>750 μL의 donor 균주와 250 μL의 수용체 균주를 멸균 마이크로튜브(3:1 비율)에 혼합합니다.</li>
	<li>혼합물을 13,200 × g에서 1 분 동안 원심 분리하십시오. 상층액을 버리십시오. 끝이 잘린 1mL 피펫 팁을 사용하여 세포 펠릿 한 방울을 YPD 플레이트에 놓습니다. 30 °C에서 2-4 시간 동안 배양합니다. 알림: 교차 오염을 방지하려면 단일 플레이트에 두 개 이상의 셀 현탁액을 넣지 마십시오(예:그림 4A의 파일).</li>
	<li>소량의 세포 혼합물을 취하여 슬라이드의 15μL의 멸균수에 재현탁시키고 커버 슬립을 놓습니다. 광학 현미경으로 40x 또는 100x 대물렌즈로 shmoos가 있는지 확인하십시오. 이 특징적인 모양은 두 가지 결합 유형이 있을 때 나타납니다(그림 3B).</li>
	<li>shmoos가 존재하는 경우 2mL의 YPD 배지에 소량(~0.5mm3)의 세포 질량을 재현탁시킵니다. 회전하는 휠에서 30°C에서 2시간 동안 배양하여 이핵 접합체가 회복될 수 있도록 합니다.</li>
	<li>혼합물을 와류시키고 세포 현탁액 10μL를 멸균수 990μL에 희석합니다(1:100 희석). 유리 구슬 또는 멸균 유리 손잡이를 사용하여 수용체 균주(및 산발적인 이배체)만 성장하는 드롭아웃 배지에 세포 희석액 100μL를 펴 바릅니다. 30 °C에서 2-3 박 동안 배양합니다.</li>
	<li>서론에서 설명한 대로 생성된 콜로니를 필요한 선택적 매체에 복제합니다(4단계, 특정 예는 그림 4C 참조).</li>
	<li>양성 콜로니를 식별한 후 동일한 선택적 매체에 다시 스트리크하여 관심 mtDNA를 운반하는 반수체 균주를 정제합니다.</li>
	<li>두 개 이상의 양성 콜로니를 선택하고 30°C의 YPD 배지 2mL에서 밤새 성장시킵니다. 600μL의 50% 글리세롤과 600μL의 포화 YPD 배양물을 혼합하여 극저온 백업을 만듭니다. -70 °C에서 보관하십시오.</li>
	<li>생성 된 균주31,32의 DNA를 분리합니다. 미토콘드리아 돌연변이의 존재를 확인하기 위해 PCR과 염기서열로 원하는 영역을 증폭합니다. 참고: 각 양성 콜로니는 미토콘드리아 게놈에서 올바른 염기서열을 보장하기 위해 독립적으로 확인해야 하는 기술적 복제입니다.</li>
</ol>

