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```html
<table><tbody><tr><td>-80 &deg;C 저장</td><td></td><td></td><td>세포 배양용</td></tr><tr><td>물에 0.1% 젤라틴</td><td>MilliporeSigma</td><td>ES-006-B</td><td>세포 배양용</td></tr><tr><td>0.2 &micro;m 필터 유닛</td><td>Fisher</td><td>04-977-158</td><td>세포 배양용</td></tr><tr><td>0.5% trypsin-EDTA (10X)</td><td>ThermoFisher</td><td>15400-054</td><td>세포 배양용</td></tr><tr><td>1 M MgCl2</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9010</td><td>용해 및 친화성 정제용</td></tr><tr><td>1 M Tris pH 7.5</td><td>ThermoFisher</td><td>15567027</td><td>용해 및 친화성 정제용</td></tr><tr><td>1 M Tris pH 8</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9855G</td><td>옵션: 내인성 리보솜 단백질 로커스에 FTA 삽입용</td></tr><tr><td>1.5 및 2 mL 미세원심분리관, 오토클레이브</td><td></td><td></td><td>형질주입용</td></tr><tr><td>1.5, 2 mL 및 5 mL 단백질 저결합 미세원심분리관</td><td>Eppendorf</td><td>022431081, 022431102, 0030108302</td><td>용해 및 친화성 정제용</td></tr><tr><td>10 cm 조직 배양 판</td><td></td><td></td><td>세포 배양용</td></tr><tr><td>10 M NaOH</td><td>MilliporeSigma</td><td>72068-100ML</td><td>용해 및 친화성 정제용</td></tr><tr><td>10x Tris/glycine/SDS 런닝 버퍼 농축액</td><td>Bio-Rad</td><td>1610772</td><td>웨스턴 블롯용</td></tr><tr><td>37 &deg;C 조직 배양 인큐베이터 x 2</td><td></td><td></td><td>세포 배양용. 하나는 세포 배양 및 형질주입 세포의 조명을 위한 주요 인큐베이터로 사용되며, 일시적인 공간은 ALIBi 활성화 당일 2차 인큐베이터에서 형질주입 세포를 수용하기 위해 필요합니다. 주요 인큐베이터에서 트랜스일루미네이터를 설치하는 동안.</td></tr><tr><td>37 &deg;C 수조</td><td></td><td></td><td>세포 배양용</td></tr><tr><td>5 M NaCl</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9010</td><td>용해 및 친화성 정제용</td></tr><tr><td>50 mM 비오틴</td><td>ThermoFisher</td><td>B20656</td><td>용해 및 친화성 정제용</td></tr><tr><td>6x Laemmli 버퍼</td><td>FIsher</td><td>50-196-784</td><td>웨스턴 블롯용</td></tr><tr><td>70% 에탄올</td><td></td><td></td><td>소독용</td></tr><tr><td>아세토니트릴</td><td>Fisher</td><td>A955</td><td>옵션: 질량 분석기 샘플 준비용</td></tr><tr><td>AcTEV 프로테아제 키트</td><td>ThermoFisher</td><td>12575015</td><td>용해 및 친화성 정제용</td></tr><tr><td>ALIBi C-fragment 플라스미드</td><td>Addgene</td><td>#235615, 235636 &ndash; 235641</td><td>형질주입용 미디-프레핑 규모 필요</td></tr><tr><td>ALIBi N-fragment 플라스미드</td><td>Addgene</td><td>#235614, 235635, 235642, 235643</td><td>형질주입용 미디-프레핑 규모 필요</td></tr><tr><td>알루미늄 호일</td><td></td><td></td><td>용해 및 친화성 정제용</td></tr><tr><td>암모늄 비카보네이트</td><td>MilliporeSigma</td><td>5.3305</td><td>옵션: 질량 분석기 샘플 준비용</td></tr><tr><td>anti-FLAG 항체</td><td>MilliporeSigma</td><td>F3165</td><td>웨스턴 블롯용</td></tr><tr><td>anti-GAPDH 항체</td><td>Cell Signaling</td><td>5174</td><td>웨스턴 블롯용</td></tr><tr><td>anti-mouse 이차 항체</td><td>GE Healthcare</td><td>NA931V</td><td>웨스턴 블롯용</td></tr><tr><td>anti-rabbit 이차 항체</td><td>GE Healthcare</td><td>NA934V</td><td>웨스턴 블롯용</td></tr><tr><td>anti-Rpl12 항체</td><td>Abcam</td><td>ab175219</td><td>웨스턴 블롯용</td></tr><tr><td>anti-Rpl31 항체</td><td>Abcam</td><td>ab103991</td><td>웨스턴 블롯용</td></tr><tr><td>anti-Rpl5 항체</td><td>ProteinTech</td><td>15430-1-AP</td><td>웨스턴 블롯용</td></tr><tr><td>anti-V5 항체</td><td>ThermoFisher</td><td>R960-25</td><td>웨스턴 블롯용</td></tr><tr><td>Apyrase</td><td>NEB</td><td>M0398L</td><td>용해 및 친화성 정제용</td></tr><tr><td>베타-머캅토에탄올 (55 mM)</td><td>ThermoFisher</td><td>21985-023</td><td>세포 배양용</td></tr><tr><td>청색 광 트랜스일루미네이터</td><td>Clare Research Chemical</td><td>DR46B (소형) 또는 DR196 (대형)</td><td>용해 및 친화성 정제용</td></tr><tr><td>소성 알부민 (BSA)</td><td>Fisher</td><td>BP1600-100</td><td>웨스턴 블롯용</td></tr><tr><td>C18 팁 (OMIX C18 팁)</td><td>Agilent</td><td>A57003100</td><td>옵션: 질량 분석기 샘플 준비용</td></tr><tr><td>세포 동결 용기</td><td></td><td></td><td>세포 배양용</td></tr><tr><td>15 mL 및/또는 50 mL 원추형 튜브용 원��

