Name: 생쥐의 뇌와 두개골에서 면역 세포 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-26T13:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: 배우세요 생쥐 뇌와 두개골 골수에서 면역 세포를 분리하는 효과적인 방법을. 이 기술은 뇌 허혈 후 면역 반응을 연구하고 신경염증의 치료 표적을 발굴하는 데 필수적인 도구를 제공합니다.

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Kathy Gage의 탁월한 편집 기여에 감사드립니다. 일러스트 피규어는 BioRender.com 로 제작되었습니다. 이 연구는 마취과(Duke University Medical Center)와 NIH 보조금 NS099590, HL157354 및 NS127163의 자금으로 지원되었습니다.

이 프로토콜은 Duke Institute Animal Care and Use Committee(IACUC)의 승인을 받았습니다. 본 연구에서는 수컷 C57Bl/6마리 마우스(3-4개월령, 22-28g)를 사용하였다. 시약 및 사용된 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나열되어 있습니다.
1. 쥐 두뇌에서 단세포 현탁액
참고: 그림 1 은 뇌세포 분리 프로토콜의 개요를 보여줍니다.
<ol><li>앞에서 설명한 것처럼 마우스를 마취하고, 삽관하고, 고정합니다11.</li>
	<li>피부와 아래 근육층을 통해 상복부를 절개하고 횡격막과 갈비뼈를 조심스럽게 절단하여 흉강으로 들어가는 구멍을 만듭니다.</li>
	<li>30mL 주사기에 차가운 PBS를 채우고 실리콘 튜브를 통해 뭉툭한 관류 바늘에 부착합니다. 관류 바늘을 좌심실에 조심스럽게 삽입합니다.</li>
	<li>혈액이 배출될 수 있도록 우심방에 작은 흠집을 낸 다음12-1 분 동안 ~ 10mL/min의 유속으로 마우스를 관류합니다. 알림: 뇌의 혈액 청소를 개선하기 위해 관류 용액의 양을 늘리고 헤파린을 추가하는 것을 고려할 수 있습니다.</li>
	<li>쥐의 목을 베고 머리 꼭대기의 피부를 통해 정중선을 절개하여 두개골을 노출시킵니다.</li>
	<li>뭉툭한 집게를 사용하여 두개골 위에 있는 결합 조직을 조심스럽게 긁어냅니다.</li>
	<li>날카로운 해부 가위를 사용하여 정중선과 양쪽의 두개골 봉합사를 조심스럽게 잘라 플랩을 만듭니다.</li>
	<li>두개골 플랩을 부드럽게 들어 올려 뇌를 노출시키고 뭉툭한 집게를 사용하여 두개강에서 뇌를 조심스럽게 제거합니다.</li>
	<li>얼음처럼 차가운 PBS가 들어 있는 페트리 접시에 뇌를 담그고 남아 있는 뇌수 조직을 제거합니다. 알림: 세포 생존력을 더 잘 보존하려면 얼음 또는 4 °C에서 다음 단계를 모두 수행하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>20mL(전뇌) 또는 12mL(반뇌)의 얼음 오래된 HBSS 완충액이 포함된 사전 냉각된 15mL 유리 Dounce 균질화기에 뇌를 넣습니다.</li>
	<li>느슨한 Dounce 유봉을 사용하여 얼음 위에서 약 100-120번의 스트로크로 뇌 조직을 부드럽고 천천히 해리시킵니다. 참고: 이 단계는 건강한 뇌 세포를 대량으로 얻는 데 중요합니다. 이 단계는 약 10분 정도 걸립니다. 현탁액에서 실질적인 뇌 조직 덩어리가 보이지 않을 때 균질화를 중지합니다. 이 시점에서 유봉은 힘없이 쉽게 아래로 이동할 수 있습니다.</li>
	<li>50mL 원심분리 튜브의 70μm 세포 여과기를 통해 생성된 뇌 조직 현탁액을 여과합니다.</li>
	<li>Dounce 튜브를 5mL HBSS로 헹구고 여과를 진행하여 세포 수집을 최대화합니다.</li>
	<li>여과된 조직 현탁액을 550 x g 에서 4°C에서 6분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>진공 흡입기를 사용하여 상층액을 제거하고 세포 펠릿을 1mL의 30% 등장 밀도 구배 용액에 재현탁시킵니다. 참고: 15mL의 30% 등장 밀도 그래디언트 용액을 만들려면 4.5mL의 100% 스톡 밀도 그래디언트 배지, 1.5mL의 10× PBS 및 9mL의 ddH2O를 혼합합니다.</li>
	<li>세포 현탁액을 15mL 원심분리 튜브에 옮기고 9mL(전뇌) 또는 6mL(반뇌)의 30% 밀도 그래디언트 용액을 추가합니다.</li>
	<li>철저한 혼합을 위해 튜브를 부드럽게 뒤집습니다.</li>
	<li>가속하고 브레이크를 레벨 3으로 설정한 상태에서 845 x g 에서 튜브를 즉시 원심분리하여 4°C에서 20분 동안 분리합니다.</li>
	<li>원심분리기에서 튜브를 흔들지 않고 부드럽게 제거하고 진공에 연결된 1mL 팁을 사용하여 상부 미엘린층을 조심스럽게 흡입합니다. 참고: 이 레이어를 방해하지 않는 것이 매우 중요합니다. 남아 있는 미엘린은 세포 건강에 부정적인 영향을 미치고 다운스트림 분석을 손상시킬 수 있습니다.</li>
