Name: 돌연변이 전체 마우스 배아의 단일 세포 RNA 염기서열 분석: epiblast에서 gastrulation 말기까지 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-14T14:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: 배우세요 마우스 배아 원형질층에서 원장형성 말기까지 단일 세포 RNA 염기서열 분석 방법을. 돌연변이 계통 연구와 조기 세포 운명 결정 메커니즘 규명에 활용할 수 있습니다.

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염기서열 분석 실험에 대한 기술 지원을 아끼지 않은 Fox Chase Cancer Center의 유전체학 핵심과 Dr. Johnathan Whetstine의 실험실 구성원인 Zach Gray, Madison Honer, Benjamin Ferman에게 감사드립니다. 우리는 Estaras 박사와 단일 세포 연구의 초기 분석에 기여한 순환 대학원생인 Alex Morris의 실험실 구성원에게 감사드립니다. 이 작업은 NIH 보조금 R01HD106969 및 Conchi Estaras에 대한 R56HL163146 자금을 지원합니다. 또한 Elizabeth Abraham은 T32 교육 보조금 5T32HL091804-12의 지원을 받았습니다.

Single-Cell Sequencing을 위한 Gastrulating Mouse embryo의 분리 및 유전형 분석

<ol><li>Arias, A. M., Marikawa, Y., Moris, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastruloids%3A+Pluripotent+stem+cell+models+of+mammalian+gastrulation+and+embryo+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Gastruloids: Pluripotent stem cell models of mammalian gastrulation and embryo engineering.</a> Dev Biol. 488, 35-46 (2022).</li>
<li>Kim, Y., Kim, I., Shin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+era+of+stem+cell+and+developmental+biology%3A+from+blastoids+to+synthetic+embryos+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">A new era of stem cell and developmental biology: from blastoids to synthetic embryos and beyond.</a> Exp Mol Med. 55 (10), 2127-2137 (2023).</li>
<li>Pijuan-Sala, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+molecular+map+of+mouse+gastrulation+and+early+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A single-cell molecular map of mouse gastrulation and early organogenesis.</a> Nature. 566 (7745), 490-495 (2019).</li>
<li>Mittnenzweig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-embryo%2C+single-cell+time-resolved+model+for+mouse+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A single-embryo, single-cell time-resolved model for mouse gastrulation.</a> Cell. 184 (11), E22 P2825-P2842 (2021).</li>
<li>Bardot, E. S., Hadjantonakis, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+gastrulation%3A+Coordination+of+tissue+patterning%2C+specification+and+diversification+of+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Mouse gastrulation: Coordination of tissue patterning, specification and diversification of cell fate.</a> Mech Dev. 163, 103617(2020).</li>
<li>Argelaguet, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-omics+profiling+of+mouse+gastrulation+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multi-omics profiling of mouse gastrulation at single-cell resolution.</a> Nature. 576 (7787), 487-491 (2019).</li>
<li>Chan, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+recording+of+mammalian+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular recording of mammalian embryogenesis.</a> Nature. 570 (7759), 77-82 (2019).</li>
<li>Mohammed, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+landscape+of+transcriptional+heterogeneity+and+cell+fate+decisions+during+mouse+early+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Single-cell landscape of transcriptional heterogeneity and cell fate decisions during mouse early gastrulation.</a> Cell Rep. 20 (5), 1215-1228 (2017).</li>
<li>Lescroart, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+earliest+step+of+cardiovascular+lineage+segregation+by+single-cell+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Defining the earliest step of cardiovascular lineage segregation by single-cell RNA-seq.</a> Science. 359 (6380), 1177-1181 (2018).</li>
<li>Scialdone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+early+mesoderm+diversification+through+single-cell+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Resolving early mesoderm diversification through single-cell expression profiling.</a> Nature. 535 (7611), 289-293 (2016).</li>
<li>Chromium Next GEM single cell 3' reagent kits v3.1: User guide. 10X Genomics. , Available from: 
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<li>NextSeq 1000/2000 Sequencing v2.0 Protocol. Illumina. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://support-docs.illumina.com/SW/ClarityLIMS-INT/Content/SW/ClarityLIMS/Integrations/NextSeq10002000Intv20Config.htm">https://support-docs.illumina.com/SW/ClarityLIMS-INT/Content/SW/ClarityLIMS/Integrations/NextSeq10002000Intv20Config.htm</a> (2024).</li>
<li>Dai, H. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TET-mediated+DNA+demethylation+controls+gastrulation+by+regulating+Lefty-Nodal+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TET-mediated DNA demethylation controls gastrulation by regulating Lefty-Nodal signalling.</a> Nature. 538, 528-532 (2016).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((editing-mediated+one-step+inactivation+of+the+Dnmt+gene+family+reveals+critical+roles+of+DNA+methylation+during+mouse+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">editing-mediated one-step inactivation of the Dnmt gene family reveals critical roles of DNA methylation during mouse gastrulation.</a> Nat Commun. 14 (1), 2922(2023).</li>
<li>Saga, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MesP1+is+expressed+in+the+heart+precursor+cells+and+required+for+the+formation+of+a+single+heart+tube%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">MesP1 is expressed in the heart precursor cells and required for the formation of a single heart tube.</a> Development. 126 (15), 3437-3447 (1999).</li>
<li>Ziegenhain, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+single-cell+RNA+sequencing+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods.</a> Mol Cell. 65 (4), 631-643 (2017).</li>
</ol>

저자는 밝힐 것이 없습니다.