돌연변이 유전 분석을 위한 효모 미토콘드리아의 생물학적 형질전환

<ol><li>Bonnefoy, N., Fox, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+mutated+initiation+codons+in+the+mitochondrial+COX2+gene+of+Saccharomyces+cerevisiae+fused+to+the+reporter+gene+ARG8m+reveals+lack+of+downstream+reinitiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Gen+Genet%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of mutated initiation codons in the mitochondrial COX2 gene of Saccharomyces cerevisiae fused to the reporter gene ARG8m reveals lack of downstream reinitiation.</a> Mol Gen Genet. 262 (6), 1036-1046 (2000).</li>
<li>Franco, L. V. R., Su, C. H., McStay, G. P., Yu, G. J., Tzagoloff, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cox2p+of+yeast+cytochrome+oxidase+assembles+as+a+stand-alone+subunit+with+the+Cox1p+and+Cox3p+modules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cox2p of yeast cytochrome oxidase assembles as a stand-alone subunit with the Cox1p and Cox3p modules.</a> J Biol Chem. 293 (43), 16899-16911 (2018).</li>
<li>Flores-Mireles, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytochrome+b+carboxyl+terminal+region+is+necessary+for+mitochondrial+complex+III+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci+Alliance%22%5BJournal%5D)">The cytochrome b carboxyl terminal region is necessary for mitochondrial complex III assembly.</a> Life Sci Alliance. 6 (7), (2023).</li>
<li>Rubalcava-Gracia, D., Vázquez-Acevedo, M., Funes, S., Pérez-Martínez, X., González-Halphen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+versus+nuclear+gene+expression+and+membrane+protein+assembly%3A+the+case+of+subunit+2+of+yeast+cytochrome%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial versus nuclear gene expression and membrane protein assembly: the case of subunit 2 of yeast cytochrome.</a> Mol Biol Cell. 29 (7), 820-833 (2018).</li>
<li>García-Villegas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cox1+C-terminal+domain+is+a+central+regulator+of+cytochrome+c+oxidase+biogenesis+in+yeast+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The Cox1 C-terminal domain is a central regulator of cytochrome c oxidase biogenesis in yeast mitochondria.</a> J Biol Chem. 292 (26), 10912-10925 (2017).</li>
<li>Rak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+cells+lacking+the+mitochondrial+gene+encoding+the+ATP+synthase+subunit+6+exhibit+a+selective+loss+of+complex+IV+and+unusual+mitochondrial+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Yeast cells lacking the mitochondrial gene encoding the ATP synthase subunit 6 exhibit a selective loss of complex IV and unusual mitochondrial morphology.</a> J Biol Chem. 282 (15), 10853-10864 (2007).</li>
<li>Perez-Martinez, X., Broadley, S. A., Fox, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mss51p+promotes+mitochondrial+Cox1p+synthesis+and+interacts+with+newly+synthesized+Cox1p%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Mss51p promotes mitochondrial Cox1p synthesis and interacts with newly synthesized Cox1p.</a> EMBO J. 22 (21), 5951-5961 (2003).</li>
<li>Sanchirico, M. E., Fox, T. D., Mason, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+mitochondrially+synthesized+Saccharomyces+cerevisiae+Cox2p+and+Cox3p+depends+on+targeting+information+in+untranslated+portions+of+their+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Accumulation of mitochondrially synthesized Saccharomyces cerevisiae Cox2p and Cox3p depends on targeting information in untranslated portions of their mRNAs.</a> EMBO J. 17 (19), 5796-5804 (1998).</li>
<li>Saracco, S. A., Fox, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cox18p+is+required+for+export+of+the+mitochondrially+encoded+Saccharomyces+cerevisiae+Cox2p+C-tail+and+interacts+with+Pnt1p+and+Mss2p+in+the+inner+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Cox18p is required for export of the mitochondrially encoded Saccharomyces cerevisiae Cox2p C-tail and interacts with Pnt1p and Mss2p in the inner membrane.</a> Mol Biol Cell. 13 (4), 1122-1131 (2002).</li>
<li>McStay, G. P., Su, C. H., Thomas, S. M., Xu, J. T., Tzagoloff, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+assembly+intermediates+containing+subunit+1+of+yeast+cytochrome+oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of assembly intermediates containing subunit 1 of yeast cytochrome oxidase.</a> J Biol Chem. 288 (37), 26546-26556 (2013).</li>
<li>Golik, P., Bonnefoy, N., Szczepanek, T., Saint-Georges, Y., Lazowska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rieske+FeS+protein+encoded+and+synthesized+within+mitochondria+complements+a+deficiency+in+the+nuclear+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The Rieske FeS protein encoded and synthesized within mitochondria complements a deficiency in the nuclear gene.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (15), 8844-8849 (2003).</li>
<li>Franco, L. V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allotopic+expression+of+COX6+elucidates+Atco-driven+co-assembly+of+cytochrome+oxidase+and+ATP+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci+Alliance%22%5BJournal%5D)">Allotopic expression of COX6 elucidates Atco-driven co-assembly of cytochrome oxidase and ATP synthase.</a> Life Sci Alliance. 6 (11), e202301965(2023).</li>