	<li>1-2mL를 남기고 상층액을 흡인하고 최소 10mL의 차가운 HBSS로 세포 펠릿을 재현탁시킵니다.</li>
	<li>550 x g 에서 4 °C에서 6분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>최소 7mL의 차가운 HBSS로 한 번 더 세척합니다.</li>
	<li>가능한 한 많은 상층액을 제거하고 100-200 μL의 유세포 분석 버퍼를 사용하여 유세포 분석을 위해 세포를 재현탁시킵니다. 참고: 이 연구에 사용된 유세포 분석 FACS 완충액에는 1× PBS에 0.5% BSA 및 2mM EDTA가 포함되어 있습니다. 세척 단계 중 세포 손실을 최소화하기 위해 세포 염색을 위한 96웰 V-바닥 플레이트를 사용하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>개별 실험실에서 확립된 표준 프로토콜을 사용하여 유세포 분석 수행13.<ol><li>간단히 말해서, 80 μL의 세포 현탁액과 20 μL의 항체 혼합물을 96-웰 V-바닥 플레이트에 혼합하고 4 °C에서 25분 동안 배양합니다.</li>
		<li>200 μL의 FACS 완충액으로 세척한 다음 100 μL의 HBSS plus cell viability 염색 시약으로 세포를 재현탁시킵니다.</li>
		<li>4°C에서 15분 배양한 후 FACS 완충액으로 세척하고 유세포 분석을 위해 200μL의 FACS 완충액에 세포를 재현탁시킵니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 마우스 calvaria에서 골수 단세포 현탁액의 제조
참고: 그림 2 는 두개골 골수 분리 절차의 개요를 보여줍니다.
<ol><li>1.4단계에서 설명한 대로 마우스를 관류합니다.</li>
	<li>쥐의 목을 베고 두피의 정중선 피부를 절개하여 두개골을 노출시킵니다.</li>
	<li>날카로운 가위를 사용하여 유공 매그넘에서 시작하여 두개골의 측면을 따라 앞으로 이동하여 두개골을 자릅니다. 그런 다음 종아리를 들어 올려 제거합니다. 참고: 동일한 마우스에서 뇌를 채취하여 1단계를 사용하여 처리할 수 있으므로 뇌와 두개골 골수 모두에서 면역 세포를 분석할 수 있습니다.</li>
	<li>뭉툭한 집게를 사용하여 해부 현미경으로 두개골에서 경막을 조심스럽게 벗겨냅니다. 참고: 후두골의 가장자리에서 시작하여 천천히 분리하고 안쪽으로 작업하면서 전두부를 향해 꾸준히 진행하는 것이 더 쉽습니다.</li>
	<li>얼음 위에 접시에 종아리를 놓고 1mL 피펫을 사용하여 종아리를 헹구어 표면에서 혈액 잔류물을 제거합니다.</li>
	<li>calvaria를 담그기에 충분한 신선하고 차가운 PBS가 있는 새 접시로 calvaria를 옮깁니다.</li>
	<li>멸균 가위를 사용하여 차가운 PBS에서 calvaria를 약 3mm x 3mm 조각으로 자릅니다. 참고: 자르기 방법은 calvaria 골수 추출의 효율성에 영향을 미칠 수 있습니다. 변동성을 최소화하기 위해 동일한 자르기 방법을 사용하는 것이 좋습니다. 봉합사를 잘라 내는 것도 중요합니다. 그림 2B 는 한 가지 접근 방식을 보여줍니다.</li>
	<li>500G 바늘을 사용하여 18μL 미세 원심분리기 튜브 바닥에 구멍을 뚫습니다.</li>
	<li>이 튜브를 20μL의 차가운 PBS가 들어 있는 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에 삽입합니다.</li>
	<li>calvaria 단편을 500 μL 튜브로 옮깁니다. 참고: 뼈 조각은 추출 효율성을 높이기 위해 느슨하게 포장해야 합니다.</li>
	<li>10,000 x g 에서 4 °C에서 30초 동안 원심분리기. 알림: 세포 회수를 최대화하려면 18G 바늘을 사용하여 종골 조각을 부드럽게 저어주고 이 단계를 1-2회 더 반복합니다.</li>
	<li>수집된 calvaria 골수 세포를 500μL의 적혈구 용해 완충액에 재현탁시키고 실온에서 30초 동안 배양합니다.</li>
	<li>현탁액을 4mL의 콜드 PBS가 들어 있는 15mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.</li>
	<li>400 x g 에서 4 °C에서 6분 동안 원심분리기.</li>
	<li>콜드 PBS 5mL로 한 번 더 세척합니다.</li>
	<li>세포 펠릿을 적절한 완충액에 재현탁시킵니다. 유세포 분석의 경우 일반적으로 500μL의 FACS 완충액을 사용합니다.</li>
	<li>유세포 분석을 위해 세포 계수를 수행하고 항체 염색을 위해 약 1 x 106 세포를 사용합니다. 참고: 항체 염색13 전에 Fc 차단 단계를 포함해야 합니다.</li>
</ol>

