Name: 살아있는 세포에서 소포체-미토콘드리아 접촉을 측정하기 위한 Split-Luciferase 재조립 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-11T13:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: 배우세요 살아있는 세포에서 소포체-미토콘드리아 접촉을 측정하는 Split-Luciferase 재조립 분석법을 HEK293T 세포에 적용하는 방법을. 이 기술은 세포 건강과 신경퇴행성 질환 연구에 활용됩니다.

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<meta charset="utf8"></head><body>고처리량 스크리닝을 위한 ER-Mitochondria 접촉을 측정하기 위한 간단한 분석

<ol><li>Aoyama-Ishiwatari, S., Hirabayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum-mitochondria+contact+sites-emerging+intracellular+signaling+hubs%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum-mitochondria contact sites-emerging intracellular signaling hubs.</a> Front Cell Dev Biol. 9, 653828(2021).</li>
<li>Sassano, M. L., Felipe-Abrio, B., Agostinis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER-mitochondria+contact+sites%3B+a+multifaceted+factory+for+Ca2%2B+signaling+and+lipid+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">ER-mitochondria contact sites; a multifaceted factory for Ca2+ signaling and lipid transport.</a> Front Cell Dev Biol. 10, 988014(2022).</li>
<li>Scorrano, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coming+together+to+define+membrane+contact+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Coming together to define membrane contact sites.</a> Nat Commun. 10 (1), 1287(2019).</li>
<li>Voeltz, G. K., Sawyer, E. M., Hajnóczky, G., Prinz, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+the+connection%3A+How+membrane+contact+sites+have+changed+our+view+of+organelle+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Making the connection: How membrane contact sites have changed our view of organelle biology.</a> Cell. 187 (2), 257-270 (2024).</li>
<li>Paillusson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((There%27s+something+wrong+with+my+MAM%3B+the+ER-mitochondria+axis+and+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">There's something wrong with my MAM; the ER-mitochondria axis and neurodegenerative diseases.</a> Trends Neurosci. 39 (3), 146-157 (2016).</li>
<li>Sasi, U. S. S., Sindhu, G., Raj, P. S., Raghu, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+associated+membranes+%28MAMs%29%3A+emerging+drug+targets+for+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Mitochondria associated membranes (MAMs): emerging drug targets for diabetes.</a> Curr Med Chem. 27 (20), 3362-3385 (2019).</li>
<li>Joshi, A. U., Kornfeld, O. S., Mochly-Rosen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+entangled+ER-mitochondrial+axis+as+a+potential+therapeutic+strategy+in+neurodegeneration%3A+A+tangled+duo+unchained%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">The entangled ER-mitochondrial axis as a potential therapeutic strategy in neurodegeneration: A tangled duo unchained.</a> Cell Calcium. 60 (3), 218-234 (2016).</li>
<li>Moltedo, O., Remondelli, P., Amodio, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondria-endoplasmic+reticulum+contacts+and+their+critical+role+in+aging+and+age-associated+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The mitochondria-endoplasmic reticulum contacts and their critical role in aging and age-associated diseases.</a> Front Cell Dev Biol. 7, 172(2019).</li>
<li>Rieusset, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+endoplasmic+reticulum-mitochondria+contact+sites+in+the+control+of+glucose+homeostasis%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">The role of endoplasmic reticulum-mitochondria contact sites in the control of glucose homeostasis: an update.</a> Cell Death Dis. 9 (3), 388(2018).</li>
<li>Bouguerra, M. D., Lalli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER-mitochondria+interactions%3A+Both+strength+and+weakness+within+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Mol+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">ER-mitochondria interactions: Both strength and weakness within cancer cells.</a> Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1866 (4), 650-662 (2019).</li>
<li>Tepikin, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+junctions+with+cellular+organelles%3A+Ca2%2B+signalling+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Arch%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial junctions with cellular organelles: Ca2+ signalling perspective.</a> Pflügers Arch. 470 (8), 1181-1192 (2018).</li>
<li>Masson, G. L., Przedborski, S., Abbott, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+computational+model+of+motor+neuron+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A computational model of motor neuron degeneration.</a> Neuron. 83 (4), 975-988 (2014).</li>