<li>Mireau, H., Arnal, N., Fox, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Barstar+as+a+selectable+marker+in+yeast+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Genet+Genomics%22%5BJournal%5D)">Expression of Barstar as a selectable marker in yeast mitochondria.</a> Mol Genet Genomics. 270 (1), 1-8 (2003).</li>
<li>Cohen, J. S., Fox, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+green+fluorescent+protein+from+a+recoded+gene+inserted+into+Saccharomyces+cerevisiae+mitochondrial+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Expression of green fluorescent protein from a recoded gene inserted into Saccharomyces cerevisiae mitochondrial DNA.</a> Mitochondrion. 1 (2), 181-189 (2001).</li>
<li>Suhm, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+system+to+monitor+mitochondrial+translation+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Cell%22%5BJournal%5D)">A novel system to monitor mitochondrial translation in yeast.</a> Microb Cell. 5 (3), 158-164 (2018).</li>
<li>Rzepka, M., Suhm, T., Ott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+reporter+genes+into+mitochondrial+DNA+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Incorporation of reporter genes into mitochondrial DNA in budding yeast.</a> STAR Protoc. 3 (2), 101359(2022).</li>
<li>Steele, D. F., Butler, C. A., Fox, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+recoded+nuclear+gene+inserted+into+yeast+mitochondrial+DNA+is+limited+by+mRNA-specific+translational+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Expression of a recoded nuclear gene inserted into yeast mitochondrial DNA is limited by mRNA-specific translational activation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (11), 5253-5257 (1996).</li>
<li>Flores-Mireles, D., Camacho-Villasana, Y., Pérez-Martínez, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ARG8m+reporter+for+the+study+of+yeast+mitochondrial+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The ARG8m reporter for the study of yeast mitochondrial translation.</a> Methods Mol Biol. 2661, 281-301 (2023).</li>
<li>Perez-Martinez, X., Butler, C. A., Shingu-Vazquez, M., Fox, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+functions+of+Mss51+couple+synthesis+of+Cox1+to+assembly+of+cytochrome+c+oxidase+in+Saccharomyces+cerevisiae+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Dual functions of Mss51 couple synthesis of Cox1 to assembly of cytochrome c oxidase in Saccharomyces cerevisiae mitochondria.</a> Mol Biol Cell. 20 (20), 4371-4380 (2009).</li>
<li>Bonnefoy, N., Remacle, C., Fox, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+Saccharomyces+cerevisiae+and+Chlamydomonas+reinhardtii+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of Saccharomyces cerevisiae and Chlamydomonas reinhardtii mitochondria.</a> Methods Cell Biol. 80, 525-548 (2007).</li>
<li>Veloso Ribeiro Franco, L., Barros, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biolistic+transformation+of+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae+mitochondrial+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">Biolistic transformation of the yeast Saccharomyces cerevisiae mitochondrial DNA.</a> IUBMB Life. 75 (12), 972-982 (2023).</li>
<li>Bonnefoy, N., Fox, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+alteration+of+Saccharomyces+cerevisiae+mitochondrial+DNA+by+biolistic+transformation+and+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Directed alteration of Saccharomyces cerevisiae mitochondrial DNA by biolistic transformation and homologous recombination.</a> Methods Mol Biol. 372, 153-166 (2007).</li>
<li>Butow, R. A., Henke, R. M., Moran, J. V., Belcher, S. M., Perlman, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+Saccharomyces+cerevisiae+mitochondria+using+the+biolistic+gun%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Transformation of Saccharomyces cerevisiae mitochondria using the biolistic gun.</a> Methods Enzymol. 264, 265-278 (1996).</li>
<li>Bonnefoy, N., Fox, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+Saccharomyces+cerevisiae+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of Saccharomyces cerevisiae mitochondria.</a> Methods Cell Biol. 65, 381-396 (2001).</li>
<li>Shingú-Vázquez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+carboxyl-terminal+end+of+Cox1+is+required+for+feedback+assembly+regulation+of+Cox1+synthesis+in+Saccharomyces+cerevisiae+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The carboxyl-terminal end of Cox1 is required for feedback assembly regulation of Cox1 synthesis in Saccharomyces cerevisiae mitochondria.</a> J Biol Chem. 285 (45), 34382-34389 (2010).</li>
<li>Bonnefoy, N., Bsat, N., Fox, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+translation+of+Saccharomyces+cerevisiae+COX2+mRNA+is+controlled+by+the+nucleotide+sequence+specifying+the+pre-Cox2p+leader+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial translation of Saccharomyces cerevisiae COX2 mRNA is controlled by the nucleotide sequence specifying the pre-Cox2p leader peptide.</a> Mol Cell Biol. 21 (7), 2359-2372 (2001).</li>
<li>Meunier, B., Lemarre, P., Colson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+screening+in+Saccharomyces+cerevisiae+for+large+numbers+of+mitochondrial+point+mutations+which+affect+structure+and+function+of+catalytic+subunits+of+cytochrome-c+oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Genetic screening in Saccharomyces cerevisiae for large numbers of mitochondrial point mutations which affect structure and function of catalytic subunits of cytochrome-c oxidase.</a> Eur J Biochem. 213 (1), 129-135 (1993).</li>
