Name: DREAM Implant: 머리가 고정되고 자유롭게 행동하는 마우스의 만성 전기생리학을 위한 가볍고 비용 효율적인 모듈식 임플란트 시스템 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-26T14:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: 학습하세요 DREAM 임플란트를 이용한 마우스와 마카크의 만성 전기생리학 기록 방법. 가볍고 모듈식 설계로 행동 과제 중 신경 활동을 효과적으로 측정하여 자연스러운 의사결정 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

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이 연구는 네덜란드 연구위원회(Dutch Research Council, NWO; Crossover Program 17619 "INTENSE", TS)에 등록되어 있으며, 보조금 계약 번호 600925(Neuroseeker, TS, FB, PT)에 따라 유럽 연합의 7차 프레임워크 프로그램(FP7/2007-2013)과 막스 플랑크 협회(Max Planck Society)로부터 자금을 지원받았습니다.

생쥐의 전기생리학을 위한 비용 효율적이고 다재다능한 프로브 임플란트 시스템

<ol><li>Epsztein, J., Brecht, M., Lee, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+determinants+of+hippocampal+CA1+place+and+silent+cell+activity+in+a+novel+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Intracellular determinants of hippocampal CA1 place and silent cell activity in a novel environment.</a> Neuron. 70 (1), 109-120 (2011).</li>
<li>Okun, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+coupling+of+neurons+to+populations+in+sensory+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Diverse coupling of neurons to populations in sensory cortex.</a> Nature. 521 (7553), 511-515 (2015).</li>
<li>Jun, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+integrated+silicon+probes+for+high-density+recording+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fully integrated silicon probes for high-density recording of neural activity.</a> Nature. 551 (7679), 232-236 (2017).</li>
<li>Znamenskiy, P., Kim, M. -H., Muir, D. R., Iacaruso, M. F., Hofer, S. B., Mrsic-Flogel, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+specificity+of+recurrent+inhibition+in+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Functional specificity of recurrent inhibition in visual cortex.</a> Neuron. 112 (6), 991-1000 (2024).</li>
<li>Rowland, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+of+activity+through+the+cortical+hierarchy+and+perception+are+determined+by+neural+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Propagation of activity through the cortical hierarchy and perception are determined by neural variability.</a> Nat Neurosci. 26 (9), 1584-1594 (2023).</li>
<li>Roth, M. M., Dahmen, J. C., Muir, D. R., Imhof, F., Martini, F. J., Hofer, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thalamic+nuclei+convey+diverse+contextual+information+to+layer+1+of+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Thalamic nuclei convey diverse contextual information to layer 1 of visual cortex.</a> Nat Neurosci. 19 (2), 299-307 (2016).</li>
<li>Zong, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+two-photon+calcium+imaging+in+freely+moving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Large-scale two-photon calcium imaging in freely moving mice.</a> Cell. 185 (7), 1240-1256 (2022).</li>
<li>Demas, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed%2C+cortex-wide+volumetric+recording+of+neuroactivity+at+cellular+resolution+using+light+beads+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-speed, cortex-wide volumetric recording of neuroactivity at cellular resolution using light beads microscopy.</a> Nat Methods. 18 (9), 1103-1111 (2021).</li>
<li>Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+extracellular+fields+and+currents+EEG%2C+ECoG%2C+LFP+and+spikes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The origin of extracellular fields and currents EEG, ECoG, LFP and spikes.</a> Nat Rev Neurosci. 13 (6), 407-420 (2012).</li>
<li>Polikov, V. S., Tresco, P. A., Reichert, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+brain+tissue+to+chronically+implanted+neural+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Response of brain tissue to chronically implanted neural electrodes.</a> J Neurosci Methods. 148 (1), 1-18 (2005).</li>
<li>Savya, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+spatiotemporal+dynamics+of+astrocyte+reactivity+following+neural+electrode+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">In vivo spatiotemporal dynamics of astrocyte reactivity following neural electrode implantation.</a> Biomaterials. 289, 121784(2022).</li>
<li>Perge, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-day+signal+instabilities+affect+decoding+performance+in+an+intracortical+neural+interface+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">Intra-day signal instabilities affect decoding performance in an intracortical neural interface system.</a> J Neural Eng. 10 (3), 036004(2013).</li>
<li>Pachitariu, M., Steinmetz, N., Kadir, S., Carandini, M., Harris, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kilosort%3A+realtime+spike-sorting+for+extracellular+electrophysiology+with+hundreds+of+channels%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Kilosort: realtime spike-sorting for extracellular electrophysiology with hundreds of channels.</a> bioRxiv. , 061481(2016).</li>
<li>Buzsáki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+recording+of+neuronal+ensembles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Large-scale recording of neuronal ensembles.</a> Nat Neurosci. 7 (5), 446-451 (2004).</li>
<li>Kloosterman, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-drive+array+for+chronic+in+vivo+recording%3A+Drive+fabrication%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Micro-drive array for chronic in vivo recording: Drive fabrication.</a> J Vis Exp. (26), e1094(2009).</li>
<li>Jacobs, T., Darch, H., Holtzman, T., De Zeeuw, C. I., Romano, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+operating+protocol%3A+Implantation+of+Cambrige+NeuroTech+chronic+silicon+probe+and+mini-amp-64+digital+headstage+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Protocol+Exchange%22%5BJournal%5D)">Standard operating protocol: Implantation of Cambrige NeuroTech chronic silicon probe and mini-amp-64 digital headstage in mice.</a> Protocol Exchange. , (2023).</li>
<li>Juavinett, A. L., Bekheet, G., Churchland, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+adaptable%2C+reusable%2C+and+light+implant+for+chronic+Neuropixels+probes%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">An adaptable, reusable, and light implant for chronic Neuropixels probes.</a> bioRxiv. , (2024).</li>
<li>Kozai, T. D. Y., Jaquins-Gerstl, A. S., Vazquez, A. L., Michael, A. C., Cui, X. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+tissue+responses+to+neural+implants+impact+signal+sensitivity+and+intervention+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Brain tissue responses to neural implants impact signal sensitivity and intervention strategies.</a> ACS Chem Neurosci. 6 (1), 48-67 (2015).</li>
<li>Nguyen, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-drive+array+for+chronic+in+vivo+recording%3A+tetrode+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Micro-drive array for chronic in vivo recording: tetrode assembly.</a> J Vis Exp. (26), e1098(2009).</li>
<li>Biran, R., Martin, D. C., Tresco, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+cell+loss+accompanies+the+brain+tissue+response+to+chronically+implanted+silicon+microelectrode+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neuronal cell loss accompanies the brain tissue response to chronically implanted silicon microelectrode arrays.</a> Exp Neurol. 195 (1), 115-126 (2005).</li>
<li>Vöröslakos, M., Petersen, P. C., Vöröslakos, B., Buzsáki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal+microdrive+and+head+cap+system+for+silicon+probe+recovery+in+freely+moving+rodent%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Metal microdrive and head cap system for silicon probe recovery in freely moving rodent.</a> eLife. 10, e65859(2021).</li>
<li>IMEC Neuropixels 1.0 User Manual V1.0.8. , Available from: 
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<li>Baranauskas, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+nanotube+composite+coating+of+neural+microelectrodes+preferentially+improves+the+multiunit+signal-to-noise+ratio%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">Carbon nanotube composite coating of neural microelectrodes preferentially improves the multiunit signal-to-noise ratio.</a> J Neural Eng. 8 (6), 066013(2011).</li>
<li>Niell, C. M., Stryker, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+visual+responses+by+behavioral+state+in+mouse+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Modulation of visual responses by behavioral state in mouse visual cortex.</a> Neuron. 65 (4), 472-479 (2010).</li>
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<li>Vasilev, D., Raposo, I., Totah, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brightness+illusions+evoke+pupil+constriction+preceded+by+a+primary+visual+cortex+response+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Brightness illusions evoke pupil constriction preceded by a primary visual cortex response in rats.</a> Cereb Cortex. 33 (12), 7952-7959 (2023).</li>
</ol>