<li>Giamogante, F., Barazzuol, L., Brini, M., Calì, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER-mitochondria+contact+sites+reporters%3A+strengths+and+weaknesses+of+the+available+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">ER-mitochondria contact sites reporters: strengths and weaknesses of the available approaches.</a> Int J Mol Sci. 21 (21), 8157(2020).</li>
<li>Rizzuto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Close+contacts+with+the+endoplasmic+reticulum+as+determinants+of+mitochondrial+Ca2%2B+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Close contacts with the endoplasmic reticulum as determinants of mitochondrial Ca2+ responses.</a> Science. 280 (5370), 1763-1766 (1998).</li>
<li>Valm, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applying+systems-level+spectral+imaging+and+analysis+to+reveal+the+organelle+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Applying systems-level spectral imaging and analysis to reveal the organelle interactome.</a> Nature. 546 (7656), 162-167 (2017).</li>
<li>Csordás, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+interorganelle+contacts+and+local+calcium+dynamics+at+the+ER-mitochondrial+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Imaging interorganelle contacts and local calcium dynamics at the ER-mitochondrial interface.</a> Mol Cell. 39 (1), 121-132 (2010).</li>
<li>Cieri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPLICS%3A+a+split+green+fluorescent+protein-based+contact+site+sensor+for+narrow+and+wide+heterotypic+organelle+juxtaposition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">SPLICS: a split green fluorescent protein-based contact site sensor for narrow and wide heterotypic organelle juxtaposition.</a> Cell Death Differ. 25 (6), 1131-1145 (2018).</li>
<li>Kakimoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+multiple+inter-organelle+contact+sites+using+the+organelle-+targeted+split-GFP+system%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Visualizing multiple inter-organelle contact sites using the organelle- targeted split-GFP system.</a> Sci Rep. 8 (1), 6175(2018).</li>
<li>Wu, M. M., Covington, E. D., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+of+diffusion+and+trapping+of+STIM1+and+Orai1+at+ER-plasma+membrane+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis of diffusion and trapping of STIM1 and Orai1 at ER-plasma membrane junctions.</a> Mol Biol Cell. 25 (22), Mac.E14-06-1107 (2014).</li>
<li>Csordas, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+features+and+significance+of+the+physical+linkage+between+ER+and+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural and functional features and significance of the physical linkage between ER and mitochondria.</a> J Cell Biol. 174 (7), 915-921 (2006).</li>
<li>de Brito, O. M., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitofusin+2+tethers+endoplasmic+reticulum+to+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mitofusin 2 tethers endoplasmic reticulum to mitochondria.</a> Nature. 456 (7222), 605-610 (2008).</li>
<li>Kremer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+3D+SEM+in+a+broad+biological+context%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Developing 3D SEM in a broad biological context.</a> J Microsc. 259 (2), 80-96 (2015).</li>
<li>Söderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nat Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).</li>
<li>Lim, Y., Cho, I. -T., Rennke, H. G., Cho, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B22-adrenergic+receptor+regulates+ER-mitochondria+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">β2-adrenergic receptor regulates ER-mitochondria contacts.</a> Sci Rep. 11 (1), 21477(2021).</li>
<li>Lam, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+APEX2+for+electron+microscopy+and+proximity+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling.</a> Nat Methods. 12 (1), 51-54 (2014).</li>
<li>Cho, I. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascorbate+peroxidase+proximity+labeling+coupled+with+biochemical+fractionation+identifies+promoters+of+endoplasmic+reticulum-mitochondrial+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Ascorbate peroxidase proximity labeling coupled with biochemical fractionation identifies promoters of endoplasmic reticulum-mitochondrial contacts.</a> J Biol Chem. 292 (39), 16382-16392 (2017).</li>
