Name: 쥐의 간 관류 및 일차 간세포 분리: 최첨단 3D 오가노이드 배양에 중요한 오래된 절차 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-22T13:20:00.000+00:00
Duration: 13 min 9 s
Description: 배우세요 쥐 간 관류 및 일차 간세포 분리 기법을 활용한 3D 오가노이드 배양 방법입니다. 이 프로토콜은 장기간 기능을 유지하는 생체 외 간 연구 모델을 구축하는 데 필수적입니다.

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</ol>

<table><tbody><tr><td>A83-01- ALK5 억제제 IV</td><td>트윈 헬릭스</td><td>&nbsp; T3031</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>0080085SA</td><td></td></tr><tr><td>CFX Connect Real-Time PCR 검출 시스템&nbsp;</td><td>&nbsp; Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Twin Helix</td><td>T2310</td><td></td></tr><tr><td>Click EdU Alexa 488 이미징 키트</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>C10499</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐, 타입 I, 쥐 꼬리</td><td>Merck</td><td>C3867-1VL</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethasone의 용액&nbsp;</td><td>머크</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>머크</td><td>&nbsp; E9644</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Euroclone</td><td>ECS0180L</td><td></td></tr><tr><td>GELTREX LDEV FREE RGF BME</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A1413202</td><td></td></tr><tr><td>Heparin Sodium 25000 IU/5 ml</td><td>B. Braun Melsungen AG</td><td>B01AB01</td><td></td></tr><tr><td>HGF</td><td>Peprotech</td><td>&nbsp; 100-39시간&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>인슐린-트랜스페린-셀레늄 용액 100x&nbsp;</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>41400045</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민 솔루션</td><td>유로클론</td><td>ECB3000D</td><td></td></tr><tr><td>간 소화 매체&nbsp;</td><td>써모피셔 사이언티픽</td><td>&nbsp; 17703-034</td><td></td></tr><tr><td>간 관류 매체</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>17701038</td><td></td></tr><tr><td>N2 보충제</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>N-아세틸시스테인</td><td>Merck</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>니코틴아미드</td><td>Merck</td><td>&nbsp; N-0636</td><td></td></tr><tr><td>비필수 아미노산</td><td>Merck</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>Normocin</td><td>Aurogene</td><td>Ant-nr-1</td><td></td></tr><tr><td>PBS buffer 1X</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A0964,9050</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin solution 100x</td><td>Euroclone</td><td>ECB3001D</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-296039A</td><td></td></tr><tr><td>연동 펌프</td><td>이스마텍&트레이드; &nbsp;</td><td>MS-4/12 Reglo 디지털 펌프</td><td></td></tr><tr><td>TNFa</td><td>Peprotech</td><td>&nbsp; 300-01A</td><td></td></tr><tr><td>TRI 시약</td><td>Merck</td><td>T9424</td><td></td></tr><tr><td>튜빙&nbsp;</td><td>이스마텍&트레이드; &nbsp;</td><td>&nbsp; ID.2,79mm</td><td></td></tr><tr><td>윌리엄스의 E 매체, 글루타민 없음</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>31415029</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>트윈 헬릭스</td><td>T1725</td><td></td></tr></tbody></table>

쥐의 간 관류 및 일차 간세포 분리: 최첨단 3d 오가노이드 배양에 중요한 오래된 절차

Rat Liver Perfusion and Primary Hepatocytes Isolation: An Old Procedure Crucial for Cutting-Edge 3D Organoids Culture