이 논문에서는 gastrulating mouse embryos에서 고품질 single-cell 및 nuclei suspensions를 얻기 위한 강력한 파이프라인을 제시하며, 특히 초기 개발에서 cell-fate 사양 메커니즘에 대한 연구를 용이하게 하도록 설계되었습니다. 이 방법은 성별 또는 체세포 유전자와 같은 유전자형이 필요한 배아의 분석을 최적화하여 위형성 분야의 중요한 격차를 해결합니다. 이 파이프라인은 유전적 돌연변이 마우스 모델을 활용하고 전체 마우스 배아에 고분해능 단세포 시퀀싱을 사용함으로써 초기 마우스 위스트룰라의 유전자 발현 프로필에 대한 이해를 더욱 높일 수 있습니다. 이 방법은 Cre 재조합 효소 시스템에 의한 유전자 돌연변이 마우스 모델을 사용하여 단일 세포 오믹스를 위한 초기 발달 시점에서 고품질 세포와 핵을 얻을 수 있는 가능성을 보여줍니다. 이 방법은 여러 번의 시도를 통해 발전했으며, 이 기간 동안 샘플은 라이브러리 준비 및 염기서열분석에 필요한 품질 표준을 충족하지 못했습니다. 설명된 방법론은 (1) 배아 수를 늘리기 위한 동기화된 시간 임신, (2) 동결/해동을 방지하기 위한 당일 유전형 분석, (3) 죽어가는 세포의 염기서열 분석을 피하기 위한 세포/핵 생존력 평가의 세 가지 중요한 단계의 최적화를 통해 E8보다 어린 배아에서 충분한 세포/핵을 생성합니다. 이 프로토콜은 단일 세포 RNASeq로 성공적인 결과를 제공하지만, 이 프로토콜에서 얻은 세포 또는 핵 현탁액은 세포 생존율이 제한 요소인 smart-seq, drop-seq 및cel-seq 16과 같은 다른 염기서열분석 플랫폼에서 처리할 수 있습니다.
E7 배아에서 세포의 수는 균주와 돌연변이 유전자형에 따라 달라질 수 있습니다. 일반적으로 E7 배아는 수백 개에서 수천 개의 세포에 이를 수 있으며, 원하는 유전자형을 가진 배아를 얻는 것은 임신 댐당 1개 또는 2개의 배아만 기준을 충족하기 때문에 어렵습니다. 이 프로토콜을 사용하면 단일 세포 분석을 위해 E7 배아 당 약 300개의 생존 가능한 세포를 캡처할 수 있습니다. 임신한 댐에서 배아를 다른 날에 급속 냉동하여 배아 풀 크기를 늘리려는 시도는 동결 보존제를 추가했음에도 불구하고 해동 후 세포 생존력이 심각하게 손상되어 성공하지 못했습니다. 이 문제를 해결하기 위해 번식 전략과 임신한 댐의 동기화가 최적화되었습니다. 여러 번의 격리 가능성을 높이려면 번식하기 전에 1-2번 출산한 암컷 쥐를 사용하여 격리를 위해 사용하는 것이 좋습니다. 암컷의 발정 주기를 모니터링하는 것이 중요합니다. 짝짓기는 발정기와 발정기에 발생할 가능성이 더 높습니다. 번식에 어려움이 생기면 4일 후에 번식 파트너를 바꾸는 것도 플러그가 생성되지 않는 경우 도움이 됩니다.
이 방법에는 한계가 있다는 점에 유의하는 것이 중요하다: 관찰된 플러그에 의존하며, 플러그가 관찰되더라도 임신을 보장하지 않고 성행위만 나타낸다. 따라서 하루에 관찰된 플러그의 수를 늘리면 하루에 두 개 이상의 임신 댐이 있을 확률이 높아지고 더 많은 양성 유전자형이 있습니다. 이 프로토콜은 E7에서 E7.75에 이르는 배아 단계를 gastrulation 중 개념 증명으로 사용할 수 있는 가능성을 보여주었습니다. 그러나 이 파이프라인은 E6.5에서 E8 배아까지 적용할 수 있습니다. E6.5 배아의 경우, 원하는 유전자형을 가진 최소 7개의 배아를 얻기 위해 동기화된 임신 횟수를 늘리는 것이 권장됩니다. 대신, E8 배아의 경우 각 배아를 해리하는 데 사용되는 트립신의 양을 20 μL 대신 ~ 40 μL로 늘립니다. 목표는 partitioning을 진행하기 전에 μl당 700-1200 cells의 농도 범위에서 cell/nuclei suspension를 얻는 것입니다.
우수한 세포 생존율은 단일 세포 염기서열분석의 성공에 필수적입니다. 제조업체가 제공하는 미세유체 칩 설계에서, 단일 셀은 알려진 바코드 겔 비드(11)를 포함하는 칩 내에서 겔 비드 인 에멀젼(GEM)으로 분할된다. 그러나 이 프로세스의 주목할만한 제한 사항은 고품질 및 저품질 단일 셀을 모두 분할할 수 있다는 것입니다. 적절한 수의 살아있는 세포(즉, 1000 cells/μL)가 있더라도 현탁액의 생존율이 낮으면(즉, 1000개의 세포가 살아 있고 1000개의 세포가 죽어 50%의 생존율이 발생함) 염기서열분석 실험은 실패할 가능성이 높습니다. 최적의 결과를 얻으려면 약 90%의 생존 가능성을 목표로 하는 것이 좋습니다. 세포 생존율이 약 60%-89% 사이인 경우 실험의 생존율을 향상시키기 위해 특정 조치를 취할 수 있습니다. 그러나 세포 생존율이 60% 미만인 경우 실험을 계속하지 않는 것이 좋습니다. 그 이유는 죽어가는 세포가 partitioning gel에서 '포획'되고 후속 라이브러리 준비 및 품질 관리가 눈에 띄는 문제 없이 통과되기 때문입니다. 그러나 대부분의 염기서열 분석 판독은 미토콘드리아, 리보솜 또는 세포사멸 유전자를 매핑하여 처음부터 세포 생존력이 좋지 않다는 징후를 나타내기 때문에 실제 염기서열 분석 실험은 완전히 실패할 수 있습니다. 이 논문에 제시된 데이터는 고품질 세포를 가진 gastrulating mouse 배아의 단일 세포 염기서열 분석을 위한 파이프라인을 보여줍니다. 이 방법론은 개발 과정에서 다양한 유전자 돌연변이 마우스 모델을 이해하는 데 적용할 수 있습니다.