TS, AN 및 MNH는 이 프로토콜에 사용된 오픈 소스 마이크로드라이브와 패러데이 크라운을 제조하는 3Dneuro B.V.의 공동 설립자입니다. FB와 PT는 33Dneuro B.V.의 과학 자문 위원회의 일원입니다. FB와 PT는 이 직책에 대해 어떠한 금전적 보상도 받지 않습니다.

이 원고는 프로브의 빠르고 안전하며 표준화된 주입을 위한 프로토콜을 제시하며, 이를 통해 실험 종료 시 프로브 회수 및 재사용도 가능합니다. 이 접근 방식은 임플란트 구성 요소의 모듈식 시스템, 특히 모든 일반 실리콘 프로브 및 기록 시스템과 호환되는 마이크로드라이브, 머리 고정 동작 실험에 사용할 수 있는 헤드플레이트, 임플란트를 보호하기 위한 웨어러블 패러데이 케이지를 사용합니다. 이 별자리를 통해 사용자는 프로세스에서 임플란트의 표준화를 희생하지 않고도 머리를 고정하는 동작과 자유롭게 움직이는 동작 또는 임플란트 소형화(패러데이 케이지 제외) 대 장기 신호 견고성 향상(패러데이 케이지 사용)과 같은 다양한 실험 패러다임에 임플란트를 유연하게 적용할 수 있습니다.
이 접근 방식은 만성 전기생리학적 기록을 보다 표준화하고(수작업으로 조립할 필요가 없는 조립식 요소를 통해), 비용이 적게 들고(프로브 회수를 통해), 시간이 덜 걸리고(수술 단계 간소화를 통해), 동물 복지 및 행동과 더 쉽게 호환되도록(임플란트 크기 감소 및 스트레스 없는 머리 고정을 통해) 만듭니다. 따라서 이 프로토콜은 이 분야의 최첨단에 있는 선구적인 실험실을 넘어 더 광범위한 연구자들이 행동하는 설치류에 전기생리학적 임플란트를 사용할 수 있도록 하는 것을 목표로 합니다.
이 목표를 달성하기 위해 여기에 제시된 프로토콜은 마이크로드라이브 임플란트의 여러 가지 중요한 측면, 즉 유연성, 모듈성, 이식 용이성, 안정성, 전체 비용, 거동과의 호환성 및 프로브 재사용성 간의 절충을 최소화합니다. 현재 사용 가능한 접근 방식은 이러한 측면 중 일부에서 탁월한 경우가 많지만 다른 기능에 비해 비용이 많이 듭니다. 예를 들어, 장기간에 걸쳐 절대적인 임플란트 안정성을 요구하는 사용 사례의 경우, 최상의 임플란트 접근법은 프로브를 두개골(25)에 직접 접합하는 것일 수 있다. 그러나 이는 또한 프로브 재사용을 방지하고 기록 품질이 좋지 않은 경우 기록 부위의 재배치를 방지하며 표준화된 임플란트 배치와 호환되지 않습니다. 유사하게, AMIE 드라이브는 회수 가능한 프로브 주입을 위한 경량의 저비용 솔루션을 제공하지만, 이는 단일 프로브로 제한되고 대상 좌표(17)의 배치에 제한이 있다. 스펙트럼의 반대쪽 끝에서, 일부 상업적으로 입수가능한 나노-드라이브(표 1 참조: 16,17,21,26,27,28,29,30 참조)는 극히 작고, 두개골 상에 자유롭게 배치될 수 있으며, 단일 동물에 이식될 수 있는 프로브의 수를 최대화한다16. 그러나 다른 솔루션에 비해 비용이 많이 들고, 성공적인 임플란트 수술을 위해 실험자가 고도로 숙련되어야 하며, 프로브 재사용을 금지합니다. Vöröslakos et al.21이 개발한 경량 버전인 마이크로드라이브는 사용 편의성 향상, 가격 절감 및 프로브 재사용성을 위해 작은 임플란트 크기를 희생했습니다
표 1: 설치류의 만성 프로브 임플란트에 대한 인기 있는 전략 비교. 가용성: 마이크로드라이브가 오픈 소스(연구원이 직접 구축할 수 있음), 상업적으로 사용 가능한지 또는 둘 다인지 여부. 모듈성: 통합 시스템은 서로 고정된 관계에 있는 하나 또는 몇 개의 구성 요소로 구성되며, 모듈식 시스템을 사용하면 임플란트 생산 후(예: 수술 시) 보호 장치(헤드 기어/패러데이 케이지)를 기준으로 프로브/마이크로드라이브를 자유롭게 배치할 수 있습니다. 모듈성은 나열된 임플란트의 게시된 정보 또는 이식 프로토콜로부터 결정되었습니다. 헤드픽스: 예: 임플란트는 헤드 고정 메커니즘이 디자인에 통합되어 있고, X: 임플란트는 큰 문제 없이 고정을 위해 추가 헤드플레이트를 추가할 공간을 남겨둡니다, 아니오: 임플란트의 디자인은 공간 문제를 일으키거나 헤드 고정과 함께 사용하기 위해 상당한 디자인 수정이 필요할 수 있습니다. 프로브 배치: 제한됨: 임플란트 설계 단계에서 프로브 위치가 제한됩니다. 유연성: 수술 중에도 프로브 위치를 조정할 수 있습니다. 프로브 수: 이식할 수 있는 프로브의 수입니다. 마우스에 >2 프로브를 이식하는 것은 선택한 임플란트 시스템과 무관하게 상당한 문제가 됩니다. 프로브 재사용성: 예, 이론적으로 프로브를 재사용할 수 있는 경우입니다. 무게/크기: 임플란트의 무게와 부피. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66867/Table%201.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
이러한 다양한 요구 사항을 보다 원활하게 조화시키는 시스템을 만들기 위해 DREAM 임플란트는 Vöröslakos 임플란트21을 기반으로 설계되었지만 몇 가지 근본적인 수정 사항이 있었습니다. 첫째, 전체 임플란트 무게를 줄이기 위해 여기에 사용된 마이크로드라이브는 3D 프린팅 스테인리스강이 아닌 가공 알루미늄으로 제작되었으며, 패러데이 크라운은 소형화되어 헤드플레이트 재질 선택에 따라 전체 무게를 1.2-1.4g 줄였습니다(표 2 참조). 둘째, 마이크로드라이브를 둘러싼 헤드플레이트는 빠르고 스트레스 없는 헤드 고정을 가능하게 하는 통합 헤드 고정 메커니즘을 허용하도록 설계되었으며, 패러데이 케이지의 베이스로도 사용되어 신경 세포 기록을 위한 대부분의 잠재적 대상 영역에 접근할 수 있도록 하고 임플란트에 최소한의 무게만 추가할 수 있습니다. 고정 메커니즘의 평평한 모양과 돌출부의 부족은 또한 동물의 시야 또는 운동의 손상을 최소화하며(그림 2A-C 참조), 이는 이전 시스템에 비해 분명한 개선입니다(31,32). 헤드플레이트에 고정된 패러데이 크라운과 링도 이전 디자인에 비해 크게 변경되었습니다. 이제 수술 전반에 걸쳐 임시방편적인 조정(예: 커넥터 배치) 또는 납땜이 필요하지 않아 임플란트 손상 및 임플란트 품질의 예측할 수 없는 변동의 잠재적 원인을 제거할 수 있습니다. 대신, DREAM 임플란트는 각 커넥터를 사전 정의된 4개의 위치 중 하나에 배치할 수 있는 여러 가지 표준화된 크라운 링 변형을 제공하여 수술 중 변동성과 노력을 최소화합니다. 마지막으로, 프로브 회수를 위해 임플란트 시스템을 최적화함으로써 DREAM 임플란트는 마이크로드라이브와 프로브를 일반적으로 함께 회수, 세척 및 재사용할 수 있기 때문에 실험자가 임플란트당 준비 시간과 비용을 크게 줄일 수 있습니다.