설정 절차(단계 6.13)가 끝날 때 약 300g의 쥐의 간에서 분리할 때마다 최대 1 x 108 세포의 세포 수율을 얻었습니다. 78%와 97% 사이의 세포 생존율은 Trypan blue 계수에 의해 확립되었습니다.
이전 연구 1,18,19에서 이미 설명한 바와 같이, 배양 시 원발성 간세포는 형태, 간 특이적 기능을 잃고 며칠 내에 죽습니다.
문헌23,24에서 1차 성인 간세포는 빠르게 직육면체-육각형 형태를 잃고 며칠 내에 "섬유아세포와 같은" 모양으로 변한 후 죽는다는 것이 잘 알려져 있습니다. 그림 1은 다양한 단계를 보여줍니다: 콜라겐 코팅된 플레이트에 도금한 후 4시간이 지나면 간세포가 표면에 부착되어 직육면체 형태를 보여주는 전형적인 단층으로 퍼져있고, 세포의 가장자리가 정의되고, 세포 사이의 접합부가 선형이며, 세포 표면이 매끄럽게 보입니다(그림 1A). 1일째에는 1차 간세포가 전형적인 육각형 모양을 얻고 지질 방울이 보이기 시작합니다(그림 1B). 2-3일째에는 지질 방울이 증가하고(그림 1C-1D), 4-5일째에는 세포에 액틴 스트레스 섬유가 축적됩니다(그림 1E-F). 또한 1일째부터 5일째까지 1차 2D 배양에서 생존 가능한 세포의 비율을 평가하고 0일째에 도금하기 전의 생존력과 비교했습니다(그림 2). 배양 첫날에 이미 생존율이 급격히 감소하여 1일차에 49.5%(SD 12.7)에 도달하고 2일차에 45.2%(SD 18.2), 3일차에 33.5%(SD 0.77)로 낮아지는 것을 관찰할 수 있습니다. 4일째에 생존 가능한 세포의 비율은 이미 16.9%(SD 5.4)인 반면 5일째에는 9.1%(SD 0.38)에 이릅니다. 그러므로, 형태학의 손실은 2D 배양에서 성인 간세포의 급속한 점진적인 세포 사멸을 동반한다는 것이 명백합니다.
분리된 간세포는 도금 전(0일)에 RT-qPCR로 평가한 간 마커 유전자(ABCD3, ALB, KRT18, PCK1, SERPIN, TDO2)의 높은 mRNA 발현을 보여주었습니다(그림 3). 분석된 모든 유전자는 배양에서 1일째에 이미 배양 시간 의존적 발현 감소를 보여줍니다. mRNA 발현 수준은 이 시간 동안 일차 간세포의 기능 및 생존력 손실을 강조합니다.
분리된 간세포를 3D 매트릭스 액적에 도말하고 시간이 지남에 따라 3D 오가노이드 세포 구조를 추적했습니다. 배양 1일차에는 단일 간세포가 기질 액적에 부유합니다(그림 4A). 세포 농도는 간세포가 성장할 수 있는 충분한 공간을 제공하기 위해 의도적으로 낮게 유지됩니다. 또한 이를 통해 오가노이드 성장을 시각적으로 추적할 수 있습니다. 원발성 간세포는 배양 후 처음 며칠 동안 세포 분열을 보였습니다(그림 4C). 또한, 0일째에는 Hep-Orgs가 30μm로 측정된 반면, 2일째에는 Hep-Orgs의 크기가 거의 두 배로 증가하여 15일째까지 유지된 크기 성장을 강조했습니다(1일차 33.08μm, 2일차 64.86μm, 5일차 45.06μm, 7일차 55.19μm, 10일차 51.93μm, Fay 15일 62.90μm). Hep-Orgs 형태와 관련하여, 1일차에는 둥근 모양이었지만 다음 날에는 "포도 송이 모양"(간 오가노이드의 전형)에 도달했습니다.
3D 매트릭스에 도팅된 간세포는 몇 주 동안 배양에서 활성 상태로 유지되어 Trypan blue assay를 사용하여 15일 후 23%±10%의 생존율을 보여줍니다(그림 4B, 첫 번째 줄). 쥐 Hep-Orgs의 증식을 검증하기 위해 15일째에 EdU 테스트를 수행했습니다(그림 4D). 그럼에도 불구하고 Hoechst 염색은 Hep-Orgs보다 많은 수의 단일 세포를 보여주었으며, EdU 통합이 낮더라도(9% ± 7%) 간세포(녹색 세포)의 증식 활성이 존재했습니다(그림 4B, 두 번째 줄).