위축은 정상적인 발달에 필요한 기본적인 과정입니다. 이 빠르고 역동적인 과정은 만능 세포가 장기가 형성되는 방식을 정의하는 계통 특이적 전구체로 전환될 때 발생합니다. 수년 동안 gastrulation은 오랫동안 중배엽, 외배엽 및 내배엽의 세 가지 크게 균질 한 집단의 형성으로 정의되었습니다. 그러나, 고해상도 기술과 새로운 배아 줄기 세포 모델(embryonic stem cell model)1,2은 초기 생식층(germ layers)3,4 사이에서 전례 없는 이질성(heterogeneity)을 밝혀내고 있다. 이것은 위스트룰라의 뚜렷한 세포 집단을 조절하는 메커니즘에 대해 밝혀져야 할 것이 훨씬 더 많다는 것을 시사합니다. 마우스 배아 발달은 gastrulation 3,5 동안 초기 세포 운명 결정을 연구하는 가장 좋은 모델 중 하나였습니다. 생쥐의 위축은 배아 E6.5일에서 E85까지 48시간 이내에 전체 위형성 과정이 발생하기 때문에 빠릅니다.
최근 단세포 기술의 발전으로 야생형 마우스 배아 발달에 대한 상세한 매핑이 가능해졌으며, 이는 위축작용 중 배아의 세포 및 분자 환경에 대한 포괄적인 개요를 제공합니다 3,4,6,7,8. 그러나, 이 단계에서 돌연변이 배아에 대한 분석은 덜 일반적이며, 종종 FACS에 의해 분류된 집단에 국한된다 9,10. 희소한 문헌은 유전형 분석이 필요한 gastrulating embryos의 조작 및 단일 세포 준비와 관련된 기술적 문제를 반영합니다. 위축의 역동적인 과정을 포착하는 것은 특히 돌연변이 배아를 이해하는 데 있어 빠른 특성으로 인해 어려움을 겪을 수 있습니다. 임신 시기와 동기화는 매우 중요한데, 임신 시기가 정해진 임신 간의 조금만 차이 나도 돌연변이 유전자에서 비롯된 발달 표현형으로 잘못 해석될 수 있기 때문입니다. 이것은 돌연변이 유전자가 위형성 과정에 영향을 미칠 때 특히 중요해진다13,14. 이 연구에서는 질 마개(즉, 짝짓기 후 암컷의 질에서 형성된 응고된 정액의 질량)의 시각화를 통해 동기화된 임신을 얻기 위한 지침을 수립합니다. 또한, E6.5에서 E8까지의 돌연변이 배아로부터 강력한 단세포 데이터를 얻기 위한 전략이 고안되었습니다. 이 전략은 임신당 원하는 유전자형을 가진 배아의 수가 적고 배아 또는 세포의 동결-해동으로 인한 생존력 감소와 관련된 제약을 극복하기 위해 고안되었습니다.
이 논문은 질 플러그를 통한 시간 제한 임신의 확립부터 단일 세포/핵의 최종 시퀀싱에 이르기까지 최적화된 방법론을 설명합니다. 이 방법은 원하는 유전자형을 가진 더 많은 수의 배아를 얻기 위해 동기화된 임신 수를 늘리는 방법, 세포의 생존력을 개선하기 위한 세포/핵 분리 및 당일 유전형 분석 프로토콜을 설명하는 방법을 설명합니다. 이 원고는 또한 다양한 위축 시점에서의 배아 분리 과정을 설명합니다. 이 방법론은 염기서열분석을 위한 최종 생존 가능한 배아 세포/핵의 수를 증가시켜 고품질 염기서열분석 데이터를 보장하는 데 도움이 됩니다. 따라서 이 방법은 유전형 분석이 필요한 배아의 단세포 연구의 문을 열 것입니다.