다양한 임플란트 시스템으로 인해 발생하는 트레이드오프에 대한 자세한 개요는 표 1을 참조하십시오. 여기에 제시된 접근 방식은 일반적으로 크기, 안정성 또는 비용 측면에서와 같은 다른 모든 전략에 비해 최대 성능을 제공하지는 않지만 이러한 모든 매개변수에서 상위 범위에서 작동하므로 광범위한 실험에 더 쉽게 적용할 수 있습니다.
프로토콜의 세 가지 측면은 각 특정 사용 사례에 적응하는 데 특히 중요합니다: 접지 및 기준의 별자리, 마이크로드라이브를 접합하는 기술, 신경 세포 기록을 통한 임플란트 검증. 첫째, 접지 및 참조 핀을 이식할 때 목표는 기계적/전기적 안정성과 침습성 사이의 스위트 스폿을 식별하는 것이었습니다. 예를 들어, 한천에 매립된 부유 은선은 뼈 나사(33)보다 덜 침습적이지만, 시간이 지남에 따라 제거되는 경향이 더 높다. 한천과 결합된 핀을 사용하면 안정적인 전기 연결이 보장되는 동시에 삽입 중에 제어가 더 쉬워 조직 외상을 피할 수 있는 이점이 있습니다. 두개골에 접착된 접지 핀은 빠질 가능성이 거의 없으며, 와이어가 핀에서 분리되는 경우 이식된 핀의 더 큰 표면적과 안정성으로 인해 일반적으로 재부착이 간단합니다.
표 2: Vöröslakos et al.21에서 설명한 DREAM 임플란트와 임플란트 간의 구성 요소 중량 비교. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66867/Table%202.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
둘째, 마이크로드라이브의 접합은 일반적으로 뇌에 프로브를 삽입하기 전에 이루어져야 합니다. 이것은 삽입하는 동안 마이크로 드라이브가 정위 홀더에 완벽하게 고정되지 않은 경우 뇌 내부의 프로브의 측면 이동을 방지합니다. 마이크로드라이브를 제자리에 접합하기 전에 프로브의 위치를 확인하기 위해 현미경의 시차 이동을 감안할 때 터치다운 위치를 추정하는 것이 어려울 수 있으므로 프로브 생크의 끝을 잠시 내려 뇌와 접촉할 위치를 확인할 수 있습니다. 마이크로드라이브 위치가 설정되면 마이크로드라이브를 접합하기 전에 실리콘 엘라스토머로 개두술을 선택적으로 보호하여 시멘트가 실수로 개두술과 접촉하지 않도록 할 수 있습니다. 그러나 실리콘 엘라스토머 잔여물이 뇌로 빨려 들어가 염증과 신경교증을 유발할 수 있으므로 실리콘 엘라스토머를 통해 프로브를 낮추는 것은 권장되지 않습니다.
셋째, 사용된 실험 프로토콜에 따라 수술 직후 테스트 기록이 유용할 수도 있고 그렇지 않을 수도 있습니다. 대체로 프로브 삽입 직후 기록된 신경 활동은 일시적인 뇌 부종 및 프로브 주위의 조직 이동과 같은 요인으로 인해 만성적으로 기록된 활동을 직접 대표하지 않으며, 이는 삽입 깊이와 스파이크 파형이 모두 직접 안정화될 가능성이 낮다는 것을 의미합니다. 따라서 즉각적인 기록은 주로 일반적인 신호 품질과 임플란트 무결성을 확인하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이동식 마이크로드라이브 썰매는 수술 후 뇌가 안정되어 위치를 미세 조정한 후 며칠 동안 사용하는 것이 좋습니다. 이는 또한 프로브가 하루에 1000μm 이상 이동하는 것을 방지하여 기록 부위의 손상을 최소화하여 기록 부위의 수명을 향상시키는 데 도움이 됩니다.
마지막으로, 사용자는 둘 이상의 대상 위치에서 기록하도록 시스템을 조정하기를 원할 수 있습니다. 이 시스템은 모듈식이기 때문에 사용자는 구성 요소를 서로 관련하여 조립하고 배치하는 방법에 대해 많은 재량권을 가질 수 있습니다(위 및 보충 그림 3 및 추가 그림 4 참조). 여기에는 수평으로 확장된 셔틀을 마이크로드라이브에 장착할 수 있는 수정 사항이 포함되어 여러 프로브 또는 대형 다중 생크 프로브를 이식할 수 있을 뿐만 아니라 여러 개의 개별 마이크로드라이브를 이식할 수 있습니다( 보충 그림 3 및 추가 그림 4 참조). 이러한 수정은 커넥터/인터페이스 보드/헤드스테이지를 위한 장착 영역의 수가 증가된 개조된 크라운 링만 사용하면 됩니다. 그러나 이 설계의 공간 제한은 동물 모델(이 경우 마우스)에 의해 결정되며, 이로 인해 여러 개의 프로브를 하나의 마이크로드라이브에 적층하는 것이 여러 마이크로드라이브를 서로 독립적으로 이식하는 것보다 설치 공간 측면에서 더 매력적입니다. 여기에 사용된 마이크로드라이브는 적층형 프로브를 지원할 수 있으며, 따라서 유일한 실제 제한 사항은 동물 모델에 의해 정의된 공간 및 무게 제약에 맞을 수 있는 헤드스테이지 또는 커넥터의 수입니다. 스페이서를 사용하여 수직이 아닌 장착 및 삽입 경로를 더욱 늘릴 수도 있습니다.
결론적으로, 이 프로토콜은 저렴하고 가벼우며 중요하게 조정 가능한 프로브 주입을 허용하며, 프로브 복구를 우선시하는 마이크로드라이브 설계의 추가 이점을 제공합니다. 이는 일회용 프로브의 엄청난 비용, 수술 및 이식 기술의 높은 장벽, 만성 이식을 위한 상용 솔루션이 고유한 사용 사례에 적응하기 어려운 경우가 많다는 사실을 해결합니다. 이러한 문제는 이미 급성 전기생리학을 사용하고 있는 실험실에 골칫거리이며, 아직 전기생리학 실험을 수행하지 않는 실험실에는 방해가 됩니다. 이 시스템은 이러한 한계를 넘어 만성 전기생리학 연구의 광범위한 활용을 촉진하는 것을 목표로 합니다.