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66857/66857fig01.jpg"> 그림 1: 시간 경과에 따른 콜라겐 코팅 플레이트의 원발성 간세포 2D 배양. 도금 후 4시간, (B) 1일차, (C) 2일차, (D) 3일차, (E) 4일차, (F) 5일차에 (A) 위상차 현미경을 사용하여 20x 배율로 이미지를 촬영했습니다. 50μm에 해당하는 눈금이 각 그림에 보고됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66857/66857fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66857/66857fig02.jpg"> 그림 2: 콜라겐 코팅 플레이트의 2D 배양에서 생존 가능한 일차 세포. 그래프는 100%로 간주되는 0일에 도금된 생존 세포와 비교하여 1일차부터 5일차까지의 생존 가능한 세포의 백분율을 보여줍니다. 결과는 3가지 다른 실험의 단일 반복실험, 평균 및 SD로 보고됩니다(* p-값 ≤ 0.05; ** p-값 ≤ 0.005). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66857/66857fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66857/66857fig03.jpg"> 그림 3: 원발성 간세포에서 RT-qPCR로 측정한 간 마커의 mRNA 발현. 결과는 β-Actin 및/또는 GAPDH(하우스키핑 유전자)에서 정규화되었으며 0일에 도금 전에 수집된 1차 간세포에 대해 1로 간주되는 것으로 발현됩니다. 결과는 최소 3개의 다른 실험에서 평균 ± SD로 보고됩니다(**+ p-값 ≤ 0.001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66857/66857fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66857/66857fig04.jpg"> 그림 4: 시간 경과에 따른 기질 액적의 3D 간세포 배양. (A) 장기 Hep-Orgs를 위해 매트릭스 액적에 도금된 분리된 간세포: 그림에서 매트릭스 액적은 웰 표면에서 볼 수 있습니다(빨간색 원 = 하나의 액적). (B) 통과 전 15일째에 Trypan blue에 의한 생존 가능한 세포 및 EdU에 의한 증식 세포의 비율. EdU 양성 세포 정량화는 ImageJ2 소프트웨어에 의해 수행되었습니다. 결과는 최소 3개의 다른 실험에 대한 평균±SD로 백분율로 보고됩니다. (C) 3D 배양에서 다양한 성장 일수(1일, 2일, 5일, 7일, 10일, 15일)에서 쥐 Hep-Orgs 3D 배양의 위상차 이미지. 사진 확대 20X. 50μm에 해당하는 눈금이 각 그림에 보고됩니다. (D) 15일째에 쥐 Hep-Orgs의 EdU 통합 분석. 사진 확대 20X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66857/66857fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 1: 버퍼 및 미디어 구성. 이 표는 프로토콜에 사용된 모든 완충액 및 셀 매체의 이름과 성분(최종 농도 포함)을 보고합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66857/2024.05.08_Table%201.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 2: 쥐 프라이머 목록. 이 표는 RT-qPCR 실험에 사용되는 프라이머 목록을 보고합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66857/2024.05.08%20Table%202.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