<table><tbody><tr><td>10cm 페트리 접시</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-202</td><td></td></tr><tr><td>1000 &마이크로; L 리치 배리어 팁</td><td>Genesee Scientific</td><td>23-430</td><td></td></tr><tr><td>20 &마이크로; L 리치 배리어 팁</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-404</td><td></td></tr><tr><td>300 &마이크로; L 리치 배리어 팁</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-415</td><td></td></tr><tr><td>37 &마이크로; m 가역 여과기, 작은</td><td>줄기 세포</td><td>27215</td><td></td></tr><tr><td>6cm 페트리 접시</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-260</td><td></td></tr><tr><td>8-스트립 PCR 튜브</td><td>Genesee Scientific</td><td>27-125U</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Apex Bioresearch 제품</td><td>20-102</td><td></td></tr><tr><td>벤치마크 Scientific BSH300 MyBlock 미니 드라이 배스</td><td>Genesee</td><td>31-437</td><td></td></tr><tr><td>벤치 마크 사이언티픽 Z216-MK Z216MK Hermle 냉장 마이크로 원심 분리기</td><td>Genesee</td><td>33-759R</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>크롬 컨트롤러</td><td>10X</td><td>PN-1000127</td><td></td></tr><tr><td>크롬 Next GEM Single Cell 3' 시약 키트 v3.1</td><td>10X</td><td>PN-1000269</td><td></td></tr><tr><td>Countess 3 Automated Cell Counter</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td>AMQAX2000</tr><tr><td>Countess Cell Couning Chamber Slides</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>D1000 시약</td><td>Agilent</td><td>5067-5583</td><td></td></tr><tr><td>D1000 ScreenTape</td><td>Agilent</td><td>5067-5582</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BN2006</td><td></td></tr><tr><td>DirectPCR 난황자 주머니</td><td>Viagen</td><td>201-Y</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol ( DTT)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0861</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind Tube 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>Dubecco's Modificiation of Eagle's Medium (DMEM, 1x)</td><td>CORNING</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS</td><td>GenClone</td><td>25-508</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Fine Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5SF 펜치</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Koptec</td><td>V1401</td><td></td></tr><tr><td>EVOS M7000 이미징 시스템</td><td>Invitrogen</td><td>AMF7000</td><td></td></tr><tr>파인 사이언스 도구<td>- 샤프</td><td>파인 사이언스 툴</td><td>14060-11</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq G2 그린 마스터 믹스</td><td>Promega</td><td>M7823</td><td></td></tr><tr><td>그레이프 펜치</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>11049-10</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AC223211000</td><td></td></tr><tr><td>MiniAmp Thermal Cycler</td><td>Applied Biosystems</td><td>A37834</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>NextSeq 1000/2000 P2 시약(100 사이클) v3</td><td>Illumina</td><td>20046811</td><td></td></tr><tr><td>NextSeq2000</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon SMZ 1000 스테레오 현미경</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nondiedt P40</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>뉴클레아제가 없는 물</td><td>GenClone</td><td>25-511</td><td></td></tr><tr><td>광학 튜브 8x 스트립 (401428)</td><td>애질런트</td><td>401428</td><td></td></tr><tr><td>광학 튜브 캡 8x 스트립 (401425)</td><td>애질런트</td><td>401425</td><td></td></tr><tr><td>Poseidon 31-511, HS24 마이크로 원심분리기, 24 x 1.5/2.0 mL 로터 포함, 원심분리기 1개/장치</td><td>Genesee</td><td>31-511</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6556</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA 정량 분석 키트</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Flex 3</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase 억제제</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-141-368</td><td></td></tr><tr><td>표준 패턴 집게</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>테이프 스테이션 로딩 팁</td><td>애질런트</td><td>5067-5598</td><td></td></tr><tr><td>테이프스테이션 4150</td><td>애질런트</td><td>G2992AA</td><td></td></tr><tr><td>트리스-HCL (Ph7)</td> <td>품질 생물학</td><td>351-007-101</td><td></td></tr><tr><td>트리판 블루 스테인 0.4%</td><td>테로모 피셔 사이언티픽</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>트라이플 익스프레스</td><td>Gibco</td><td>12604-021</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Bio-Rad</td><td>1662404</td><td></td></tr><tr><td>Vortex 믹서 IKA MS3(96웰 샘플 플레이트 어댑터</td><td>IKA</td><td>3617000</td><td></td></tr></tbody></table> 포함)