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An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/66867">The DREAM Implant: A Lightweight, Modular, and Cost-Effective Implant System for Chronic Electrophysiology in Head-Fixed and Freely Behaving Mice</a>. The Authors&#160;section was&#160;updated.

Erratum: The DREAM Implant: A Lightweight, Modular, and Cost-Effective Implant System for Chronic Electrophysiology in Head-Fixed and Freely Behaving Mice

만성적으로 이식된 실리콘 프로브를 사용한 전기생리학은 유전적 및 실험적 다루기 쉬움으로 인해 행동하는 동물, 특히 마우스의 신경 활동과 연결성을 조사하는 강력한 기술로 부상했습니다1. 특히 층류 실리콘 프로브는 대뇌 피질 열2 내의 기능적 관계를 식별하고 이전에는 불가능했던 방식으로 대규모 신경 세포 집단의 역학을 행동과 관련시키는 데 매우 유용한 도구임이 입증되었습니다3.
생체 내 신경 활동을 기록하기 위한 현재의 황금 표준은 두 가지 보완적인 접근법이다: 이광자 현미경(two-photon microscopy)4,5 과 세포외 전기생리학(extracellular electrophysiology)6. 기록 방법의 선택은 얻을 수 있는 판독값의 특성을 제한합니다: 이광자 현미경은 시간이 지남에 따라 대규모 집단에서 개별적으로 식별 가능한 뉴런에 대한 종단 연구에 특히 적합하지만 높은 장비 비용으로 어려움을 겪고 있으며 온전한 뇌의 피질의 표층으로 제한됩니다. 또한 ~30Hz의 일반적인 시간 해상도는 진행 중인 뉴런 역학을 캡처하는 능력을 제한합니다 7,8.
이와는 대조적으로, 전기생리학적 기록은 높은 시간 해상도(최대 40kHz)를 제공하여 신경 세포 활동을 순간순간 추적할 수 있고, 대뇌 피질 깊이뿐만 아니라 종 전반에 걸쳐 광범위하게 적용할 수 있으며, 이광자 현미경에 비해 상대적으로 저렴한 설정을 제공합니다. 그러나 개별 뉴런의 식별과 뉴런 집단의 종단 추적은 달성하기 어렵습니다. 이는 특히 사극과 같은 와이어 전극 및 급성 전극 삽입에 적용됩니다. 기록세션 전반에 걸쳐 뉴런을 추적하는 능력이 부족할 뿐만 아니라9, 반복적인 급성 삽입은 면역 반응11을 일으키는 국소 외상(local trauma)10을 유발하여 감염 및 신경교증(gliosis)의 가능성을 증가시킨다. 이는 궁극적으로 기록된 신경 활동의 안정성과 실험 동물의 기대 수명을 감소시키고, 급성 전기생리학적 기록을 특징으로 하는 종단 연구의 범위를 단 몇 일로 제한한다12.
만성 고밀도 실리콘 프로브 기록은 급성 전기생리학과 이광자 이미징의 가장 우수한 특성 중 일부를 결합하는 것을 목표로 합니다. 그들은 세션 전반에 걸쳐 신경 집단 역학을 추적할 수 있으며, 이광자 이미징에 비해 개별 뉴런을 식별하는 능력은 다소 낮습니다13. 이러한 기록은 기록된 신호의 공간적 배치와 정밀한 시간적 해상도에 높은 유연성을 제공할 뿐만 아니라, 급성 기록에 비해 실험 동물의 수명과 복지를 향상시킨다14. 더욱이, 급성 기록과 대조적으로, 만성 전기생리학은 단 한 번의 주입 이벤트만 필요하므로 감염 및 조직 손상의 위험을 효과적으로 줄이고 동물에 대한 스트레스를 최소화합니다15. 이러한 장점들을 종합해 볼 때, 만성 전기생리학은 신경계의 조직과 기능을 조사하기 위한 강력한 도구가 됩니다.
그러나 마우스에 일반적으로 사용되는 만성 이식 기술은 연구자들이 행동 기록과의 호환성, 임플란트 무게, 임플란트의 복제 가능성, 재정적 비용 및 전반적인 사용 편의성 사이에서 상당한 절충안을 만들도록 제약합니다. 많은 임플란트 프로토콜은 프로브(16)의 재사용을 용이하게 하도록 설계되지 않아, 개별 실험의 유효 비용을 급격히 증가시키고, 따라서 일부 실험실에서 만성 전기생리학을 사용하는 것을 재정적으로 어렵게 만든다. 또한 광범위한 사내 프로토타이핑 및 설계 작업이 필요한 경우가 많으며, 이에 대한 전문 지식과 리소스가 없을 수 있습니다.
반면에, 통합 임플란트 시스템(17 )은 설치류의 만성 전기생리학을 위한 보다 광범위하게 접근 가능한 솔루션을 제공한다. 이 시스템은 프로브를 고정하는 마이크로드라이브를 임플란트의 나머지 부분과 통합하여 임플란트 취급 및 수술 절차를 단순화하도록 설계되었습니다. 그러나 일단 이식되면 이러한 시스템은 상단이 무거워질 수 있으며 실험자가 다른 목표 좌표에 맞게 실험을 유연하게 조정할 수 있는 능력을 제한할 수 있습니다. 종종, 그들의 무게는 더 작은 동물에 임플란트를 할 수 없게 하고, 잠재적으로 동물의 움직임을 손상시키며, 스트레스를 유발한다18. 이는 청소년 및 여성 코호트에 대한 연구에 불균형적으로 영향을 미칠 수 있으며, 체중 제한이 이러한 그룹에 더 영향을 미칠 가능성이 높기 때문입니다.
또한 모든 통합 시스템이 이식 후 전극 위치를 조정할 수 있는 것은 아닙니다. 이는 프로브 삽입(19)으로 인한 신경교증 또는 흉터, 특히 이식(20) 후 초기 48시간 동안에 기록된 뉴런 활성의 품질을 감소시킬 수 있기 때문에 관련이 있다. 프로브 삽입 깊이를 미세하게 조정하면 신호 무결성에 대한 이러한 부정적인 영향을 제한할 수 있습니다. 따라서 일반적으로 마이크로드라이브라고 하는 미세포지셔닝 메커니즘은 길이에 걸쳐 많은 수의 전극이 분포된 프로브에서도 유용할 수 있습니다.
이러한 트레이드오프를 극복하기 위해 당사는 가볍고 비용 효율적인 모듈식 솔루션을 제공하여 이전 설계의 한계를 해결하는 새로운 마우스용 만성 전기생리학 임플란트 시스템을 도입합니다. DREAM 임플란트 시스템은 무게가 쥐의 일반적인 체중의 10%(~2.1g) 미만으로 설계되어 동물 복지를 보장하고 행동에 미치는 영향을 최소화합니다. DREAM 임플란트 설계의 검증은 두개골에 하중이 가해질 때 설치류에서 상당한 영향을 받을 수 있는 운동과 같은 행동 주요 지표에 미치는 영향을 최소화하는 것으로 나타났습니다. 이는 동물의 복지를 증진하고 보다 윤리학적으로 건전한 실험을 허용함으로써 자유롭게 움직이는 동물과 머리가 고정된 동물을 활용하는 실험 패러다임에 도움이 될 수 있습니다.
이 시스템에는 최대 7mm의 기록 깊이를 유연하게 조정할 수 있는 마이크로드라이브가 포함되어 있으며 다양한 유형의 프로브 및 기록 장치에 적용할 수 있어 연구원에게 다양한 실험 응용 분야를 위한 비용 효율적이고 다재다능한 도구를 제공합니다. 이 시스템은 다른 시스템에 비해 일관된 프로브 회수율을 제공하고(예상 평균 회수율: 프로브당 약 3회의 신뢰할 수 있는 재사용) 개별 실험 비용을 크게 절감하는 금속 마이크로드라이브21과 일상적으로 결합됩니다.
이 설계는 3D 프린팅된 보호 패러데이 케이지를 특징으로 하여 전기 생리학적 노이즈, 기계적 충격 및 감염성 물질로부터 저렴하면서도 강력한 보호를 가능하게 하여 최소한의 감염률로 어려움을 겪으면서 안정적이고 노이즈 없는 녹음을 가능하게 합니다. 이 이식형 케이지는 충격 보호를 위해 설계되고 패러데이 케이지의 전도성 금속 메쉬 코팅을 위한 구조를 제공하도록 설계된 소위 '크라운'과 이식형 증폭기 및/또는 프로브 커넥터의 마운트 역할을 하는 크라운 링으로 구성됩니다( 그림 1 참조).
마지막으로, 모듈식 임플란트 시스템에 포함된 헤드플레이트는 임플란트에 추가적인 부피를 추가하지 않고도 새롭고 효율적인 헤드 고정 시스템과 호환되도록 설계되었습니다. 기존의 다른 시스템과 달리 임플란트 가까이에 작은 나사를 조일 필요가 없어 실험 설정에서 마우스의 고정 속도를 높이고 실험자-동물 관계 및 행동 순응도를 개선합니다. 동시에 헤드플레이트는 DREAM 만성 전기생리학 시스템의 다른 모듈을 구축하기 위한 베이스로 사용됩니다.
DREAM 임플란트의 디자인 파일은 https://github.com/zero-noise-lab/dream-implant/ 에서 오픈 소스 하드웨어로 게시됩니다. 다음 섹션에서는 DREAM 임플란트 시스템의 설계 및 제작에 대해 설명하고, 마우스 모델에서의 성공적인 구현을 시연하며, 기존 시스템과 비교하여 잠재적인 응용 분야와 이점에 대해 논의합니다.