<li>Lim, Y., Cho, I. -T., Schoel, L. J., Cho, G., Golden, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hereditary+spastic+paraplegia-linked+REEP1+modulates+endoplasmic+reticulum%2Fmitochondria+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Hereditary spastic paraplegia-linked REEP1 modulates endoplasmic reticulum/mitochondria contacts.</a> Ann Neurol. 78 (5), 679-696 (2015).</li>
<li>Arnold, T. R., Stephenson, R. E., Miller, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+GTPases+and+actomyosin%3A+Partners+in+regulating+epithelial+cell-cell+junction+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Rho GTPases and actomyosin: Partners in regulating epithelial cell-cell junction structure and function.</a> Exp Cell Res. 358 (1), 20-30 (2017).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1.7 mL SafeSeal 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Sorenson</td><td>16070</td><td></td></tr><tr><td>6-웰 플레이트 TC Treated</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-7506</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 피펫 팁 OneTip</td><td>USA Scientific</td><td>1110-3700</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu; L 피펫 팁 OneTip</td><td>USA Scientific</td><td>1110-3700</td><td></td></tr><tr><td>20-200 &mu; L 베벨 팁 OneTip</td><td>USA Scientific</td><td>1111-1210</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 폴리프로필렌 원추형 튜브</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>96-Well Flipper 마이크로튜브 랙</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>8770-11</td><td></td></tr><tr><td>96-웰 플레이트 TC 처리&nbsp;</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-7596</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 20 mm TC 처리 접시</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-3394</td><td></td></tr><tr><td>1250 &mu; L 팁</td><td>OneTip USA Scientific</td><td>1112-1720</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 5910&nbsp; Ri - 냉장 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5943000131</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide, 무수, &ge; 99.9%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855-100ML</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, 고포도</td>당 <td>ThermoFisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>EHop 016</td><td>Bio-Techne Tocris</td><td>6248</td><td>DMSO에 용해; -70°C에서 보관 & C</td></tr><tr><td>EnduRen Live Cell Substrate</td><td>Promega</td><td>E6481</td><td>-70 &deg에서 부분 표본 저장; C</td></tr><tr><td>에펜도르프 2-20 &mu; L 피펫</td><td>Eppendorf</td><td>3123000039</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus 100-1000 &mu; L 피펫</td><td>Eppendorf</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research Plus 1-10 &micro; L 피펫</td><td>Eppendorf</td><td>3123000020</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus 12채널</td><td>Eppendorf</td><td>3125000028</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus 200 &mu; L 피펫</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td></td><td></td>3123000055</tr><tr><td>태아 소 혈청, 인증, USDA 승인 지역</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>Forma Steri-Cycle CO2&nbsp; 인큐베이터, 184 L, 광택 스테인리스강</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>381</td><td></td></tr><tr><td>핸드 탈리 카운터</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HS6594</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293T 셀</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>혈구계 - Neubauer Bright Line, 이중 계수 챔버</td><td>LW Scientific</td><td>CTL-HEMM-GLDR</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen TE 버퍼</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>8019005</td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 25 CFL</td><td></td></tr><tr><td>미니 원심분리기</td><td>벤치마크 Scientific</td><td>C1012</td><td></td></tr><tr><td>50ml 원뿔형, 15ml 원뿔형 및 마이크로 원심분리기 튜브용 멀티 튜브 랙</td><td>Boekel Scientific</td><td>120008</td><td></td></tr><tr><td>PEI MAX - 트랜스펙션 등급 선형 폴리에틸렌이민 염산염(MW 40,000)</td><td>Polysciences</td><td>24765-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Aid XP</td><td>USA Scientific</td><td>4440-0101</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine hydrobromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Rhosin hydrochloride</td><td>Bio-Techne Tocris</td><td>5003</td><td>DMSO에 용해; -70°C에서 보관; C</td></tr><tr><td>트립신-EDTA(0.05%), 페놀 레드</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Varioskan LUX 멀티모드 마이크로플레이트 리더</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>VL0000D0</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>2215365</td><td>레벨 8</td></tr><tr><td>VWR 진공 흡인 시스템</td><td>VWR</td><td>75870-734</td><td></td></tr><tr><td>ZCL 278</td><td>Bio-Techne Tocris</td><td>4794</td><td>DMSO에 용해; -70 &deg에 저장; 씨</td></tr></tbody></table>