Murine Brain 및 Skull Bone Marrow에서 Single-Cell Suspensions 획득

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</ol>

여기에서는 뇌와 두개골 골수에서 면역 세포를 분리하기 위한 간단하면서도 효과적인 두 가지 프로토콜을 제시합니다. 이러한 프로토콜은 다양한 다운스트림 응용 분야, 특히 유세포 분석에 적합할 수 있는 대량의 생존 가능한 면역 세포를 안정적으로 생성할 수 있습니다.
다양한 뇌 질환에서 신경 염증을 연구하기 위해 뇌에서 면역 세포 준비를 위한 많은 프로토콜이 수립되어 다양한 실험실에서 사용되었습니다 15,16,17. 일반적인 접근법에는 효소 기반 세포 해리와 그래디언트 분리가 포함됩니다. 일반적으로 이러한 프로토콜에서는 뇌 조직을 다진 다음 콜라겐 분해 효소와 DNase를 모두 함유 한 효소 소화 용액에서 37 ° C에서 30-60 분 동안 부드럽게 흔듭니다. 분해 후 세포는 피펫팅 또는 Dounce 균질화와 같은 기계적 방법을 사용하여 추가 해리를 거칩니다. 세포 여과기(예: 70μm 여과기)를 통과한 후 세포는 기울기 원심분리(종종 30%/70% 밀도 그래디언트 용액)를 거쳐 미엘린, 적혈구 및 파편을 제거하고 백혈구를 농축합니다. 그러나 이 접근법은 37°C에서 장기간 효소 배양이 필요하며, 이는 뇌 면역 세포의 전사체와 단백질체를 실질적으로 변화시킬 수 있습니다. 실제로, 체계적인 조사에 따르면 효소 접근법은 특정 뇌 세포의 전사체(transcriptome)와 단백질형(proteotype)에 심오한 변화를 일으킨다고 합니다 18. 이는 scRNA-seq와 같은 후속 전사체 분석에서 아티팩트로 이어질 수 있습니다. 대조적으로, 여기에 보고된 프로토콜은 절차 전반에 걸쳐 저온에서 기계적 해리 접근 방식을 사용하여 세포 대사를 억제합니다. 이렇게 하면 transcriptional 및 proteomic 상태를 더 잘 보존하여 잠재적인 아티팩트를 최소화할 수 있습니다. 프로토콜 개발 과정에서 뇌 조직을 균질화하기 위해 대형 Dounce 균질화기를 사용하는 것이 더 낮은 세포 사멸로 더 많은 세포 수를 달성하는 데 중요하다는 것을 알게 되었습니다. Dounce 균질화 중에는 세포외 기질, 세포 파편 및 세포질 구성 요소의 대량의 존재가 세포에 독성을 유발할 수 있습니다. 과도한 양의 완충액을 사용하면 이러한 독성 물질을 희석하는 데 도움이 되므로 유해한 영향을 완화하여 세포 생존력을 높일 수 있습니다. 유세포 분석 데이터는 이 프로토콜로 준비된 면역 세포의 약 85%의 생존율을 확인했습니다. 또한, 30% 밀도의 구배 용액만으로 원심분리하면 뇌 면역 세포를 효과적으로 풍부하게 하고 미엘린을 제거한다는 점이 주목할 만합니다. 이는 또한 세포 준비 비용을 줄일 수 있습니다.
두개골 골수의 면역 세포에 대한 연구는 아직 제한적입니다. 쥐의 두개골 calvarium에서 세포를 분리하는 데 일반적으로 사용되는 방법은 두개골을 작은 조각으로 자른 다음 유봉으로 조각을 기계적으로 분쇄하는 것입니다6. 현재 프로토콜에서는 간단한 원심분리가 사용됩니다. 이 방법은 대퇴골 및 경골에서 골수를 준비하기 위해 발표된 프로토콜에서 채택된것입니다 19. 이러한 긴 뼈의 경우 원심분리를 통해 골수를 채취하기 위해 뼈의 한쪽 끝만 잘라내면 됩니다. 두개골의 경우 이 단계를 수정하여 골수를 엽니다. 재현 가능한 세포 수를 얻기 위해 두개골을 절단할 때 일관된 패턴을 사용하는 것이 좋습니다. 또한, 골수 세포의 회수를 극대화하기 위해 두개골 조각은 각 원심분리 사이에 혼합하여 2-3번의 원심분리를 거칠 수 있습니다.
두 프로토콜 모두 제한 사항이 있습니다. 첫째, 30% 밀도 구배 용액 원심분리를 사용하면 불완전한 관류로 인해 발생할 수 있는 뇌에 남아 있는 적혈구를 효과적으로 제거하지 못할 수 있습니다. 더욱이, 미엘린 구조가 특정 조건에서 조절되는 경우, 30% 밀도 구배 용액은 미엘린 제거를 위한 최적의 농도가 아닐 수 있습니다. 이 경우 밀도 구배 용액의 또 다른 작업 농도를 설정해야 합니다. 둘째, 유세포 분석 분석이 설명된 프로토콜을 사용하여 뇌 면역 세포의 우수한 세포 생존력을 나타내지만, 악티노마이신 D가 사용될 수 있는 전사체 분석과 같은 다른 응용 분야에 대해서는 여전히 평가가 필요합니다. 셋째, 종골은 두개골 골수를 준비하는 데 사용됩니다. 그러나 면역 세포는 두개골의 다른 많은 부분에 존재한다는 점에 유의해야 합니다. 마지막으로, 뇌막, 특히 경막은 다양한 면역 세포를 보유하고 있으며 뇌의 항상성과 기능 장애에 중요한 역할을 한다20. 수막의 면역 분석을 위해, 다른 곳에서 발표된 프로토콜이 채택될 수 있다 17,21,22,23.
요약하면, 쥐의 뇌와 두개골 모두에서 면역 세포를 분리하기 위한 두 가지 강력한 프로토콜이 설명됩니다. 이러한 프로토콜은 다양한 다운스트림 애플리케이션에 적합한 고품질 셀을 대량으로 획득하는 데 유용할 것으로 예상됩니다.