<li>Dorweiler, J. E., Manogaran, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoduction+and+plasmiduction+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Cytoduction and plasmiduction in yeast.</a> Bio Protoc. 11 (17), 4146(2021).</li>
<li>Zakharov, I. A., Yarovoy, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoduction+as+a+new+tool+in+studying+the+cytoplasmic+heredity+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Cytoduction as a new tool in studying the cytoplasmic heredity in yeast.</a> Mol Cell Biochem. 14 (1-3), 15-18 (1977).</li>
<li>Conde, J., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mutant+of+Saccharomyces+cerevisiae+defective+for+nuclear+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A mutant of Saccharomyces cerevisiae defective for nuclear fusion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 73 (10), 3651-3655 (1976).</li>
<li>Burke, D., Dawson, D., Stearns, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBurke%2C+D+%22Cold+Spring+Harbor+Laboratory.+Methods+in+yeast+genetics+%3A+a+Cold+Spring+Harbor+Laboratory+manual.+2000+ed%22">Cold Spring Harbor Laboratory. Methods in yeast genetics : a Cold Spring Harbor Laboratory manual. 2000 ed</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).</li>
<li>Dunham, M. J., Gartenberg, M. R., Brown, G. W. : a. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDunham%2C+MJ+%22Methods+in+yeast+genetics+and+genomics+%3A+a+Cold+Spring+Harbor+Laboratory+course+manual.+2015+edition%22">Methods in yeast genetics and genomics : a Cold Spring Harbor Laboratory course manual. 2015 edition</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2015).</li>
<li>Ding, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+27+An+improved+method+for+introducing+point+mutations+into+the+mitochondrial+cytochrome+B+gene+to+facilitate+studying+the+role+of+cytochrome+B+in+the+formation+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Chapter 27 An improved method for introducing point mutations into the mitochondrial cytochrome B gene to facilitate studying the role of cytochrome B in the formation of reactive oxygen species.</a> Methods Enzymol. 456, 491-506 (2009).</li>
<li>Klein, C. J. L., Olsson, L., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+control+in+Saccharomyces+cerevisiae%3A+the+role+of+Mig1+in+metabolic+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+%28Reading%29%22%5BJournal%5D)">Glucose control in Saccharomyces cerevisiae: the role of Mig1 in metabolic functions.</a> Microbiology (Reading). 144, Pt 1 13-24 (1998).</li>
<li>Rolland, F., Winderickx, J., Thevelein, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose-sensing+and+-signalling+mechanisms+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Res%22%5BJournal%5D)">Glucose-sensing and -signalling mechanisms in yeast.</a> FEMS Yeast Res. 2 (2), 183-201 (2002).</li>
<li>Gruschke, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cbp3-Cbp6+complex+coordinates+cytochrome+b+synthesis+with+bc%281%29+complex+assembly+in+yeast+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The Cbp3-Cbp6 complex coordinates cytochrome b synthesis with bc(1) complex assembly in yeast mitochondria.</a> J Cell Biol. 199 (1), 137-150 (2012).</li>
<li>Seshadri, S. R., Banarjee, C., Barros, M. H., Fontanesi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+translational+activator+Sov1+coordinates+mitochondrial+gene+expression+with+mitoribosome+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The translational activator Sov1 coordinates mitochondrial gene expression with mitoribosome biogenesis.</a> Nucleic Acids Res. 48 (12), 6759-6774 (2020).</li>
<li>Rak, M., Tzagoloff, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F1-dependent+translation+of+mitochondrially+encoded+Atp6p+and+Atp8p+subunits+of+yeast+ATP+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">F1-dependent translation of mitochondrially encoded Atp6p and Atp8p subunits of yeast ATP synthase.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (44), 18509-18514 (2009).</li>
<li>He, S., Fox, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+affecting+a+yeast+mitochondrial+inner+membrane+protein%2C+pnt1p%2C+block+export+of+a+mitochondrially+synthesized+fusion+protein+from+the+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mutations affecting a yeast mitochondrial inner membrane protein, pnt1p, block export of a mitochondrially synthesized fusion protein from the matrix.</a> Mol Cell Biol. 19 (10), 6598-6607 (1999).</li>
<li>Rak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mitochondrial+translation+of+the+ATP8%2FATP6+mRNA+by+Smt1p%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of mitochondrial translation of the ATP8/ATP6 mRNA by Smt1p.</a> Mol Biol Cell. 27 (6), 919-929 (2016).</li>
<li>Barrera-Paez, J. D., Moraes, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+genome+engineering+coming-of-age%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial genome engineering coming-of-age.</a> Trends Genet. 38 (8), 869-880 (2022).</li>
</ol>