살아있는 세포에서 소포체-미토콘드리아 접촉을 측정하기 위한 split-luciferase 재조립 분석

Split-Luciferase Reassembly Assay to Measure Endoplasmic Reticulum-Mitochondria Contacts in Live Cells

우리는 위에서 설명한 프로토콜을 사용하여 특정 GTPase를 억제하는 것으로 알려진 세 가지 화합물을 추가할 때 ER-미토콘드리아 접촉 수준을 측정했습니다. CDC42, RHO 및 RAC는 활성화될 때 액틴 중합(28)을 촉진하고 각각 ZCL278, Rhosin 및 Ehop-016에 의해 억제되는 GTPase입니다(24). split-Rluc로 형질주입된 HEK293T 세포를 DMSO(대조군), ZCL278(50μM), Rhosin(50μM) 또는 Ehop-016(25μM)으로 처리하고 1시간, 2시간, 5시간 동안 배양했습니다. 플레이트 리더를 사용하여 정의된 시점에서 split-Rluc 활성을 측정했습니다(그림 2).
로신(RHO GTPase inhibitor) 처리된 세포는 처리한 1시간, 2시간, 5시간에서 대조군 DMSO 처리된 세포에 비해 루시페라아제 활성에 유의한 변화가 없었습니다(p &gt; 0.9999, p= 0.6956, p &gt; 0.9999)(그림 2). 이러한 결과는 로신이 ER-미토콘드리아 접촉에 영향을 미치지 않는다는 것을 보여주며, 이는 두 소기관 사이의 접촉을 조절하는 데 RHO GTPase 활성이 관여하지 않음을 시사합니다.
이에 반해 RAC GTPase 억제제인 Ehop-016은 치료 후 1시간, 2시간, 5시간에서 DMSO보다 루시페라아제 활성이 유의하게 낮았다(p=0.0106, p=0.0009, p=0.0024)(그림 2). 이러한 데이터는 세포에서 정상적인 ER-미토콘드리아 상호 작용을 유지하기 위해 RAC GTPase 활성이 필요하다는 것을 나타냅니다.
마지막으로, CDC42 억제제 ZCL278은 루시페라아제 활성에서 가장 급격한 변화를 보였습니다(그림 2). ZCL278 처리된 세포는 대조군 DMSO에 비해 루시페라아제 활성이 유의하게 감소했으며, 3개 시점 모두에서 가장 낮은 p-값을 보였으며, 전체적으로 p &lt; 0.0001을 유지했습니다. 당사의 데이터는 CDC42 GTPase 활성이 ZCL278에 의해 차단될 때 ER-미토콘드리아 결합의 강력한 억제를 보여주며, 이는 split-luciferase의 각 절반을 별도로 인코딩하는 두 개의 벡터와 co-transfection된 세포에서 수행된 원래의 split-Rluc 분석을 사용한 이전 보고서와 일치합니다24.
ZCL278의 놀라운 결과를 감안할 때, 특히 다른 GTPase 억제제와 비교할 때 ZCL278 활성은 DMSO 대조군에 대해 다양한 농도[0.5μM, 5μM, 50μM]에서 추가로 테스트되었습니다. 처리 후 1시간, 2시간, 5시간에 측정된 루시페라아제 활성은 용량 의존적 반응을 보였다; ZCL278의 0.5μM은 루시페라아제 활성에 가장 약한 영향을 미친 반면, 5μM은 더 강했고, 50μM은 재구성된 효소 활성에서 가장 강한 감소를 보였습니다(그림 3). 이러한 결과를 종합해 볼 때, ZCL278은 용량 의존적 방식으로 split-Rluc 활성을 하향 조절하며, 시간이 지남에 따라 더 높은 농도의 ZCL278(CDC42 억제제)은 낮은 농도에 비해 대조군 DMSO에 비해 여전히 유의한 변화를 보입니다.