신경계의 중심 허브인 뇌는 두개골에 의해 보호됩니다. 두개골 아래에는 수막으로 알려진 세 층의 결합 조직, 즉 경막(dura mater), 거미막(arachnoid mater) 및 피아 마터(pia mater)가 있습니다. 뇌척수액(CSF)은 지주막하(subarachnoid)와 지주막(pia mater) 사이의 지주막하 공간을 순환하며 뇌를 완충하고 림프계를 통해 노폐물을 제거합니다 1,2. 이 독특한 아키텍처는 뇌의 안정성을 유지하고 잠재적인 손상으로부터 뇌를 보호하는 안전하고 지원적인 환경을 제공합니다.
뇌는 오랫동안 면역 특권을 가진 것으로 여겨져 왔습니다. 그러나 실질에 상주하는 미세아교세포 외에도 맥락총(choroid plexus)과 수막(meninges)을 포함한 뇌의 경계가 다양한 면역 세포를 수용한다는 증거가 늘어나면서 이 개념은 부분적으로 포기되었습니다3. 이 세포는 항상성을 유지하고, 뇌 건강을 감시하며, 뇌 손상에 대한 면역 반응을 시작하는 데 중요한 역할을 합니다. 특히 최근의 연구 결과에 따르면 두개골은 뇌수 면역에 관여하며 손상 후 뇌의 면역 반응에 기여할 수 있습니다. 2018년, Herisson et al.은 두개골 골수와 수막을 연결하는 직접 혈관 채널을 발견하여 백혈구 이동을 위한 해부학적 경로를 확립했습니다 4,5. 나중에, Cugurra et al.은 수막의 많은 골수성 세포(예: 단핵구 및 호중구)와 B 세포가 혈액에서 유래하지 않는다는 것을 입증했습니다6. 저자들은 calvaria bone-flap transplantation 및 selective irradiation 요법과 같은 기술을 사용하여 두개골 골수가 CNS 손상 후 CNS 실질뿐만 아니라 수막의 골수성 세포에 대한 국소 공급원 역할을 한다는 설득력 있는 증거를 제시했다6. 또한, 또 다른 연구에서는 수막 B 세포가 두개골 골수에 의해 지속적으로 공급된다고 제안했다7. 최근에는 거미막 출구(arachnoid cuff exit, ACE)라고 불리는 새로운 구조가 면역 세포 이동을 위한 경막과 뇌 사이의 직접 관문으로 확인되었다8.
이러한 흥미로운 발견은 면역 세포가 손상된 뇌에 침투하는 기원(예: 허혈성 뇌졸중 후)에 중요한 의미를 갖습니다. 뇌졸중 후 많은 면역 세포가 뇌에 침투하여 급성 뇌 손상과 만성 뇌 회복에 기여한다는 많은 증거가 있습니다. 일반적인 개념은 이러한 세포가 뇌에 침투하는 혈액 속의 순환 백혈구라는 것인데, 이는 주로 뇌졸중으로 인한 혈액-뇌 장벽 손상에 의해 촉진됩니다. 그러나 이 개념은 도전을 받고 있습니다. 한 연구에서 쥐의 두개골과 경골의 면역 세포는 다르게 표지되었으며, 뇌졸중 후 6 시간에는 두개골에서 호중구와 단핵구의 감소가 크게 발견되었습니다. 경골과 더 많은 두개골 유래 호중구가 허혈성 뇌에 존재했습니다. 이러한 데이터는 급성 뇌졸중 단계에서 허혈성 뇌의 호중구가 주로 두개골 골수에서 발생한다는 것을 시사한다4. 흥미롭게도 CSF가 이 마이그레이션을 안내할 수 있습니다. 실제로, 최근의 두 가지 보고에 따르면, 뇌척수액은 두개골 채널을 통해 뇌에서 두개골 골수로 신호 신호를 직접 전달할 수 있으며, 중추신경계 손상 후 두개골 골수에서 세포 이동과 조혈을 지시할 수 있습니다 9,10.
이러한 최근의 발견에 비추어 볼 때, 뇌 질환에 대한 면역 반응을 연구할 때 뇌와 두개골 골수의 면역 세포의 변화를 분석하는 것이 중요해졌습니다. 이러한 연구에서는 세포 분류, 유세포 분석 및 단일 세포 RNA 염기서열 분석(scRNA-seq)과 같은 다운스트림 분석을 위해 충분한 수의 고품질 면역 세포가 필요합니다. 여기에서 전반적인 목표는 뇌 조직과 두개골 골수에서 단세포 현탁액을 준비하기 위한 두 가지 최적화된 절차를 제시하는 것입니다. 두개골의 종골(전두골, 후두골 및 두정골)은 일반적으로 골수를 추출하는 데 사용되며, 이 골수는 이 연구에서 특별히 두개골 골수라고 합니다.