<table><tbody><tr><td>0.05" 납땜 꼬리 소켓</td><td>밀-맥스</td><td>853-93-100-10-001000</td><td></td></tr><tr><td>1,1'-디옥타데실-3,3,3',3'- 시약 테트라메틸린도카보시아닌 퍼클로레이트 ('DiI'; DiIC18(3))</td><td>서모피셔</td><td>D282</td><td>탐침 위치를 조직학적으로 쉽게 확인하기 위해 사용되는 지친성 염료</td></tr><tr><td>접착 퍼티 (블루택)</td><td>보스틱</td><td>308590110</td><td>변형 제품(예: 프리트의 제품)은 문구점에서 구할 수 있어야 합니다</td></tr><tr><td>아가르</td><td>시그마 올드리치</td><td>A1296</td><td>전도도를 위해 식염수를 사용하세요.</td></tr><tr><td>앰프 (미니앰프-64)</td><td>케임브리지 뉴로텍</td><td></td><td>소형 및 이식형 증폭기와 디지타이저. 대체 이식형 디지타이저 또는 이식형 옴네틱스 커넥터 사용 가능.</td></tr><tr><td>진통제 크림 (EMLA 크림)</td><td>아스펜</td><td>39699/0088</td><td>수술 통증 완화에 사용되는 진통 크림으로, 프릴로카인, 리도카인이 포함되어 있습니다.</td></tr><tr><td>각진 스페이서</td><td>3DNeuro</td><td></td><td>비수직 구동 장착용 각도 스페이서.. 오픈 소스, https://github.com/zero-noise-lab/dream-implant/ 에서도 구매 가능</td></tr><tr><td>블루라이트 경화 LED</td><td>B.A. 인터내셔널</td><td>818223</td><td>프라이머 중합을 위한 경광. 420-480 nm 파장</td></tr><tr><td>본 왁스</td><td>SMI</td><td>Z046</td><td>두개골 절개술과 수술 후 탐침을 위한 왁스.</td></tr><tr><td>부프레노르핀</td><td>엘랑코 유럽 주식회사</td><td>401513</td><td>주사형 부프레노르핀 용액 (0.3 mg/mL)</td></tr><tr><td>구리 메쉬</td><td>덱스멧</td><td>3CU6-050FA</td><td>구리 망은 전기적, 물리적으로 프로브와 두개골 절개를 보호하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>시아노아크릴레이트 접착제 (록타이트)</td><td>록타이트</td><td>1363589</td><td>시아노아크릴레이트 젤 접착제</td></tr><tr><td>치과용 시멘트 (SuperBond C& B)</td><td>선 메디컬</td><td>K058E</td><td>치과용 시멘트 (슈퍼본드)</td></tr><tr><td>제모 크림 (Veet)</td><td>베트</td><td>310000091434</td><td>수술 부위 주변의 털을 제거하는 제모 크림.</td></tr><tr><td>엔로플록사신 (베이트릴)</td><td>엘랑코 유럽 주식회사</td><td>00879/4117</td><td>주사형 엔로플록사신 용액 (25 mg/mL)</td></tr><tr><td>패러데이 왕관</td><td>3DNeuro</td><td></td><td>3D 프린팅된 이식형 보호 케이지. 오픈 소스, https://github.com/zero-noise-lab/dream-implant/ 에서도 구매 가능</td></tr><tr><td>패러데이 링</td><td>3DNeuro</td><td></td><td>파라데이 케이지 이식형 3D 프린팅 보호 링. 오픈 소스, https://github.com/zero-noise-lab/dream-implant/ 에서도 구매 가능</td></tr><tr><td>정혈 해면(헤모스타틱)</td><td>SMI</td><td>ZHG101010</td><td>흡수성 젤라틴 정혈 해면</td></tr><tr><td>열 수축 튜빙</td><td>헬러만 타이튼</td><td>TA32-9/3 BK</td><td>부드러운 팁이 있는 겸자를 만들기 위한 열 수축 튜브</td></tr><tr><td>요오드</td><td>브라우놀</td><td>9322507</td><td>수용성 포비돈-요오드 용액.</td></tr><tr><td>메타미졸 (노발긴)</td><td>사노피-아벤티스 Gmbh</td><td>4527098</td><td>주사형 메타미졸 (500mg/mL)</td></tr><tr><td>메타미졸 (노발긴)</td><td>사노피-아벤티스 Gmbh</td><td>1553758</td><td>메타미졸 용액</td></tr><tr><td>마이크로드라이브 (R2 드라이브)</td><td>3DNeuro</td><td></td><td>복구 가능한 금속 마이크로 드라이브와 이동식 셔틀. 오픈 소스, https://buzsakilab.github.io/ 3d_print_designs/ 에서도 이용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>광유</td><td>시그마-올드리치</td><td>M5310-100ML</td><td>두개골 절개 보호 젤을 만들기 위해 용매로 오일을 사용했습니다.</td></tr><tr><td>탈모 방지 물티슈 (Kimtech)</td><td>킴텍</td><td>7552</td><td>탈모 방지 물티슈</td></tr><tr><td>프라이머</td><td>비스코</td><td>B-7202P</td><td>범용 두개골 접착제는 습기가 시멘트를 손상시키는 것을 막고 시멘트를 쌓을 수 있는 견고한 기반을 제공합니다.</td></tr><tr><td>R2Drive 홀더</td><td>3DNeuro</td><td></td><td>R2Drive 장착용 입체 고정 부착. 오픈 소스, https://buzsakilab.github.io/ 3d_print_designs/ 에서도 이용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>자가 부착 랩</td><td>3M</td><td>VB050</td><td>수술 후 임플란트용 보호 랩</td></tr><tr><td>실리콘 프로브 (H2)</td><td>케임브리지 뉴로텍</td><td></td><td>32채널의 만성 이식형 선형 실리콘 프로브. 대체 프로브 사용 가능성.</td></tr><tr><td>실리콘 엘라스토머 (듀라겔)</td><td>케임브리지 뉴로텍</td><td></td><td>실리콘 엘라스토머</td></tr><tr><td>실리콘 석고 (퀵캐스트)</td><td>WPI</td><td>퀵-캐스트</td><td></td></tr><tr><td>은 전도성 에폭시</td><td>MG 케미컬스</td><td>8331D-14G</td><td>은 에폭시</td></tr><tr><td>5 사이즈 듀몽 겸자</td><td>FSTools</td><td>11251-10</td><td>뼈 덮개를 들어 올리는 작은 겸자.</td></tr><tr><td>스테인리스 스틸 와이어, 테플론 코팅</td><td>과학 프로덕츠 GmBH</td><td>SS-3T</td><td>접지선</td></tr><tr><td>스테레오택스 (후륜구동)</td><td>후륜구동</td><td>68803</td><td>쥐 수술용 스테레오택스.</td></tr><tr><td>테르가자임</td><td>알코녹스</td><td>1304</td><td>효소 청소제로 청소할 수 있는 프로브</td></tr><tr><td>2단계 빠른 경화 에폭시 수지</td><td>고릴라</td><td>EP3</td><td>DREAM 임플란트 부품의 영구 접착을 위한 에폭시.</td></tr><tr><td>바나스 스프링 가위 둥근 손잡이</td><td>FSTools</td><td>15403-08</td><td>0.075mm 직선 팁 스프링 반동 수의학 가위입니다.</td></tr><tr><td>수의학용 시아노아크릴레이트 접착제 (Vetbond)</td><td>3M</td><td>70-0068-5256-3</td><td>수의학용 시아노아크릴레이트 접착제</td></tr></tbody></table>