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

본 연구는 효모 S. cerevisiae 에서 미토콘드리아를 성공적으로 변형시키는 방법을 설명했습니다. 고속 미세 발사체 충격에서 의도 된 효모 균주의 정제까지의 과정은 합성 rho-train 의 정제 횟수에 따라 8 ~ 12 주가 소요됩니다. 이 방법의 중요한 단계 중 일부는 다음과 같습니다. 첫째, 미토콘드리아 유전자 구조에서 돌연변이 부위 주변에 추가되는 측면 영역이 클수록 표적 돌연변이의 성공적인 통합 확률이 높아집니다. 측면 영역의 최소 크기는 ~100nt입니다. 그러나 돌연변이의 각 측면에 500개 이상의 NT를 사용하는 것이 좋습니다. 둘째, 형질전환 후 합성 rho-colony를 선택할 때 3-4 라운드 이상의 정제를 수행하지 않는 것이 좋습니다. 그렇지 않으면 미토콘드리아에 플라스미드를 유지하기 위한 선택적 압력이 없기 때문에 결국 미토콘드리아 구조가 손실될 위험이 높습니다. 셋째, 사용자나 장비에 해를 끼치지 않도록 절차를 시작하기 전에 폭격기의 설명서를 주의 깊게 읽어야 합니다. 이 장비는 섬세하고 고압과 진공을 사용합니다.
이 절차의 한 가지 제한 사항은 지금까지 효모와 녹조류 C. reinhardtii 만이 이 방법으로 미토콘드리아를 변형시킬 수 있는 후보라는 것입니다. 다른 유기체의 미토콘드리아 게놈에 부위 지정 돌연변이를 도입할 수 있다면 의미가 있을 것입니다. 또 다른 제한 사항은 동일한 세션에서 많은 다른 구문을 변환하기가 어렵다는 것입니다. 각 구성에 대해 6가지 변형을 수행하는 것이 권장되며, 각 변환은 테스트, 선택 및 정제되어야 합니다. 그 결과 50개 이상의 배지 플레이트가 생성되어 단일 미토콘드리아 돌연변이의 순수한 로콜 로니를 얻을 수 있습니다.
이러한 한계에도 불구하고 효모 미토콘드리아 게놈을 조작할 수 있는 능력은 호흡기 복합체 생물 발생의 많은 경로를 이해하는 데 크게 기여했습니다. 이 접근법은 미토콘드리아 번역 1,7,36,37을 모니터링 및 정량화하기 위해 리포터 유전자를 도입하고, 미토콘드리아 유전자38을 중단하고, 호흡기 복합체(39)의 조립 샤페론을 식별하고, 결합된 미토콘드리아 번역및 조립 7,11,12,36의 메커니즘을 더 잘 이해하는 데 사용할 수 있습니다, 돌연변이된 미토콘드리아 유전자40의 발현을 추적할 때 억제 인자를 찾습니다. 지금까지 포유류에서 미토콘드리아 게놈을 조작하기 위한 특정 접근 방식이 이전에 보고되었지만41 이러한 유기체에 대해 미토콘드리아 DNA를 변형시키는 광범위한 방법은 존재하지 않습니다.