<table><tbody><tr><td>0.5 mL microcentrifuge tubes</td><td>VWR</td><td>76332-066</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td><td>VWR</td><td>76332-068</td><td></td></tr><tr><td>15 mL conical tubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339651</td><td></td></tr><tr><td>18 G x 1 in BD PrecisionGlide Needle</td><td>BD Biosciences</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>1x HBSS</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical tubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339653</td><td></td></tr><tr><td>96-well V-bottom microplate&nbsp;</td><td>SARSTEDT</td><td>82.1583</td><td></td></tr><tr><td>AURORA&nbsp; flow cytometer</td><td>Cytek bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fisher</td><td>BP9706-100</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-AF594</td><td>BioLegend</td><td>101254</td><td>1:500 희석</td></tr><tr><td>CD19-BV785</td><td>BioLegend</td><td>115543</td><td>1:500 희석</td></tr><tr><td>CD19-FITC</td><td>BioLegend</td><td>115506</td><td>1:500 희석</td></tr><tr><td>CD3-APC</td><td>BioLegend</td><td>100312</td><td>1:500 희석</td></tr><tr><td>CD3-PE</td><td>BioLegend</td><td>100206</td><td>1:500 희석</td></tr><tr><td>CD45-Alex 700</td><td>BioLegend</td><td>103128</td><td>1:500 희석</td></tr><tr><td>CD45-BV421</td><td>Biolegend</td><td>103133</td><td>1:500 희석</td></tr><tr><td>Cell Strainer 70 um</td><td>Avantor</td><td>732-2758</td><td></td></tr><tr><td>Dressing Forceps&nbsp;</td><td>V. Mueller</td><td>NL1410</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>Fc Block</td><td>Biolegend</td><td>101320</td><td>1:100 희석</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Roboz</td><td>RS-5047</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N7167</td><td>1:500 희석</td></tr><tr><td>Ly6G-BV421</td><td>BioLegend</td><td>127628</td><td>1:500 희석</td></tr><tr><td>Ly6G-PerCp-cy5.5</td><td>BioLegend</td><td>127615</td><td>1:500 희석</td></tr><tr><td>NK1.1-APC-cy7</td><td>BioLegend</td><td>108723</td><td>1:500 희석</td></tr><tr><td>Percoll (density gradient medium)</td><td>Cytiva</td><td>17089101</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffer saline (10x)</td><td>Gibco</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>RBC Lysis Buffer (10x)</td><td>BioLegend</td><td>420302</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td>SKLAR</td><td>64-1250</td><td></td></tr><tr><td>WHEATON Dounce Tissue, 15 mL Size</td><td>DWK Life Sciences</td><td>357544</td><td></td></tr></tbody></table>