dream implant: 머리가 고정되고 자유롭게 행동하는 마우스의 만성 전기생리학을 위한 가볍고 비용 효율적인 모듈식 임플란트 시스템

The DREAM Implant: A Lightweight, Modular, and Cost-Effective Implant System for Chronic Electrophysiology in Head-Fixed and Freely Behaving Mice

설치류의 만성 전기 생리학적 기록은 신경 역학과 그 행동 관련성에 대한 우리의 이해를 크게 향상시켰습니다. 그러나 프로브를 만성적으로 이식하는 현재의 방법은 비용, 사용 편의성, 크기, 적응성 및 장기적 안정성 간에 급격한 절충안을 제시합니다.
이 프로토콜은 현재 사용 가능한 옵션과 관련된 트레이드오프를 극복하도록 설계된 DREAM(Dynamic, Recoverable, Economical, Adaptable, and Modular)이라는 마우스용 새로운 만성 프로브 임플란트 시스템을 도입합니다. 이 시스템은 표준화된 하드웨어 요소를 갖춘 가볍고 모듈식이며 비용 효율적인 솔루션을 제공하며, 간단한 단계로 결합 및 주입할 수 있으며 회수 및 프로브의 여러 재사용을 위해 안전하게 이식할 수 있어 실험 비용을 크게 절감할 수 있습니다.
DREAM 임플란트 시스템은 세 가지 하드웨어 모듈을 통합합니다: (1) 모든 표준 실리콘 프로브를 운반할 수 있는 마이크로드라이브, 실험자가 최대 7mm의 이동 거리에서 기록 깊이를 조정할 수 있음; (2) 전기 차폐, 충격 보호 및 커넥터 배치를 위해 구리 메쉬로 덮인 웨어러블 패러데이 케이지를 위한 3차원(3D) 인쇄 가능한 오픈 소스 설계, (3) 동물 복지 및 사용 편의성 향상을 위한 소형 머리 고정 시스템. 해당 수술 프로토콜은 속도(총 소요 시간: 2시간), 프로브 안전성 및 동물 복지를 위해 최적화되었습니다.
임플란트는 동물의 행동 레퍼토리에 미치는 영향을 최소화하고, 자유롭게 움직이고 머리가 고정된 상황에 쉽게 적용할 수 있으며, 임플란트 후 몇 주간의 데이터 수집 동안 명확하게 식별 가능한 스파이크 파형과 건강한 신경 반응을 제공했습니다. 감염 및 기타 수술 합병증은 극히 드물었습니다.
따라서 DREAM 임플란트 시스템은 생쥐의 만성 전기 생리학을 위한 다재다능하고 비용 효율적인 솔루션으로, 동물의 웰빙을 향상시키고 보다 윤리학적으로 건전한 실험을 가능하게 합니다. 이 설계는 다양한 연구 요구에 따라 실험 절차를 단순화하여 광범위한 연구 실험실에 대한 설치류의 만성 전기 생리학에 대한 접근성을 높입니다.