<table><tbody><tr><td>1 mL 피펫 팁</td><td>Axygen</td><td>T-1000-B</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 마이크로튜브</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu; L 피펫 팁</td><td>Axygen</td><td>T-10-C</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 원뿔형 바닥 튜브&nbsp;</td><td>액시젠</td><td>SCT-25ML-25-S</td><td></td></tr><tr><td>200 & L 피펫 팁</td><td>Axygen</td><td>T-200-Y</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 원뿔형 바닥&nbsp; 튜브</td><td>Axygen</td><td>SCT-50ML-25-S</td><td></td></tr><tr><td>AfiII</td><td>New England BioLabs</td><td>R0520S</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>SeaKem</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>분석 저울</td><td>OHAUS</td><td>ARA520</td><td></td></tr><tr><td>오토클레이브</td><td>TOMY</td><td>ES-315</td><td></td></tr><tr><td>Bacto 한천</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Bacto 펩톤</td><td>BD</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Biolisitic 매크로캐리어 홀더&nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>1652322</td><td></td></tr><tr><td>분젠 버너</td><td>VWR</td><td>89038-528</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>CSM -ADE</td><td>Formedium</td><td>DCS0049</td><td></td></tr><tr><td>CSM -ARG</td><td>Formedium</td><td>DCS0059</td><td></td></tr><tr><td>CSM -LEU</td><td>Formedium</td><td>DCS0099</td><td></td></tr><tr><td>CSM -URA</td><td>Formedium</td><td></td><td></td>DCS0169</tr><tr><td>문화 유리 플라스크</td><td>KIMAX KIMBLE</td><td>25615</td><td></td></tr><tr><td>문화 유리 튜브</td><td>Pyrex</td><td>9820</td><td></td></tr><tr><td>덱스트로스</td><td>BD</td><td>215520</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>JT 베이커&nbsp;</td><td>9000</td><td></td></tr><tr><td>펜치</td><td>Millipore</td><td>620006</td><td></td></tr><tr><td>유리 구슬</td><td>Sigma</td><td>Z265926</td><td></td></tr><tr><td>유리 핸들</td><td>Sigma</td><td>S4647</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>JT BAKER</td><td>2136-01</td><td></td></tr><tr><td>헬륨 탱크 등급 5 (99.99 %)</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>HSTaq&nbsp; Kit</td><td>PCR BIO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifugue</td><td>Eppendorf</td><td>022620100</td><td></td></tr><tr><td>NdeI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0111L</td><td></td></tr><tr><td>오비탈 쉐이커</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>NB-G25</td><td></td></tr><tr><td>PCR 튜브</td><td>Axygen</td><td>PCR-02-C</td><td></td></tr><tr><td>PDS-1000/He TM Biolistic Particle Delivery System</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2257</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시 (100X10)</td><td>BD</td><td>252777</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep 스핀 Miniprep</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>Raffinose</td><td>Formedium</td><td>RAF03</td><td></td></tr><tr><td>복제 플래터</td><td>Scienceware</td><td>Z363391</td><td></td></tr><tr><td>파열 디스크 1350 Psi</td><td>BIO-RAD</td><td>1652330</td><td></td></tr><tr><td>소르비톨</td><td>시그마</td><td>S7547</td><td></td></tr><tr><td>Spermidine</td><td>Sigma</td><td>S0266</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>Thermo Scientific</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 회전자</td><td>Thermo Scientific</td><td>88882015</td><td></td></tr><tr><td>텅스텐 마이크로 캐리어 M10</td><td>BIO-RAD</td><td>1652266</td><td></td></tr><tr><td>100L / min 용량의 진공 펌프</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>벨벳 패드</td><td>Bel-Art</td><td>H37848-0002</td><td></td></tr><tr><td>소용돌이&nbsp;</td><td>Scientifc Industries</td><td>SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>목재 애플리케이터 스틱</td><td>PROMA</td><td>1820060</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>BD</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>효모 질소 염기 아미노산 없음</td><td>BD</td><td>291920</td><td></td></tr></tbody></table>