생쥐의 뇌와 두개골에서 면역 세포 분리

Isolating Immune Cells from Mouse Brain and Skull

뇌 질환(예: 뇌 허혈 및 자가면역 뇌척수염)에 의해 유발되는 면역 반응이 뇌뿐만 아니라 두개골에서도 발생한다는 증거가 늘어나고 있습니다. 뇌 손상(예: 뇌졸중) 후 뇌와 두개골 골수에서 면역 세포 집단의 변화를 분석하기 위한 핵심 단계는 다운스트림 분석을 위한 충분한 수의 고품질 면역 세포를 얻는 것입니다. 여기에서는 뇌와 두개골 골수에서 면역 세포를 분리하기 위한 두 가지 최적화된 프로토콜이 제공됩니다. 두 프로토콜의 장점은 단순성, 속도 및 많은 양의 생존 가능한 면역 세포를 생성하는 효능에 반영됩니다. 이러한 세포는 세포 분류, 유세포 분석 및 전사체 분석과 같은 다양한 다운스트림 응용 분야에 적합할 수 있습니다. 프로토콜의 효과를 입증하기 위해 유세포 분석을 사용하여 뇌졸중 뇌와 정상 뇌 두개골 골수에 대해 면역표현형 분석을 수행했으며, 결과는 발표된 연구의 결과와 일치했습니다.

쥐의 뇌 조직으로부터 면역 세포를 준비하기 위해, 프로토콜은 일반적으로 생존율이 높은 세포를 생성합니다(84.1% ± 2.3%[평균 ± SD]). 이 세포의 약 70%-80%는 CD45 양성입니다. 정상적인 쥐의 뇌에서는 거의 모든 CD45+ 세포가 예상대로 미세아교세포(CD45LowCD11b+)입니다. 이 프로토콜은 유세포 분석 분석, 형광 활성화 세포 분류(FACS) 및 scRNA-seq 분석을 포함한 다양한 응용 분야의 실험실에서 사용되었습니다. 예를 들어, 유세포 분석은 스트로크 모델에서 수행되었습니다(그림 3). 마우스는 과도 뇌졸중 모델, 30분 필라멘트 중뇌동맥 폐색(MCAO)14을 받았습니다. 뇌졸중 후 3일째 되는 날, 쥐의 뇌에서 세포를 준비하고 일반적인 면역 세포 표면 마커로 염색했습니다. 게이팅 전략은 그림 3A에 나와 있습니다. 선행 연구13,15와 일치하게, 동측 반구에서 CD45High 세포의 현저한 증가가 관찰되었으며(그림 3B,C), 이는 면역 세포가 뇌로 침투했음을 나타냅니다.
두개골 골수 프로토콜의 경우, 두개골 골수 세포(약 2 x 106 세포)의 상당한 수율이 우수한 생존율로 일관되게 달성되었습니다(93.8% ± 1.8% [평균 ± SD]). 예상대로 이러한 세포의 대부분은 CD45 양성입니다. 이 프로토콜의 유용성을 설명하기 위해 비교 연구를 수행하여 순진한 쥐의 대퇴골과 두개골 골수 모두에서 면역 세포 구성을 특성화했습니다(그림 4). 대표적인 그림에서 볼 수 있듯이, 대퇴골과 두개골 골수 사이의 면역 세포 조성은 유사했습니다(그림 4A,B). 흥미롭게도, 호중구의 빈도는 두개골보다 대퇴골에서 더 높은 것으로 보인다(그림 4C). 그러나 이 발견은 이 파일럿 연구에서 표본 크기가 작았기 때문에 추가 검증이 필요합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66861/66861fig01.jpg"> 그림 1: 뇌세포 분리 프로토콜 개요. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66861/66861fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66861/66861fig02.jpg"> 그림 2: 두개골 골수 세포 분리 프로토콜. (A) 절차 개요. (B) 두개골 절단에 권장되는 패턴. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66861/66861fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66861/66861fig03.jpg"> 그림 3: 뇌졸중 뇌의 면역 세포에 대한 대표적인 유세포 분석. (A) 게이팅 전략의 예. 이 그래프는 미세아교세포(CD45LowCD11b+), NK 세포(CD45HighNK1.1+), 호중구(CD45HighLy6G+), T 세포(CD45HighCD11b-CD3+) 및 B 세포(CD45HighCD11b-CD19+)와 같은 면역 세포 집단을 나타냅니다. 이 예는 뇌졸중 후 3일째에 동측 반구의 뇌 면역 세포를 분석한 것입니다. (나,씨) 면역 세포를 뇌졸중 뇌에 침투시킵니다. 젊은 수컷 마우스는 일시적인 중뇌동맥 폐색(MCAO)을 받았습니다. 3일째에는 뇌를 채취하여 왼쪽(반대측)과 오른쪽(동측) 반구로 나눴습니다. 뇌 세포는 기술된 프로토콜에 따라 준비된 후 유세포 분석을 실시하였다. 대표적인 플롯은 동측 반구로의 면역 세포 침투가 증가했음을 보여줍니다(CD45High cells; B). 정량적 데이터는 막대 그래프(C)에 표시됩니다. 세포 수는 유세포 분석 데이터에 기록된 세포 수와 부피를 기반으로 계산되었습니다. 데이터는 SEM± 평균으로 표시됩니다. *p < 0.05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66861/66861fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66861/66861fig04.jpg"> 그림 4: 두개골 골수 세포의 대표적인 유세포 분석. 비교를 위해 대퇴골의 골수 세포 분석이 포함되었습니다. 이 그래프는 NK 세포(CD45+NK1.1+), 호중구(CD45+CD11b+Ly6G+), T 세포(CD45+CD11b-CD3+) 및 B 세포(CD45+CD11b-CD19+)와 같은 면역 세포 집단을 나타냅니다. (A) 대퇴골 골수에 대한 대표 플롯. (B) 두개골 골수에 대한 대표 플롯. (C) 대퇴골과 두개골 골수 사이의 면역 세포 구성 비교. 데이터는 평균± SEM으로 표시됩니다. *p < 0.05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66861/66861fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