돌연변이 전체 마우스 배아의 단일 세포 rna 염기서열 분석: epiblast에서 gastrulation 말기까지

Single-Cell RNA Sequencing of Mutant Whole Mouse Embryos: From the Epiblast to the End of Gastrulation

지난 10년 동안 단일 세포 접근법은 유전자 발현 역학, 세포 이질성 및 샘플 내 세포 상태를 연구하기 위한 황금 표준이 되었습니다. 단일 세포가 발전하기 전에는 초기 개발 과정에서 역동적인 세포 환경과 빠른 세포 전이를 포착하는 것이 불가능했습니다. 이 논문에서는 배아 E6.5일부터 E8일까지의 마우스 배아에 대해 단세포 및 핵 분석을 수행하도록 견고한 파이프라인을 설계했으며, 이는 위축작용의 시작 및 완료에 해당합니다. 위축(Gastrulation)은 기관 형성에 필수적인 세 가지 생식층, 즉 중배엽(mesoderm), 외배엽(ectoderm), 내배엽(endoderm)을 형성하는 발달 과정의 기본 과정입니다. 야생형 주위 배아에 적용되는 single-cell omics에 대한 광범위한 문헌을 이용할 수 있습니다. 그러나 돌연변이 배아에 대한 단세포 분석은 여전히 부족하며 FACS로 분류된 집단에 국한되는 경우가 많습니다. 이는 부분적으로 유전형 분석, 임신 시기 제한, 임신당 원하는 유전자형을 가진 배아의 수, 이 단계에서 배아당 세포 수의 필요성과 관련된 기술적 제약 때문입니다. 여기에서는 이러한 한계를 극복하기 위해 고안된 방법론을 제시합니다. 이 방법은 원하는 유전자형과 동기화된 임신 가능성을 높이기 위해 번식 및 시기별 임신 지침을 설정합니다. 당일 유전형 분석 프로토콜(3시간)과 결합된 배아 분리 과정의 최적화 단계를 통해 미세 방울 기반 단일 세포를 같은 날에 수행할 수 있어 세포의 높은 생존력과 강력한 결과를 보장할 수 있습니다. 이 방법에는 배아에서 최적의 핵 분리를 위한 지침이 추가로 포함됩니다. 따라서, 이러한 접근법은 위축(gastrulation) 단계에서 돌연변이 배아(mutant embryo)에 대한 단세포 접근법의 실현 가능성을 증가시킨다. 우리는 이 방법이 돌연변이가 위골의 세포 환경을 어떻게 형성하는지에 대한 분석을 용이하게 할 것으로 기대합니다.