쥐의 간 관류 및 일차 간세포 분리: 최첨단 3D 오가노이드 배양에 중요한 오래된 절차

Primary hepatocytes are a commonly used tool for in vitro liver-related studies. However, the maintenance of these cells has always been a challenge due ...

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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간 sinusoidal 내피 세포 (초)의 연구는 더 셀 라인이 존재하지 않는 등 동물에서 얻은 기본 세포로 수행되어야합니다. 이 방법은 이후 culturing 및 실험에 대한 SEC의 정화를 위해 간 소화 및 차등 원심 분리에 의존하고 있습니다.

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기본 hepatocytes는 생리학 관련 실험 시스템의 생화학, 분자, 그리고 신진 대사 기능을 평가하는 유용한 도구를 제공합니다. 우리는 지속적으로 to1.0 × 10 백업 실행 가능한 hepatocytes를 생성 원위치 간 재관류에 쥐에 대한 신뢰할 수있는 프로토콜을...

쥐 간장 세포의 분리 및 차 문화

인간 간세포의 분리를위한 수정 된 두 단계의 콜라게나 제 관류 절차가 설명되어 있습니다. 이 방법은 다른 포유 동물의 간장에 적용될 수있다. 고립 된 간세포는 그 같은 간 재생, 약동학 및 독성 등의 분야에서 과학 연구에 적합한 모델을 만들고, 높은 수율과 생존에서 사용할 수 있습니다.

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동일한 공여자로부터 인간 간세포와 비실질 간 세포를 분리하는 기술에 대해 설명합니다. 다양한 간 세포 유형은 기능적 간 모델 및 조직 공학의 기초를 구축합니다. 이 새로운 방법은 높은 수율과 생존력으로 간 세포를 분리하는 것을 목표로 합니다.

차 인간 간세포의 분리 및 비 실질 간 세포의 주요 집단 대응을위한 프로토콜

이 프로토콜의 목표는 간에서 높은 생존 능력 및 hepatocytes 및 정현파 내 피 세포의 높은 수익률을 얻을 것입니다. 이 유형 IV 콜라 솔루션 hepatocytes 및 정현파 내 피 세포 차등 원심 분리 뒤 문맥을 통해 간 perfusing에 의해 수행 됩니다.

Hepatocytes에서 마우스 간 사인 내 피 세포의 정화 관류

여기서 제시된 것은 변형된 콜라게나아제 관류 기술을 사용하여 성인 마우스 간으로부터 마우스 간세포의 분리를 위한 프로토콜이다. 또한 3D 콜라겐 샌드위치 설정에서 간세포의 장기 배양뿐만 아니라 담즙 카나리아 형성 및 치료에 대한 반응을 연구하기 위한 세포골격 성분의 면역 라벨링이 기술된다.

체외에서 담즙 관내 형성에서 세포골격의 역할을 연구하기 위해 1 차 마우스 간세포의 격리 및 3D 콜라겐 샌드위치 문화

원발성 간세포는 시험관 내에서 간 반응과 신진 대사를 연구하는 데 유용한 도구입니다. 상업적으로 이용가능한 시약을 이용하여, 마우스 원발성 간세포 단리를 위한 개선된 시간- 및 노동-효율적인 프로토콜이 개발되었다.

마우스 원발성 간세포 분리를 위한 개선된 시간 및 노동력 효율적인 프로토콜

이 프로토콜은 특수 정맥 내 카테터, 표준화 된 멸균 일회용 튜브, 실시간 모니터링으로 보완 된 온도 제어 및 분리 된 일차 쥐 간세포의 생존력, 수율 및 기능의 일관성을 향상시키기 위해 두 단계 콜라게나제 관류 절차를위한 경보 시스템의 사용을 자세히 설명합니다.

다중 파라미터 관류 조절을 통한 원발성 쥐 간세포의 분리

마우스 간세포로부터 장기 전 시험관 3D 오르간구배기 시스템이 구축되었다. 이러한 오르가노이드는 shRNA/ectopic 구조, siRNA 경질 및 CRISPR-Cas9 엔지니어링의 렌티바이러스 감염에 의해 통과되고 유전적으로 조작될 수 있다.

뮤린 헤파토세포 오르가노이드의 설립 및 유전적 조작

여기에서, 우리는 간 구조를 방해하지 않으면서 간 외 요인이 없는 상태에서 간 대사의 급성 및 직접적인 조절을 연구하기 위해 쥐 간의 현장 관류를 위한 강력한 방법을 제시합니다.

간 포도당 생산, 요소 형성 및 지방 분해는 관류 마우스 간 모델을 사용하여 정량화되었습니다.

배우세요 쥐 간 관류 및 일차 간세포 분리 기법을 활용한 3D 오가노이드 배양 방법입니다. 이 프로토콜은 장기간 기능을 유지하는 생체 외 간 연구 모델을 구축하는 데 필수적입니다.

쥐의 간 관류 및 일차 간세포 분리: 최첨단 3D 오가노이드 배양에 중요한 오래된 절차

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