split-Rluc assay를 검증하는 방법으로 PLA(Proximity ligation assay), TEM(transmission electron microscopy) 및 미토콘드리아 칼슘 흡수 모니터링과 같은 잘 정립된 독립 분석을 수행할 수 있습니다(그림 4 및 데이터는 표시되지 않음)24. ER-미토콘드리아 접촉 프로모터에 대한 스크리닝에서 확인된 화합물 중 하나인 β2 아드레날린성 수용체 작용제인 이소프로테레놀(그림 4A)을 사용하여 PLA 신호 강도의 변화와 미토콘드리아 칼슘 흡수의 변화로 입증된 바와 같이 이소프로테레놀 처리 시 split-Rluc의 루시페라아제 활성이 증가했음을 확인했습니다(그림 4B-E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66862/66862fig01.jpg"> 그림 1: split-Rluc 재조립 분석. (A) Split-RLuc 분석의 개략도. 미토콘드리아와 소포체 사이에 막 접촉이 없는 경우 Mito-R lucN과 RlucC-ER이 상호 작용하지 못하므로 Rluc8 활성이 없습니다. 그러나 ER과 미토콘드리아 막이 접촉하는 Mito-R lucN과 RlucC-ER 사이의 상호 작용은 기질의 발광 전환에 의해 감지되는 완전한 효소 활성을 초래합니다. (B) split-Rluc DNA 구조체(pCAG-MitoRluc N-T2A-R lucCER-IRES-mCherry)의 개략도. (C) HEK293T 세포에서 split-Rluc 분석을 위한 워크플로우 다이어그램. 약어: 미토 = 미토콘드리아; ER = 소포체; IRES, 내부 리보솜 진입 부위; rb_glob pA, 토끼 베타-글로빈 폴리 아데닐화 신호; T2A, Thosea asigna 바이러스의 자가 절단 펩타이드 2A 염기서열. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66862/66862fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66862/66862fig02.jpg"> 그림 2: GTPase 억제제로 처리된 세포의 ER-Mito 접촉 수준에 해당하는 split-R luc 활성. (A-C) DMSO(대조군), Rhosin[50μM], Ehop-016[25μM] 또는 ZCL278[50μM] 처리 후 (A) 1시간, (B) 2시간 또는 (C) 5시간(각 그룹에 대해 n = 12)에서 재구성된 루시페라아제 활성. 모든 데이터는 다중 비교와 함께 일원 분산 분석을 사용하여 분석되었습니다. P 값은 p &gt; 0.05 (ns), p ≤ 0.05 (*), p ≤ 0.01 (**), p ≤ 0.001 (***), p ≤ 0.0001 (****)로 보고됩니다. 오차 막대는 측정의 평균 ± 표준 오차를 나타냅니다. 약어: 미토 = 미토콘드리아; ER = 소포체; RLU = 상대 조명 단위. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66862/66862fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66862/66862fig03.jpg"> 그림 3: ZCL278로 처리된 세포에서 ER-Mito 접촉 수준을 측정하는 split-R luc 활성.(A-C) [0.5 μM], [5 μM] 또는 [50 μM] 농도(각 그룹에 대해 n = 12)에서 DMSO(대조군) 또는 ZCL278 후 (A) 1시간, (B) 2시간 또는 (C) 5시간에서 재구성된 루시페라아제 활성. 