이 논문에서 고안된 방법론은 E6.5에서 E8까지의 단세포 오믹스를 위한 배아 샘플의 준비를 향상시키기 위해 특별히 고안되었습니다. 이 강력한 파이프라인은 동기화된 시간 임신, 배아 분리, 당일 유전형 분석, 세포 해리 및 세포 생존력 평가의 5가지 주요 단계로 구성됩니다(그림 1A). 제시된 데이터는 E7에서 E7.5까지의 시점에 초점을 맞추고 있지만, 절차에서 약간의 변형을 가하여 E8까지의 배아(그림 1B)에 적용할 수 있습니다(프로토콜 전체의 참고 사항 참조). 동기화된 시간 임신은 두 마리의 암컷 쥐를 수컷 쥐와 함께 케이지에 넣음으로써 달성되었습니다. 매일 아침 10시 이전에 질 플러그를 점검하고, 플러그가 관찰되면 그날 정오까지 E0.5로 간주했습니다(그림 2A). 이 연구에서 플러그를 위한 최적의 조건은 발정기 또는 발정기 단계의 암컷 쥐를 이전 번식 중에 여러 플러그를 성공적으로 배치한 이력이 있는 수컷과 짝을 이루어야 했습니다(그림 2B). 배아 분리를 위해 명백한 플러그만 고려되었습니다(그림 2C).
발달 시기는 그림 2A의 시간표에 따라 추정되었습니다. E7.5의 경우, 플러그가 발견된 날로부터 7일 째 되는 날 오후 12시에 배아 해부가 시작되었습니다. 그림 3 은 E7.5에서 성공적인 배아 분리를 보여줍니다. 임신한 댐을 안락사시킨 후, 자궁 뿔을 절제하고, 부풀어 오른 부분을 개별적으로 잘라내어 배아가 드러나게 하고, 난황 자루를 분리하여 유전형 분석을 실시하였다(그림 3).
당일 유전형 분석은 그림 4A의 단계에 따라 배아 분리 후 3시간 이내에 수행되었습니다. 배아는 온전함을 보존하기 위해 유전형 분석 과정에서 얼음 위에 보관되었습니다. 배아를 동결하면 배아당 생존 가능한 세포의 수가 줄어들기 때문에 동결하지 마십시오. 그림 4B,C는 내장 난황 주머니, 두정엽 내배엽 주머니 및 관련 모계 혈액이 있는 외태반 원뿔을 보여줍니다. 내장 난황낭은 유전형 분석에 활용되었습니다(그림 4C). 난황낭을 소화한 후, PCR 혼합물을 제조하고, PCR 반응을 실행하였다. 생성된 PCR 산물을 이어서 아가로스 겔 상에서 분리하였다. 그림 4D는 LoxP 및 야생형 대립유전자(각각 597bp 및 498bp) 및 Cre 대립유전자(650bp)의 예상 단편 크기를 보여줍니다. 그림 4E에는 Cre 및 LoxP(플록스) 대립유전자를 운반하는 번식 쌍에서 얻은 6개 배아의 난황낭 유전형 분석의 예가 제시되어 있습니다. 겔은 분석된 6개의 배아에서 Cre 및 LoxP 대립유전자의 PCR 산물을 묘사합니다. 2번과 5번 배아는 2개의 플록스 대립유전자와 1개의 크레 대립유전자를 가지고 있습니다. 따라서 이들은 조건부 KO 배아(conditional KO embryo)로 간주된다(그림 4E, 빨간 점). 배아 1과 3은 2개의 플록스 대립유전자를 가지고 있지만 Cre에 대해서는 음성입니다. 따라서 그들은 flox 컨트롤로 간주됩니다. 배아 4는 2개의 플록스 대립유전자와 Cre 대립유전자에 대한 희미한 띠를 가지고 있어 "불분명한" 유전자형이 발생합니다. 이 배아는 더 이상 처리되지 않았습니다(대안적으로, 실험자는 유전형 분석을 반복하거나 Cre를 발현하는 세포를 사용하여 조건부 KO의 2차 검증을 수행하는 것을 고려할 수 있음). 이 실험에 사용된 Cre 드라이버는 내장 난황낭(15)에서 발현되지 않는다는 점에 유의하는 것이 중요하다; 따라서, LoxP 대립유전자는 Cre-음성 배아에 비해 Cre-양성 배아의 겔에서 이동된 것으로 보이지 않습니다.
성공적인 단일 세포 실험을 위해서는 세포 수와 우수한 생존율이 필요합니다. 세포 생존율이 낮거나, 죽은 세포의 비율이 높거나, 응집되거나, 상당한 파편이 있는 현탁액은 추가 처리에 적합하지 않습니다. 최적의 조건은 마이크로리터당 700-1200개의 살아있는 세포와 &gt;90%의 생존율입니다. 그림 5A 는 양호한 세포 생존율과 차선의 세포 생존율을 모두 보여주는 패널을 보여줍니다. 그림 5B와 같이 핵 분리에도 동일한 기준을 적용할 수 있습니다. 그러나, 트리판 블루의 평가는 세포 및 핵과 다르다는 점에 유의하는 것이 중요합니다: 생존 가능한 세포는 트리판 블루를 포함하지 않는 반면, 생존 가능한 핵은 트리판 블루를 포함합니다. 세포/핵 현탁액이 최적인 경우(&gt;90% 생존율) 제조업체의 절차11에 따라 미세유체 칩을 사용하여 단일 세포 분할을 진행합니다. 문제 해결 옵션은 그림 5C와 같이 세포/핵 생존율이 60%-89% 사이인 현탁액에 대해 제공됩니다. 총 세포 수에 관계없이 생존율이 60% 미만으로 떨어지면 실험을 중단하는 것이 좋습니다.
임신한 댐의 도태부터 도서관 건설까지 전체 파이프라인은 같은 날 총 8시간이 소요됩니다(즉, 프로토콜 단계 2-6은 같은 날에 수행되어야 함). 단일세포 제조사의 절차11에 요약된 절차에 따라, E7 배아에서 얻은 세포를 사용하여 단일세포 RNA 염기서열분석을 위한 라이브러리 구성을 준비하였으며, 세포 생존율은 최적이 아닌 조건에서 최적 조건에 이르며, 2,000개의 세포의 예상 목표 회수율을 목표로 했습니다(그림 6). 그림 6A 는 최적이 아닌 조건과 최적 조건 모두에 대한 scRNAseq 라이브러리의 대표적인 단편 크기 분포를 보여주며, 세포 생존율이 전체 단일 세포 분할 과정에 큰 영향을 미치지 않음을 나타냅니다. 단편 크기 분포는 400-500 bp 사이였습니다. 이는 최적이 아닌 조건이 라이브러리 준비 프로세스에 영향을 주지 않음을 나타냅니다. 그림 6B 는 성공적인 단일 세포 RNAseq 실험과 차선의 단일 세포 RNAseq 실험의 결과를 보여줍니다. 