이 프로토콜은 연구자가 행동하는 마우스에서 가볍고 비용 효율적이며 안전한 만성 전기 생리학 기록을 구현할 수 있도록 하는 만성 이식 시스템을 제공합니다(그림 1). 이 접근법의 성공적인 적용을 결정하는 주요 요인에는 두개골의 완전한 시멘트 적용 범위, 최소 침습적이고 적절하게 보호되는 개두술, 두개골에 대한 마이크로드라이브 및 배선의 안전한 부착 및 보호용 패러데이 재료의 완전한 연속성이 포함됩니다. 이러한 점을 고려하면 일관되게 고품질 녹음에 도달할 수 있습니다. 다음은 수술 성공의 다음과 같은 주요 측면과 관련된 대표적인 결과를 보여줍니다.
1) 임플란트가 동물의 행동이나 복지를 방해합니까? 2) 신호 품질이 높으며 신호를 장기간 유지할 수 있습니까? 3) 녹음을 작업 수행과 쉽게 결합할 수 있습니까?
임플란트가 동물 행동에 미치는 영향을 평가하기 위해 임플란트를 이식한 5마리의 추적된 운동 패턴을 분석했습니다. 그림 2A 는 임플란트 전과 이식 후 1주일 동안 10분 동안 놀이 케이지 안에서 자유롭게 움직이는 동물의 예를 보여줍니다. 움직임 패턴이 변하지 않았음을 알 수 있습니다. 이 관찰은 동물 간의 이동 속도와 머리 방향의 분포를 보여주는 그림 2B, C 에 의해 확인됩니다. 달리기 속도와 머리 방향은 이식 전과 후 모두 큰 변화가 없었으며, 오히려 수술 후 달리기 속도가 약간 증가한 것 같았습니다. 보충 비디오 1 은 이식 수술 후 6일 후의 동물의 짧은 비디오 녹화를 보여줍니다. 가정 환경에서의 이동, 그루밍, 양육 및 먹이 찾기와 같은 일반적인 홈 케이지 행동은 모두 볼 수 있으며 수술 후 성공적인 회복과 전반적인 건강 상태를 나타냅니다. 임플란트의 행동에 미치는 영향이 낮은 것은 가벼운 무게와 관리 가능한 높이 때문일 가능성이 큽니다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66867/66867fig02.jpg"> 그림 2: 수술 전과 후의 운동. (A) 이식 전(왼쪽 패널)과 후(오른쪽 패널) 동물의 운동 예시. x/y 좌표는 센티미터 단위이며, 포인트는 10분 동안 각 시점에서 동물의 위치를 나타냅니다. (B) 5마리의 동물에 이식하기 전 5개 세션과 이식 후 3개 세션에 대한 이동 속도 분포(cm/s). (C) (B)에서 분석된 동일한 세션에 대해 다른 방향으로 이동할 확률에 대한 커널 밀도. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66867/66867fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
다음으로, LFP(Local Field Potential)의 신호 품질과 레코딩 사이트 전반의 스파이킹 활동을 평가합니다. 여기에서는 1차 시각 피질(V1)의 대뇌 피질 기록의 대표 데이터를 보여줍니다. 검증을 위해 Kilosort 3을 사용하여 깨어 있는 쥐의 V1에 기록된 광대역 신경 신호에서 추정 단일 단위 활동을 추출했습니다( 그림 3 참조). 그림 3A 는 프로브 섕크에서 추출된 단일 단위의 위치를 보여주고, 그림 3B 는 해당 스파이크 파형을 보여주며, 그림 3C 는 전류 소스 밀도(CSD) 프로토콜에 대한 동일한 뉴런의 스파이크 반응을 보여줍니다. 이 패러다임에서는 200번의 시도에 걸쳐 1Hz의 주파수(즉, 300ms 켜짐, 700ms 꺼짐)에서 광시야 플래시가 300ms의 지속 시간으로 제공되었습니다. 마지막으로, 그림 3D 는 회색 배경에 무작위로 선택된 흑백 사각형의 2000개 프레임으로 구성된 시각적 수용 필드 매핑 프로토콜에 대한 동일한 단위의 응답을 보여주며, 각 프레임은 16.6ms 동안 표시됩니다. 사각형은 각각 12도의 시각적 각도를 포함하며 15 x 5 가능한 위치의 필드에서 선택되어 매핑 패러다임이 총 -90도에서 +90도의 방위각과 -30도에서 +40도의 고도의 시각적 공간을 포함하도록 했습니다. 각 자극 프레임에 대한 발사 속도 응답은 16.6ms 창에서 최대 발사 속도를 분석하여 추출되었으며, 각 창의 최대 활동을 기반으로 채널당 최적으로 식별된 40-140ms 사이의 지연이 적용됩니다. 이러한 유형의 기록은 각 전극의 삽입 깊이를 조정하고 임플란트 수술 후 신호 품질을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66867/66867fig03.jpg"> 그림 3: 기록된 뉴런 신호. (A) 프로브의 전극 접점을 따라 Kilosort 3 스파이크 분류 패키지로 정렬된 단일 장치의 추론된 위치. (B) 5ms의 시간에 걸쳐 A에 표시된 동일한 단위에 대한 스파이크 파형. 가는 선: 개별 스파이크 파형. 굵은 선: 평균 스파이크 파형. (C) 300ms 광시야 플래시와 700ms 블랙 스크린을 나타내는 CSD(Current Source Density) 패러다임에 대한 응답으로 스파이크의 래스터 플롯. A와 B와 동일한 단위에 대한 응답이 표시됩니다. 겹쳐진 컬러 라인은 동일한 반응의 PSTH(Peri-Stimulus Time Histogram)를 나타냅니다. PSTH의 발사 속도는 10ms bins로 계산된 다음 전체 PSTH에서 최대 발사 속도로 정규화되었습니다. 시간 0은 광시야 플래시 자극을 중심으로 합니다. (D) A-C와 동일한 단위의 추정된 수용 필드로, Sparse Noise Receptive Field Mapping 패러다임으로 측정되었습니다. 각 플롯은 흰색 및 검은색 사각형 자극의 시작(왼쪽 패널) 또는 오프셋(오른쪽 패널)에 대한 응답으로 16.6ms 분석 창 동안의 평균 발사 속도 활동을 보여줍니다. 자극은 16.6ms 동안 가로로 180도의 시야각, 세로로 70도의 시야각에 걸쳐 5 x 15 정사각형 그리드에 무작위로 배치되어 제시되었습니다. 발사 속도 활동은 전체 수용 필드 그리드에서 z-점수가 매겨졌습니다(색상 막대 참조). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66867/66867fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
녹음 품질은 몇 주에서 몇 달 동안 반복된 녹음에서도 높게 유지되었습니다. 그림 4A는 15주 동안 한 동물의 종단적 LFP 기록을 보여줍니다. LFP는 위에서 설명한 CSD 패러다임에 대한 응답으로 기록되었습니다(그림 3A-C 참조). 그림 4A는 플래시 시작 후 500ms 후의 평균 LFP 응답을 보여줍니다. 이 예에서는 전극 간 거리가 25μm인 32개의 채널이 있는 선형 프로브를 사용했습니다. 18일째에는 프로브 깊이를 조정하여 프로브를 600μm 아래쪽으로 이동했습니다. 이 조정 전후에 LFP 신호는 녹화일 내내 안정적으로 유지되었습니다.
이와 일치하게, 추정되는 단일 단위의 스파이크 파형은 많은 녹음에서 식별할 수 있었습니다. 그림 4B 는 한 달간의 녹음에 걸쳐 3개의 녹음 세션에서 얻은 대표적인 스파이크 파형을 보여주며, 시간이 지남에 따라 단일 장치 활동을 성공적으로 식별할 수 있음을 보여줍니다. 그림 4C 는 최대 100일에 걸쳐 6마리의 동물에서 만성 기록에서 추출한 추정 단일 단위의 전체 수를 보여줍니다. 단일 단위는 kilosort 3.0의 기본 기준에 따라 정의되었습니다( 보충 표 1 참조). 보시다시피, 명확하게 정의 된 단일 단위의 수는 일반적으로 이식 후 첫 주에 ~ 40에 달했으며 점차적으로 감소하여 ~ 20 단위의 명백하게 안정적인 점근선으로 이동했습니다. 이러한 기록이 선형 32채널 프로브를 사용하여 수행되었다는 점을 감안할 때, 이는 이식 직후 전극당 약 1.25개의 단일 단위의 예상 수율과 동일하며, 장기 기록에서는 전극당 약 0.65개의 단일 장치로 감소합니다. 세션에 걸쳐 임플란트의 증폭기/커넥터에 반복적으로 연결하는 것은 증폭기/커넥터를 고정하는 패러데이 크라운이 표준 커넥터에 필요한 최대 결합력보다 큰 10뉴턴 이상의 반복적인 힘을 견딜 수 있기 때문에 녹음 품질이나 임플란트 안정성에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났습니다( 보충 비디오 2 참조).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66867/66867fig04.jpg"> 그림 4: 시간 경과에 따른 신경 세포의 안정성. (A) 이식 후 3-110일 동안 만성적으로 이식된 프로브의 32개 채널 모두에서 표시된 광시야 플래시 CSD 자극에 대한 평균 LFP 활성. 빨간색 수직선은 수술 후 18일째까지 뇌 외부에서 채널 0-8 녹음으로 인해 프로브가 새로운 위치로 내려가고 있음을 나타냅니다. (B) 동일한 만성 임플란트에서 4주에 걸쳐 반복적으로 기록된 3개의 예시 단위의 스파이크 파형. 가는 선: 개별 스파이크 파형. 두꺼운 중첩 선: 평균 스파이크 파형입니다. (C) 6마리의 동물에 대해 기록일 동안 Kilosort 3에 의해 감지된 추정 단일 단위의 수(삽입 범례 참조). 빨간색 사각형은 프로브가 이동된 날짜를 나타냅니다. 점선은 이러한 기록에 사용된 임플란트당 전극의 수를 나타냅니다(32). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66867/66867fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
마지막으로, 이 프로토콜은 마이크로드라이브, 웨어러블 패러데이 케이지, 임플란트 베이스 및 머리 고정 장치로도 사용할 수 있는 헤드플레이트를 포함한 모듈식 시스템을 제공함으로써 만성 전기 생리학과 머리 고정 동작의 통합을 가능하게 합니다. 여기에서는 구형 트레드밀에서 가상 환경을 횡단하는 쥐의 예제 데이터를 보여줍니다. 그림 5A 는 예시 시험에서 20단위의 달리기 관련 스파이킹 활동을 보여줍니다. 그림 5B 는 개별 스파이크 분류 단위의 달리기 속도와 스파이크 활동 사이의 다양하지만 강력한 관계를 보여주며, 그림 5C에서 동일한 효과에 대한 개체군 평균을 보여주며, 설치류 V124의 신경 활동에 대한 운동 활동의 잘 확립된 효과를 확인합니다.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66867/66867fig05.jpg"> 그림 5: 머리가 고정된 행동 동안의 신경 세포 반응. (A) 예시 시험에서 모든 단일 단위의 달리기 속도(보라색 선)와 평균 발사 속도(연한 파란색 선)가 겹쳐진 단일 단위 반응의 래스터 플롯. (B) 다양한 달리기 속도 범주 동안의 단일 단위 활동, 6개의 예제 단위에 대해 표시됨. (씨) 하나의 예제 세션에서 모든 단일 단위에 걸친 평균 스파이크 활동으로, 주행 속도 분포의 5개 퀴니타일에 걸쳐 표시됩니다. 이 세션의 달리기 속도는 0에서 0.88미터/초 사이였습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66867/66867fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 표 1: 그림 3, 그림 4 및 그림 5에 표시된 녹음에서 단일 단위를 식별할 때 Kilosort 3에서 사용하는 기본 매개변수를 보여주는 표입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66867/Supplementary%20Table%201.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 비디오 1: 임플란트 후 동물의 운동 활동을 보여주는 비디오. 5일간의 회복 단계 후 촬영한 비디오는 정상적인 운동 행동과 임플란트의 크기 및 무게에 대한 적응을 보여줍니다. 이 동물은 일반적으로 환경 풍부화가 들어있는 놀이 케이지를 탐색하는 것을 볼 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66867/Supplementary%20video%201.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 비디오 2: 조립된 패러데이 크라운에 힘이 가해지는 것을 보여주는 비디오. 패러데이 크라운이 견디는 힘은 4핀 극성 나노 커넥터와 같은 표준 커넥터에 필요한 연결 힘보다 약 한 자릿수 더 큽니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66867/Supplementary%20Video%202.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 1: 드라이브 홀더의 이미지를 보여주는 그림. 인쇄 가능한 디자인 파일은 해당 Github 저장소(https://github.com/zero-noise-lab/dream-implant/)에서 찾을 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66867/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 2: 구리 메시를 위한 템플렛. 원래 배율로 템플릿을 인쇄하고 스텐실을 사용하여 구리 메쉬를 잘라냅니다(2.12단계). 축척 막대를 사용하여 확인하고 필요한 경우 인쇄물의 축척을 조정합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66867/Supplementary%20Figure%202.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 3: 수술 중 임플란트의 조립 단계를 보여주는 사진 시리즈. 이 경우 두 개의 마이크로 드라이브와 두 개의 증폭기가 설치됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66867/Supplementary%20Figure%203.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 4: 드라이브, 개두술(녹색) 및 GND/REF 핀(빨간색)의 배치 예를 보여주는 쥐 두개골 그림. 핀 위치는 소뇌에 위치하기 때문에 제안되며, 이는 대뇌 피질 기록을 방해하지 않을 것입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66867/Supplementary%20Figure%204.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