뇌 질환에 대한 면역 반응을 조사하기 위한 한 가지 일반적인 접근법은 면역 세포의 변화를 분석하는 것입니다. 여기에서는 쥐 뇌 조직과 두개골 골수에서 면역 세포를 분리하기 위한 두 가지 간단하고 효과적인 프로토콜이 제공됩니다.

Mounting evidence indicates that the immune response triggered by brain disorders (e.g., brain ischemia and autoimmune encephalomyelitis) occurs not only ...

우리의 연구는 허혈성 뇌졸중과 심장 마비로 인한 뇌 허혈에 따른 복잡한 면역 반응에 초점을 맞추고 있습니다. 뇌허혈은 뇌에 상주하는 면역세포의 활성화와 면역세포의 침투를 유발합니다. 그러나 이 면역 세포에 대한 우리의 이해는 여전히 제한적입니다.우리는 허혈 후 이 뇌세포의 면역 상태, 기원 및 기능적 역할을 해부하는 것을 목표로 합니다. 최근 연구는 손상 후 뇌의 면역 반응에서 두개골의 놀라운 역할을 강조합니다. 따라서 뇌허혈 후 뇌조직과 두개골 골수에서 발생하는 면역세포의 변화를 분석하는 것이 중요합니다.이를 위해 중요한 단계는 추가 분석을 위해 충분한 수의 고품질 면역 세포를 확보하는 것입니다. 당사의 프로토콜을 통해 연구자들은 뇌와 두개골 골수에서 사용 가능한 대량의 면역 세포를 신속하게 얻을 수 있습니다. 뇌 면역 세포 프로토콜은 전체적으로 낮은 온도에서 기계적 해리 접근법을 사용하여 전사 및 단백질체 프로필의 더 나은 보존을 보장합니다.두개골 골수 프로토콜은 간단하지만 두개골에서 골수 세포를 추출하는 데 효과적입니다. 우리는 뇌 허혈이 뇌 조직과 두개골의 면역 세포에 미치는 영향에 대한 포괄적인 연구를 계속할 것입니다. 신경염증이 허혈 후 뇌손상의 병태생리학에서 중요한 역할을 한다는 점을 감안할 때, 본 연구는 허혈성 뇌졸중 또는 심정지 후 뇌 보호를 위한 새로운 치료 표적을 발견할 수 있을 것으로 기대됩니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오에서는 밀도 구배 원심분리를 사용하여 마우스의 뇌에서 단핵 세포를 분리하는 작업을 수행합니다. 분리된 단핵 세포 현탁액은 추가 다운스트림 분석에 사용할 수 있습니다.

마우스 뇌에서 단핵 세포 분리: 뇌 상주 단핵 세포를 분리하기 위한 밀도 구배 원심분리 기술

이 비디오는 성인 쥐의 뇌 피질에서 미세아교세포를 분리하는 기술을 보여줍니다. 첫째, 피질은 뉴런과 다른 신경교세포를 제거하기 위해 세분화와 균질화를 거쳐 미세아교세포를 보존합니다. 그 후, 세포 현탁액은 항 미엘린 자기 마이크로비드와 자기장에 노출되어 미엘린 파편과 미엘린을 포함하는 세포에서 미세아교세포와 골수성 세포를 효과적으로 분리합니다.

성인 마우스 뇌의 피질에서 미세아교세포의 분리

이 비디오는 기계적 해리와 효소 분해를 사용하여 쥐의 뇌에서 종양에 침투하는 말초 혈액 단핵 세포를 분리하는 방법을 보여줍니다. 그 다음에는 추가 분석을 위해 면역 세포를 수집하기 위해 밀도 구배 원심분리가 수행됩니다.