모든 데이터는 다중 비교와 함께 일원 분산 분석을 사용하여 분석되었습니다. P 값은 p &gt; 0.05 (ns), p ≤ 0.05 (*), p ≤ 0.01 (**), p ≤ 0.001 (***), p ≤ 0.0001 (****)로 보고됩니다. 오차 막대는 측정의 평균 ± 표준 오차를 나타냅니다. 약어: 미토 = 미토콘드리아; ER = 소포체; RLU = 상대 조명 단위. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66862/66862fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66862/66862fig04.jpg"> 그림 4: split-Rluc 분석의 검증. (A) ER-미토콘드리아 접촉 프로모터에 대한 화합물 스크리닝에서 확인된 이소프로테레놀을 포함한 11가지 약물로 HEK293T 세포를 처리한 후 split-Rluc 활성의 정량화의 예. (B) DMSO 또는 이소프로테레놀(1μM)로 처리된 HeLa 세포의 근접 결찰 분석의 예. PLA 신호(빨간색)는 ER과 Mito 사이의 긴밀한 접촉을 나타냅니다. Sec61-GFP(녹색): ER 라벨링; DAPI(파란색): 핵. (C) A에서 PLA 신호의 정량화 (n = 각각 77-97 개의 세포를 사용한 4 회 실험; Mann-Whitney 테스트). (D) 히스타민(100μM)에 반응하는 미토콘드리아 칼슘 흡수. Mito-R-GECO1 형광 강도 변화(여러 HeLa 세포에 대한 평균)는 DMSO 또는 이소프로테레놀 처리된 세포에서 2.5초마다 표시되었습니다. 화살표는 히스타민 첨가를 나타냅니다. (E) 왼쪽: A에서 미토콘드리아 칼슘 흡수의 최대 피크. 쌍을 이루지 않은 양측 t-검정(n = 10, DMOS; 14, 이소프로테레놀). 오른쪽: 미토콘드리아 칼슘 흡수율( A와 같이, 7.5-12.5초). Mann-Whitney 테스트(n = 12, DMSO; 11, 이소프로테레놀). 이 그림은 Lim et al.24에서 수정되었습니다. 약어: RLU = 상대 광 단위; PLA = 근접 결찰 분석. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66862/66862fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 1: ER-미토콘드리아 접촉에 대한 현재 기술 요약. 각 방법의 장점과 제한 사항 목록입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66862/66862_R2_updated_Table1.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 1: pCAG-MitoRluc N-T2A-R lucCER-IRES-mCherry의 DNA 서열(PDF 및 GBK 형식)을 포함하는 Zip 파일. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66862/66862_R3_plasmidDNAsequence.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
추가 그림 S1: pCAG-MitoRluc N-T2A-R lucCER-IRES-mCherry의 지도. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66862/66862_Supplemental%20Figure%201_PlasmidMap_PrimerSequence_.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