염기서열분석 후, 샘플에 대해 품질 관리 검사를 실시한 결과, 세포 생존율이 최적이 아닌 경우 세포의 10%만이 성공적으로 염기서열 분석을 수행하는 것을 관찰했습니다. 대조적으로, 최적의 샘플은 전체 세포의 91%가 염기서열 분석되어 더 높은 비율을 보였습니다. 이는 바코드 플롯에 의해 더욱 입증되며, 이는 최적이 아닌 조건이 최적 조건에 비해 더 큰 배경 소음을 갖는다는 것을 나타냅니다. 두 실험 모두에 대해 클러스터링 분석을 수행한 결과 9개의 클러스터가 최적 조건에서, 4개의 클러스터가 최적이 아닌 조건에서 확인되었습니다. 알려진 마커3 를 사용한 클러스터의 주석은 E7 배아에서 epiblast 및 primitive streak을 포함하여 예상되는 세포 유형을 나타냈습니다(그림 6B). 최적이 아닌 실험의 클러스터 주석은 각 클러스터에 대해 알려진 마커의 농축 부족으로 인해 불가능했습니다. 이는 이러한 개발 단계에서 데이터를 적절하게 표현하는 데 필요한 고품질 셀의 중요성을 강조합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66866/66866fig1v2.jpg"> 그림 1: single-cell RNA 염기서열분석을 위한 전체 마우스 배아의 gastrulating 최적화. (A) gastrulating embryos에서 고품질 세포 및/또는 핵을 얻기 위한 워크플로우 개략도. (B) E7에서 E8까지의 gastrulation 중 마우스 배아의 대표적인 명시야 이미지 및 적응된 계획3 . 스케일 바: 125 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66866/66866fig1v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66866/66866fig2v2.jpg"> 그림 2: 위축(gastrulation) 중 배아 분리를 위한 효율적인 동기화 시간 임신을 위한 전략. (A) 시간 제한 임신을 위한 파이프라인을 나타내는 개략도와 특정 위산 단계 분석을 위한 플러그 감지에서 배아 분리까지의 시간을 설명하는 시간표. (B) 암컷 마우스의 발정 주기 단계를 대표하는 이미지. 번식에 가장 잘 적응하는 단계가 표시됩니다. (C) 질 플러그를 확인하는 방법과 플러그가 없는 질 입구, 부분 플러그 또는 배아 분리를 위해 고려할 수 있는 좋은 플러그의 예를 보여주는 개략도. 질 입구는 각 이미지 아래에 확대되어 있습니다. 플러그(질 입구의 응고된 정액)는 빨간색 화살표로 강조 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66866/66866fig2v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66866/66866fig03.jpg"> 그림 3: 단일 세포 RNA 염기서열 분석을 위한 E7.5 배아의 해부 및 유전형 분석. E7.5 배아를 분리하고 내장 난황낭을 해부하는 과정에 대한 개략도 및 이미지. 노란색 화살표는 임신한 댐의 자궁을 나타내고 노란색 점선 원은 배아의 위치를 나타냅니다. 점선은 색인 중에 절단된 영역을 나타냅니다. "M"은 중간체 끝을 나타내고 "AM"은 반중간체 끝을 나타냅니다. 스테레오스코프 이미지의 스케일 바는 400μm입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66866/66866fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66866/66866fig04.jpg"> 그림 4: gastrulating mouse 배아에서 채취한 난황낭의 당일 유전형 분석. (A) 난황낭의 당일 유전형 분석을 위한 워크플로우 개략도. (B) 관련 모계 혈액이 있는 두정엽 내배엽 주머니 및 외태반 원뿔의 대표 이미지. (C) 점선으로 강조 표시된 E7.5 배아의 내장 난황낭. 척도 막대: 200 μm. (D) 관찰된 DNA 단편 크기를 가진 야생형(+/+), 이형접합(Flox/+) 및 동형접합 플록스(Flox/Flox) 및 Cre 유전형 분석(Mesp1cre15)의 대표적인 겔. (E) 6개 배아(1-6)의 난황낭에서 채취한 Cre 및 flox 대립유전자에 대한 당일 유전형 분석 결과가 제공됩니다. 플록스/플록스 및 Cre 음성(-) 유전형 분석이 있는 두 배아는 플록스 대조군(파란색 점)인 반면, 플록스/플록스 및 Cre 양성(+) 유전형 분석이 있는 배아는 조건부 KO(빨간색 점)입니다. 배아 4는 희미한 Cre 띠(flox/flox 및 Cre-unclear)로 인해 최적이 아니며 결과적으로 추가 처리에서 제외됩니다. 동일한 유전자형을 가진 배아는 단일 세포 RNA 염기서열 분석을 위해 통합되고 처리됩니다. 난황낭에 Cre 대립유전자가 존재한다는 것은 플록스 띠의 크기에 영향을 미치지 않으며, 사용된 Cre(Mesp1cre)는 난황낭에서 발현되지 않습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66866/66866fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66866/66866fig05.jpg"> 그림 5: 세포 품질 및 핵 생존력 평가. (A) E7.5 배아의 최적 및 최적이 아닌 세포 생존력 조건의 대표 이미지. (B) E8 배아의 최적 및 최적이 아닌 핵 생존력 조건의 대표 이미지 (C) 단일 세포 분할을 시작하기 전에 세포의 생존력을 높이는 데 도움이 되는 잠재적 솔루션을 나타내는 문제 해결 계획. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66866/66866fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66866/66866fig06.jpg"> 그림 6: E7 마우스 배아의 단일 세포 RNA 염기서열 분석. (A) E7 마우스 배아의 단일 세포 RNA 염기서열 분석 라이브러리에 대한 단편 크기 분포의 대표적인 추적으로, 세포 생존율의 최적 및 최적 조건 모두에 대해 주 피크가 400-500bp에 가깝습니다. 이러한 조건 간의 추적은 유사하며, 이는 세포 생존율이 라이브러리의 품질 관리에 영향을 미치지 않음을 나타냅니다. (B) 최적이 아닌 조건과 최적 조건 모두에서 E7 마우스 배아에 대한 단일 세포 RNA 염기서열 분석 결과를 분석하여 관찰된 표적 회수율, 바코드 순위 지정 및 UMAP(Uniform Manifold Approximation and Projection) 분포를 통한 세포 유형의 클러스터링을 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66866/66866fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="4">리시스 버퍼</td>
		</tr><tr><td>시약 이름</td>
			<td>주식 집중</td>
			<td>최종 집중</td>
			<td>총 부피 1mL</td>
		</tr><tr><td>트리스 - HCL (Ph7)</td>
			<td>1개 m</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>10 마이크로리터</td>
		</tr><tr><td>염화나트륨</td>
			<td>5개 M</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>2 μL</td>
		</tr><tr><td>마그네슘Cl2</td>
			<td>0.1 미터</td>
			<td>3 m엠</td>
			<td>3 μL</td>
		</tr><tr><td>Tween-20 (트윈-20)</td>
			<td>20%</td>
			<td>0.10%</td>
			<td>5 마이크로리터</td>
		</tr><tr><td>Nondiedt P40</td>
			<td>10%</td>
			<td>0.10%</td>
			<td>10 마이크로리터</td>
		</tr><tr><td>디지토닌</td>
			<td>5%</td>
			<td>0.01%</td>
			<td>2 μL</td>
		</tr><tr><td>디에티(DTT)</td>
			<td>1개 m</td>
			<td>1 m엠</td>
			<td>1 μL</td>
		</tr><tr><td>RNase 억제제</td>
			<td>40 U/μL</td>
			<td>1유/μL</td>
			<td>25 마이크로리터</td>
		</tr><tr><td>뉴클레아제가 없는 물</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>924 마이크로리터</td>
		</tr><tr><td colspan="4">세척 버퍼</td>
		</tr><tr><td>시약 이름</td>
			<td>주식 집중</td>
			<td>최종 집중</td>
			<td>총 부피 1mL</td>
		</tr><tr><td>PBS 의 BSA</td>
			<td>10%</td>
			<td>1%</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr><tr><td>증권 시세 표시기</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>900 마이크로리터</td>
		</tr></tbody></table>표 1: 핵 분리 용해 완충액 및 세척 완충액 조성.

이 논문은 단일 세포 및 핵의 염기서열 분석을 위한 gastrulating mouse embryos의 고품질 single-cell 및 nuclei suspensions를 위한 파이프라인을 설정합니다.

돌연변이 전체 마우스 배아의 단일 세포 RNA 염기서열 분석: epiblast에서 gastrulation 말기까지

Over the last decade, single-cell approaches have become the gold standard for studying gene expression dynamics, cell heterogeneity, and cell states ...

single-cell-rna-sequencing-mutant-whole-mouse-embryos-from-epiblast

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 프로토콜은 마우스 착상 전 배아 계통 명세서를 연구하는 단백질 발현의 정량적 분석 시츄, 단일 셀을 수행하는 방법을 제시한다. 포배의 수집에 필요한 절차, 단백질의 면역 검출을 전체 마운트, 공 초점 현미경, 핵 세분화 및 이미지 분석에 샘플 영상은 설명한다.

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여기에서 우리는 생활 C 에서 고해상도 현미경, 전산 도구 및 단일 세포 라벨링을 사용 하 여 조합 접근법을 제시 합니다. 신경 발달 중에 단일 세포 역학을 이해 하는.

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