쥐의 뇌에서 종양 침투 면역 세포 분리

이 비디오는 쥐의 뇌 조직에서 면역 세포의 단세포 현탁액을 준비하는 방법을 보여줍니다. 여기에는 뇌 조직에서 세포를 분리하기 위한 효소 소화와 밀도 구배 원심분리를 포함하여 밀도에 따라 면역 세포를 분리하여 단일 세포 현탁액을 얻습니다.

쥐 뇌 조직에서 면역 세포의 단세포 현탁액 준비

미세 아교 세포 생물학의 성공적인 조사에 하나의 키는 CNS의 조직으로부터 분리하는 동안 생체 미세 아교 immunofunction의 보존이다. 형광 이미징, 면역 세포 화학, 및 염증성 자극 지질 다당류 (LPS)와 팸 3 CSK 4 (팸)와 ELISA 다음 미세 아교 세포의 활성에 의해 평가 매우 순수하고 immunofunctional 세포 배양에 회전 흔들림 결과를 통해 미세 아교 세포를 분리.

쥐과 신생아에서 보존 면역 표현형과 기능으로 두피 소교 세포의 분리

뇌 미세혈관 내피 세포(BMEC)는 혈액과 중추신경계(CNS), 이른바 혈액-뇌-장벽(BBB)을 분리하는 고도로 조절되는 장벽을 형성하는 특정 접합 단백질에 의해 상호 연결되어 있습니다. 이 프로토콜에서 논의된 바와 같이 1차 쥐 뇌 미세혈관 내피 세포의 분리는 BBB의 상세한 체외 연구를 가능하게 합니다.

차 설치류 뇌 미세 혈관 내피 세포의 분리

염증은 허혈성 뇌졸중의 발병기전에서 중심적인 역할을 합니다. 점점 더 많은 증거에 따르면 그것은 초기 뇌 손상을 악화시키는 양날의 검으로 작용하지만 나중에 회복하는 데에도 기여합니다. 이 프로토콜은 허혈성 뇌에서 면역 세포를 분리하고 그에 따른 유세포 분석 표현형을 설명합니다.

허혈성 마우스 뇌에서 면역 세포의 분리 및 유세포 분석

우리는 성인 마우스 뇌 반구의 다른 해부 된 영역에서 microglia의 격리를위한 프로토콜을 제공하고, 전체 길이 전사체의 깊은 단일 세포 RNA 시퀀싱을위한 반자동 라이브러리 준비를 제공합니다. 이 방법은 건강과 질병에서 microglia의 기능적 이질성을 해명하는 데 도움이됩니다.

깊은 단세포 RNA 염기서열 분석에 대한 하나의 성인 마우스 뇌 반구에서 영역 별 Microglia의 격리

이 논문은 뇌, 척수 및 수막을 포함한 중추 신경계 내에서 상주 및 말초 유래 면역 세포를 검사하기 위한 두 가지 최적화된 프로토콜을 제시합니다. 이러한 각 프로토콜은 정상 상태 및 염증 조건에서 이러한 구획을 차지하는 세포의 기능과 구성을 확인하는 데 도움이 됩니다.

면역 세포의 다운스트림 분석을 위한 중추신경계 조직 및 관련 수막 분리

현재까지 동일한 마우스에서 모든 주요 중추 신경계 상주 세포 유형을 동시에 분리하기 위한 프로토콜은 충족되지 않은 수요입니다. 이 프로토콜은 신경 염증 중에 복잡한 세포 네트워크를 조사하고 동시에 필요한 마우스 수를 줄이기 위해 순진하고 실험적인 자가면역 뇌척수염 마우스에 적용할 수 있는 절차를 보여줍니다.

성인 자가면역 뇌척수염 마우스에서 주요 중추 신경계 상주 세포 유형의 동시 분리

우리는 상대적으로 짧은 시간에 MACS(magnetically activated cell sorting)를 사용하여 쥐의 시상하부(또는 이에 상응하는 작은 뇌 구조)에서 미세아교세포를 분리하는 프로토콜을 설명합니다. MACS 분류된 시상하부 미세아교세포는 체외 분석에 사용할 수 있으며 in vitro 분석을 수행하기 위해 도금할 수 있습니다.

Isolation of Hypothalamic Microglia from Freshly Perfused Adult Mouse Brain by Magnetic-Activated Cell Sorting  

배우세요 생쥐 뇌와 두개골 골수에서 면역 세포를 분리하는 효과적인 방법을. 이 기술은 뇌 허혈 후 면역 반응을 연구하고 신경염증의 치료 표적을 발굴하는 데 필수적인 도구를 제공합니다.

생쥐의 뇌와 두개골에서 면역 세포 분리

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