베이커의 미토콘드리아 변환

Mitochondrial Transformation in Baker&#39;s Yeast to Study Translation and Respiratory Complex Assembly

베이커 효모 맥주효 모균(Saccharomyces cerevisiae )은 수십 년 동안 미토콘드리아 생물학을 이해하는 데 널리 사용되어 왔습니다. 이 모델은 진핵생물 사이에서 필수적이고 보존된 미토콘드리아 경로와 곰팡이 또는 효모 특이적 경로에 대한 지식을 제공했습니다. S. cerevisiae 의 많은 능력 중 하나는 미토콘드리아 게놈을 조작하는 능력으로, 지금까지 S. cerevisiae 와 단세포 조류 Chlamydomonas reinhardtii에서만 가능합니다. 효모 미토콘드리아의 생물학적 형질전환(biolistic transformation)을 통해 부위 지정 돌연변이(site-directed mutation)를 소개하고, 유전자를 재배열하고, 리포터(reporter)를 소개할 수 있습니다. 이러한 접근법은 주로 미토콘드리아에서 고도로 조정된 두 가지 과정, 즉 미토리보솜에 의한 번역과 호흡기 복합체 및 ATP 합성효소의 조립의 메커니즘을 이해하는 데 사용됩니다. 그러나 미토콘드리아 변환은 잠재적으로 다른 경로를 연구하는 데 사용될 수 있습니다. 본 연구에서는 고속 미세발사체 충격에 의해 효모 미토콘드리아를 형질전환시키는 방법, 의도한 형질전환체를 선별 및 정제하는 방법, 원하는 돌연변이를 미토콘드리아 게놈에 도입하는 방법을 보여줍니다.

이 연구는 생물학적 방법을 사용하여 효모 미토콘드리아를 형질전환하는 방법을 설명합니다. 또한 형질전환체를 선택하고 정제하는 방법과 미토콘드리아 게놈 내의 표적 위치에 원하는 돌연변이를 도입하는 방법을 보여줍니다.

Baker&#180;s yeast Saccharomyces cerevisiae has been widely used to understand mitochondrial biology for decades. This model has provided knowledge about ...

mitochondrial-transformation-baker-s-yeast-to-study-translation

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

베이커의 효모 미토콘드리아 게놈은 8개의 폴리펩티드를 인코딩합니다. 현재 프로토콜의 목표는 모든 프로토콜에 레이블을 지정한 다음 별도의 대역으로 시각화하는 것입니다.