재조합 펩타이드 태그 특이적 위치 제한 조명 증강 비오티닐화를 기반으로 한 세포 내 리보솜 하위 집단의 분리

Isolation of Subcellular Ribosome Subpopulations Based on Recombinant Peptide Tag-Specific Location-Restricted Illumination-Enhanced Biotinylation

Growing evidence suggests that mRNA translation is a highly compartmentalized process within a cell, and that subcellular trafficking and localization of ...

Our research investigates how ribosome composition and mRNA translation vary across subcellular domains to regulate local protein synthesis. Current methods lack spatial and temporal precision. ALIBi addresses this through optogenetically controlled proximity labeling of ribosomes.To begin, obtain L31FTA mouse embryonic stem cells and transfect them with ALIBi, GFP control, or full length BirA plasmids. After 24 to 48 hours of transfection, pre-chill the centrifuge to four degrees Celsius. With the lights off, move the transfected plates to a temporary 37-degree Celsius incubator.To prevent temperature fluctuations, once the transilluminator is placed in the main incubator, using 70%ethanol, wipe down the blue light transilluminator. After connecting the transilluminator to power, place it in the main incubator. Allow the incubator conditions to reequilibrate, while continuing the setup.Warm an aliquot of media to 37 degrees Celsius for dosing with biotin and cyclohexamide, or CHX. If preparing control samples without supplemental biotin, warm a separate aliquot for CHX-only dosing. Chill an aliquot of DPBS intended for CHX dosing.Prepare the RNase removal buffer, salt wash, lysis buffer, and wash buffers. Using a pipette, mix buffers containing dense or viscous components to ensure even mixing. Chill the prepared buffers on ice before use.Re-suspend the stock bottle of streptavidin beads by gentle pipetting or rocking. Transfer 450 microliters of beads into a protein low binding tube for each 10 centimeter plate of cells. Place the re-suspended beads on the magnetic rack for one minute, or until the beads have fully migrated.Aspirate and discard the bead storage buffer without touching the bead pellet. Wash the beads two times with 900 microliters of RNAs removal buffer. Wash the beads once with 900 microliters of salt wash.Wash the beads two times with 900 microliters of wash I buffer. Store the beads in the wash I buffer at four degrees Celsius while performing activation and cell lysis. Add biotin and CHX to the warmed aliquot of media and keep at 37 degrees Celsius until use.Add CHX to the cold DPBS aliquot and keep it chilled until use. Aspirate the media from the transfected plates. Immediately add 10 milliliters of warm media containing CHX with or without Biotin to each plate.Place negative control plates in a dark incubator. Place the remaining plates directly on top of the transilluminator. Turn on the transilluminator and incubate the plates for 15 minutes.Wash each plate two times with the 10 milliliters of cold DPBS containing CHX. Place the plates on ice between and after washes. After aspirating the second wash, tilt the plate and aspirate any residual DPBS.Keeping the plate flat on ice, add two milliliters of ice-cold lysis buffer and incubate the plate on ice for five minutes. Tap the plate two to three times during incubation to dislodge cells. Using a micropipette, pipette the lysate up and down across the plate surface to dislodge any remaining cells.Transfer the lysate to a chilled labeled protein low binding tube. In difficult to lyse organelles, sonicate all samples for 45 seconds at four degrees Celsius. And if required, transfer the lysate into a larger tube before sonication.Transfer the sonicated lysate into a two-milliliter tube. Incubate the lysate on ice for 15 minutes. Centrifuge the lysate at 17, 