살아있는 세포에서 소포체-미토콘드리아 접촉을 측정하기 위한 Split-Luciferase 재조립 분석

Endoplasmic reticulum (ER)-mitochondria contact sites play a critical role in cell health and homeostasis, such as the regulation of Ca2+ and lipid ...

split-luciferase-reassembly-assay-to-measure-endoplasmic-reticulum

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

여기, 우리는 Promega에서 듀얼 GloTM 루시페라제 분석 시스템을 사용 루시페라제 기반 리포터 유전자 접근 방식과 phagocytosis 유발 유전자 발현의 변화를 공부하고 절차를 설명합니다.

루시페라제 기반 리포터 유전자 분석과 함께 막 Biogenesis 유학

이 동영상은 단백질-단백질 상호 작용을 검출하기 위한 분할 루시페라제 보체 분석을 보여줍니다. 이 분석법에서 관심 단백질은 루시페라아제 효소의 작은 단편과 큰 단편에 태그가 지정됩니다. 단백질이 상호 작용할 때 큰 조각과 작은 조각이 결합하여 활성 효소 복합체를 형성하며, 특정 기질이 존재할 때 측정할 수 있는 밝은 발광을 방출합니다.

특정 단백질-단백질 상호작용을 식별하기 위한 Split Luciferase Complementation Assay

세포 프로세스의 시스템 수준의 이해를 달성하는 것은 현대 세포 생물학의 목표입니다. 우리는 여기에서 다양한 세포 기능의 다중 루시 페라 제 기자에 대한 전략을 설명하는 엔드 포인트 게놈 규모의 RNAi 라이브러리를 사용하여 유전자 기능을 심문.

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의 모니터링 단백질 접힘에 대한 결합 분석 실험<em&gt; 사카 cerevisiae의</em

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배양 된 세포의 소포체 하위 도메인의 시각화

단백질 사이의 상호 작용은 모든 세포 과정에 기본적이다. 생물 발광 공명 에너지 전달을 사용하여, 단백질의 쌍 사이의 상호 작용이 생균에 실시간으로 모니터링 할 수있다. 또한, 병원성 돌연변이의 효과가 평가 될 수있다.

생물 발광 공명 에너지 전달을 이용하여 살아있는 세포에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 조사

여기, 우리는 고정 된 세포에서 소포체와 미토콘드리아의 내생 적 상호 작용을 시각화하고 고감도로 정량화 할 수있는 절차를 설명합니다. 프로토콜은이 미토콘드리아 관련 막 계면에서 이노시톨에게 1,4,5- 트리 포스페이트 수용체 / 혈당 조절 단백질 75 / 전압 가변 음이온 채널 / 시클로 필린의 D 복합체 타겟팅 시츄 근접 결찰 분석법 최적화 기능.

소포체와 미토콘드리아의 상호 작용의 연구에 의해<em&gt; 현장에서</em&gt; 근접 내고 분석 고정 세포의

여기에 제시된 프로토콜은 분할 루시퍼라제 보체 분석의 가장 최근의 변이체를 사용하여 살아있는 포유동물 세포에서 세포질적으로 노출된 N- 및/또는 C-테르미니와 골지-상주 III형 막 단백질 사이의 이종 상호작용의 발생을 입증하기 위한 것이다.

스플릿 루시퍼라아제 보체 분석을 사용하여 골지-레지던트 타입 III 막 단백질에 의해 형성된 이종 복합체의 시연

막 접촉 부위(MCS)를 연구하기 위한 새로운 접근법의 필요성은 이러한 세포 구조와 그 구성 요소 연구에 대한 관심이 증가함에 따라 증가했습니다. 여기에서는 MCS에 상주하는 세포 소기관 내 및 세포 기관 간 단백질 복합체를 식별하고 정량화하기 위해 이전에 사용 가능한 현미경 기술을 통합하는 프로토콜을 제시합니다.

근접 결찰 분석에 의한 ER-미토콘드리아 접촉 부위에서 내인성 세포 기관 내 단백질 상호 작용의 시각화 및 정량화

이 프로토콜은 살아있는 세포에서 14-3-3 단백질과 CRAF 키나아제의 상호 작용을 측정하기 위한 BRET 기반 분석을 설명합니다. 이 프로토콜은 셀 준비, BRET 배출량 판독 및 데이터 분석을 위한 단계를 간략하게 설명합니다. 적절한 대조군을 식별하고 분석 최적화를 위한 문제 해결을 위한 결과의 예도 제시됩니다.

살아있는 세포에서 14-3-3 단백질과 CRAF의 상호 작용을 측정하기 위한 생물발광 공명 에너지 전달(BRET) 기반 분석

배우세요 살아있는 세포에서 소포체-미토콘드리아 접촉을 측정하는 Split-Luciferase 재조립 분석법을 HEK293T 세포에 적용하는 방법을. 이 기술은 세포 건강과 신경퇴행성 질환 연구에 활용됩니다.

살아있는 세포에서 소포체-미토콘드리아 접촉을 측정하기 위한 Split-Luciferase 재조립 분석

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