베이커효모사카로미세스 세레비시아에 미토콘드리아 게놈 발현 제품의 라벨링 및 시각화

효모 전체 세포의 미토콘드리아 호흡은 세포 생물 에너지학의 중요한 지표입니다. 여기에서는 다양한 효모 종에 적용할 수 있는 이 표현형을 정량화하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

효모 전체 세포의 미토콘드리아 호흡 정량화

분열 효모인 Schizosaccharomyces pombe 는 미토콘드리아를 연구하기 위한 매력적인 모델로 부상하고 있습니다. 여기에서는 S. pombe에서 미토콘드리아 호흡 복합체의 풍부함과 조립을 분석하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이를 통해 미토콘드리아 호흡 사슬에서 보존된 유전자의 새로운 기능을 특성화할 수 있습니다.

핵분열 효모 schizosaccharomyces pombe에서 미토콘드리아 호흡 사슬 단백질의 발현 및 복합체 어셈블리 분석

높은 처리량, 자동화, 담배 원형질체 생산 및 변환 방법이 설명되어 있습니다. 로봇 시스템이 아닌 모델 작물로 번역해야한다 모델 BY-2 시스템에 대규모 병렬 유전자 발현 및 검색 할 수 있습니다.

높은 처리량 원형질체 분리 및 변환을위한 로봇 플랫폼

유전자 Ustilago이 maydis 검댕 곰팡이 조작에 우리는 강력한 유전자 교체 전략을 설명합니다. 이 프로토콜은 감염 표현형을 조사하기 위해 삭제 돌연변이를 생성하는 방법에 대해 설명합니다. 형광 표지 단백질을 코딩하는 서열을 추가하여, 예를 들어, 임의의 방법으로 유전자를 수정하도록 확장 될 수있다.

플랜트 병원체의 유전자 조작<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; 곰팡이 생물과 식물 미생물 상호 작용을 연구하는

Saccharomyces cerevisiae의 내인성 위치에서 히스톤 유전자의 돌연변이를 생성하는 전략이 제시됩니다.

대상<em&gt; 현장에서</em신진 효모에서&gt; 돌연변이 유발 히스톤의 유전자

이 프로토콜의 목표 레이저 microirradiation를 사용 하 여 다른 유형의 DNA 손상, 비교적 간단한 가닥 나누기 등 복잡 한 손상, DNA 손상 신호 및 복구 요소에서 어셈블리 피해 사이트 vivo에서 공부를 유도 하는 방법을 설명 하는 것입니다. .

간단 하 고 복잡 한 DNA 손상에 세포질 응답 Vivo에서 공부 레이저 Microirradiation

이 프로토콜 칩 seq, 4sU-seq, seq-총 RNA, 리보솜 세포 선 및 1 차 셀에 대 한 프로 파일링의 조합 사용을 설명 합니다. 전사-요소 바인딩, 드 노 보 전사, RNA 가공, 회전율 및 시간이 지남에, 번역 활성화 및 급변 셀에서 이벤트의 전체 과정을 표시 하 고 변경 내용을 추적을 수 있습니다.

바인딩, 전사, 번역, 및 회전율 세포 활성화 중 글로벌 이벤트를 표시 하는 녹음 방송 요인의 실시간 분석

이 문서에는 분열 효 모에 대상 유전자의 무작위 mutagenesis에 대 한 자세한 방법을 설명합니다. 예를 들어, 우리가 대상 rpt4 +, 19S 프로테아좀 섬으로 불안정 돌연변이 대 한 스크린의 소 단위를 인코딩하는.

분열 효 모 섬으로 불안정 프로테아좀 돌연변이 선택할 임의의 Mutagenesis 유전자 타겟팅

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배우세요 효모 미토콘드리아 변환 프로토콜을 통해 산화적 인산화에 필수적인 단백질 합성 조절과 내막 조립 메커니즘을 연구하는 방법을 Saccharomyces cerevisiae 모델로 알아보세요.

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