000 G for three minutes at four degrees Celsius.Transfer the supernatant into a chilled protein low binding tube without disturbing the pellet. Using a magnetic rack, pellet the washed strepped avident beads. Aspirate the wash one buffer.Transfer 1, 200 microliters of clarified lysate to the tube containing the washed beads. Pipette up and down gently to re-suspend the beads. Store the remaining clarified lysate at minus 80 degrees Celsius.Incubate the lysate with the beads at four degrees Celsius in the dark on a tube rotator for one hour. During the incubation, prepare the Tobacco Etch Virus, or TEV elution buffer. Pellet the beads on a magnetic rack.Transfer the supernatant to a chilled protein low binding tube. Store the supernatant at minus 80 degrees Celsius. Wash the beads two times with 900 microliters of wash I buffer and once with 900 microliters of wash II buffer.Add 450 microliters of TEV elution buffer to the beads. Incubate the beads in TEV elution buffer for one hour at room temperature on a tube rotator. Pellet the beads on the magnetic rack.Transfer the elute to a protein low binding tube. Store the eluate at minus 80 degrees Celsius if proteomics analysis or Western blot is intended. Cells containing all system components showed a L31-FTA band, which was stronger with full length burray and faint or absent when components were omitted.Endogenous biotinilated carboxylase proteins were detected in all lysates at 70 to 80 kilodaltons and 120 to 130 kilodaltons. ANTV5 probing confirmed expression of the split bore fragments. Biotinillated L31FTA decreased in the flow through relative to the lysate.No biotinillated L31-FTA was present in the eluate following TEV-mediated elution. Anti-flag probing showed a cleaved L31-FTA band at a lower molecular weight than intact L31-FTA ribosomal protein. S12 probing demonstrated the presence of the small ribosomal subunit in the eluate.Anti-V5 probing showed that proteins that do not bind the ribosome were absent from the eluate. When 2.5 fold more lysate was used with the same 450 microliters of streptavidin coated beads, a substantial amount of biotinilated L31-FTA remained in the flow through. Endogenous biotinilated proteins were partially depleted in the flow through.Endogenous biotinillated proteins were absent from the eluet, but were recovered after heating post-dilution beads in lambly buffer. Anti-flag probing detected cleaved L31-FTA at a lower molecular weight than intact L31-FTA. Anti-V5 probing showed that the split burray fragments were absent from the eluate.ALIBi enables the identification of ribosome-bound proteins and mRNAs in specific subcellular regions, revealing differences in translation regulation. The key challenge is maintaining specific proximity labeling through careful control of targeting construct expression and illumination conditions. Following this protocol, affinity purified ribosomes and associated mRNAs can be analyzed using quantitative proteomic and transcriptomic approaches.

isolation-subcellular-ribosome-subpopulations-based-on-recombinant

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

어렸을때 peptidyl - tRNAs를 포함하는 리보솜의 생화 학적 분석에 대한 주요 장애가 동일한 샘플의 다른 변이의 존재를했습니다, 분석되는 특정 mRNA 순서의 번역에 참여하지 리보솜. 우리는, 독점적으로, 관심의 초기 peptidyl - tRNA를 포함하는 변이를 정화하는 간단한 방법을 개발했습니다.

기능 및 구조 분석을위한 Peptidyl - tRNAs를 포함 번역 리보솜의 분리

mRNA의 translational 일시 사이트를 식별하는 기술은 설명되어 있습니다. 이 절차는 denaturing 겔 전기 영동을 사용하여 초기 체인의 크기를 분석하여 다음 타겟 mRNA의 체외 번역의 도중에 변이를 축적 초기 polypeptides의 분리에 근거한다.

Ribosome 바운드 초기 Polypeptides의 분리<em&gt; 체외에서</em&gt; mRNA 함께 Translational 일시 중지 사이트를 식별하려면

우리는 지금 여기 정기적으로 안정적으로 바운드 ribosome 초기 체인 단지 (RNCs)를 분리하는 데 사용되는 기술을 설명합니다. 이 기술은 17 아미노산 긴 SecM "체포 시퀀스는"prokaryotic에서 번역 신장을 중지할 수있는 발견의 활용...