여기에서는 설치류의 만성 전기 생리학을 위한 가볍고 비용 효율적인 프로브 임플란트 시스템을 소개하며, 사용 편의성, 프로브 회수율, 실험적 다양성 및 행동과의 호환성에 최적화되어 있습니다.

DREAM Implant: 머리가 고정되고 자유롭게 행동하는 마우스의 만성 전기생리학을 위한 가볍고 비용 효율적인 모듈식 임플란트 시스템

Chronic electrophysiological recordings in rodents have significantly improved our understanding of neuronal dynamics and their behavioral relevance. ...

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

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행동의 신경 기질을 이해하려면 뇌 회로 앙상블 녹음이 필요합니다. 유전적 다루기 쉬움 때문에 생쥐는 회로 해부 및 질병 모방에 대한 모델을 제공합니다. 여기에서는 마우스의 뇌 심부 구조를 표적으로 하기에 적합한 소형 프로브를 설계 및 제작하는 방법에 대해 설명한다.

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여기에서 우리는 현재 최대 10개의 분산된 뇌 영역에서 대칭적인 양측 와이어 전극 기록이 가능한 TD Drive라는 독특한 쥐용 3D 프린팅 가능한 임플란트를 소개합니다.

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우리는 동시 녹음 및 신경 자극 기능이있는 조명 headstage 사전 증폭기 시스템을 설계 및 구축에 저렴한 비용으로 방법을 제시한다. 이 장치는 수영을 동물에 사용하기 위해 waterproofed 수 있습니다.

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