Ribosome 바운드 Polypeptides을 파악하는 도구로 SecM 체포 시퀀스를 사용하여

exosomes에있는 HIV-1 Nef의의 분비를 기본 메커니즘을 해부하는 방법이 설명되어 있습니다. 네프 단백질 형질 전환에서 파생 된 특정 짧은 펩티드의 구조, 기능 및 네프의 분비 수정 지역의 바인딩 파트너를 결정하는 데 악용되었다. 이러한 절차는 많은 역학적 연구에서 일반적으로 관련이 있습니다.

기능 모티브과 바인딩 파트너 펩타이드 기반의 식별

이 프로토콜은 생체 CNS 샘플의 translatome을 연구하기 위해 polyribosome 분별의 필수 수정 사항을 보여줍니다. 그것은 분리와 결합 RNA의 분수를 리보솜에 총 RNA의 비교를 통해 번역 및 전사 조절의 종합 평가를 할 수 있습니다.

Polyribosome 분별에 의한 중추 신경계 Translatome의 생체 심문

여기에서는 광친화성 라벨링을 사용하여 소분자 결합 단백질을 식별하는 방법을 설명합니다. 이 기술의 장점은 살아있는 세포 환경 내에서 표적 단백질의 결합 및 공유 라벨링이 발생하여 세포 용해 시 네이티브 단백질 구조 및 결합 조건을 파괴할 위험을 제거한다는 것입니다.

라이브 셀 Photoaffinity 라벨에 의해 기본 셀룰러 환경에서 작은 분자 결합 단백질의 식별

우리는 복잡한 생물학적 샘플에서 유비퀴틴화 된 단백질에서 유래 한 diGly 펩티드의 정제, 검출 및 식별방법을 제시합니다. 제시된 방법은 유비퀴티노메 분석의 깊이 수준에 대하여 공표된 방법을 재현가능하고 견고하며 능가합니다.

펩타이드 농축 및 질량 분광법에 의한 단백질 유비퀴틴화 부위 검출

여기서, 우리는 리보태그 시스템을 사용하여 성인 남성 마우스 생식세포의 선택집단으로부터 리보솜 및 관련 RNA의 면역침전을 기술한다. 전략적 번식과 신중한 면역 침전은 세균 세포 트랜스라토메에 알리고 돌연변이 표현형의 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하는 깨끗하고 재현 가능한 결과를 초래합니다.

남성 마우스의 생식 세포에서 리보태그 면역 강하

단일 분자 형광 에너지 전달은 리보소말 단백질 합성 시 tRNA 역학을 추적하는 방법입니다. 개별 리보솜을 추적함으로써, 불동성 집단 집단이 식별되어 메커니즘에 빛을 비추게 됩니다. 이 방법은 다른 많은 복잡한 생물 시스템에서 동적 기능 관계를 밝히기 위해 일반적으로 생물학적 형성 변화를 추적하는 데 사용할 수 있습니다. 단일 분자 방법은 평균 효과로 인해 기존의 앙상블 방법에 의해 접근할 수 없는 비비율 제한 단계 및 낮은 인구밀도키 중간체를 관찰할 수 있다.

리보솜 단백질 합성의 단일 분자 형광 에너지 전송 연구

공동 번역 상호 작용은 초기 체인 수정, 타겟팅, 폴딩 및 조립 경로에서 중요한 역할을합니다. 여기에서, 우리는 선택적 리보솜 프로파일링, 생체 내에서, 모델 진핵생물 사카로마이세스 세레비시아에서 이러한 상호작용의 직접적인 분석을 위한 방법을 설명한다.

선택적 리보솜 프로파일링을 통한 공동 번역 상호 작용 네트워크의 글로벌 식별

우리는 프로테옴 규모에서 단백질 발견 및 정량화와 호환되는 고품질 미토콘드리아 분리를 위한 2단계 프로토콜을 제시합니다. 우리의 프로토콜은 유전 공학을 필요로하지 않으므로 모든 일차 세포와 조직에서 미토콘드리아를 연구하는 데 적합합니다.

단백질 발견 및 정량 분석을 개선하기 위한 미토콘드리아의 2단계 태그 없는 분리

Stanford School of Medicine.  AviTag 특이적 위치 제한 조명 증강 비오티닐화(ALIBi)는 리보솜의 아세포 집단을 표지하고 친화력을 정제하기 위해 개발된 새로운 광유전학 활성화 방법으로, 하위 시퀀싱과 단백질체 분석을 위해 개발되었습니다.

재조합 펩타이드 태그 특이적 위치 제한 조명 증강 비오티닐화를 기반으로 한 세포 내 리보솜 하위 집단의 분리

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