Name: MCF-7 세포의 산화 DNA 손상을 평가하기 위해 ELISA 분석을 사용하여 8-oxo-dG 수준 정량화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-24T14:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 13 s
Description: 배우세요 MCF-7 세포에서 ELISA를 이용한 8-oxo-dG 정량화 방법으로 산화 DNA 손상을 효율적으로 평가하는 기술입니다. 이 프로토콜은 질병과 노화 연구에 활용됩니다.

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이 작업은 장쑤 고등 교육 기관 과학 기술 혁신 연구팀(2021), 장쑤 직업 대학 공학 기술 연구 센터 프로그램(2023), 쑤저우 인민 생활 기술 프로젝트 중점 기술 프로그램(SKY2021029), 장쑤 임상 자원 바이오뱅크(TC2021B009) 공개 프로젝트, 국가 방사선 의학 및 보호 중점 연구소 프로젝트의 지원을 받았습니다. Soochow University(GZK12023013), Suzhou Vocational Health College(SZWZYTD202201) 프로그램, 중국 장쑤성 Qing-Lan 프로젝트(2021, 2022).

1.MCF-7 세포에서 H2O2 유도 DNA 산화 손상 모델 구축
<ol><li>MCF-7 세포 회수<ol><li>3.5 x 106 MCF-7 세포가 들어 있고 -80°C 냉장고에 보관된 세포 배양 극저온 튜브를 액체 질소가 들어 있는 폼 상자로 빠르게 옮깁니다. 겸자로 튜브를 회수하고 37°C의 일정한 온도의 수조에 약 1분 동안 넣어 보존된 세포를 해동합니다. 알림: 수조에서 해동하는 동안 극저온의 균일한 가열을 보장하기 위해 셀을 간헐적으로 흔듭니다.</li>
		<li>극저온을 원심분리기에 넣고 실온에서 150 x g 으로 5분 동안 원심분리합니다.</li>
		<li>피펫을 사용하여 극저온 저장 튜브에서 상층액을 버리고 1mL의 완전한 배양 배지를 추가합니다. 잘 섞어 10mm 배양 접시에 옮기고 7mL의 완전 배양 배지를 추가로 보충합니다.</li>
		<li>균일한 혼합을 보장하기 위해 배양 접시를 십자형 모양으로 흔들고 37°C의 CO2 인큐베이터에서 5% CO2 로 배양합니다. 참고: 완전 배양 배지는 소 태아 혈청 10%, 페니실린 1%, 스트렙토마이신이 보충된 DMEM 배양 배지로 구성됩니다.</li>
	</ol></li>
	<li>세포 생존율 평가<ol><li>실험을 위한 세포 상태가 양호한 로그 성장 단계에서 MCF-7 세포를 선택합니다. 로그 성장 단계 동안 세포는 일반적으로 더 짧은 분열 주기와 높은 빈도의 세포 분열을 나타냅니다.<ol><li>전자 현미경을 사용하여 MCF 세포의 형태와 성장 속도를 관찰합니다. 세포가 균일하고 조밀하게 충전된 단층 형태를 나타내고 세포 증식이 분명할 때, 세포가 본질적으로 로그 성장 단계에 있다는 것을 결정할 수 있습니다.</li>
		</ol></li>
		<li>세포 세척: 피펫을 사용하여 배양 접시에서 배양 배지를 제거하고 PBS 완충액 1mL를 추가하여 세포를 세척한 다음 PBS를 폐기합니다.</li>
		<li>세포 분리: 트립신 1mL를 추가하여 세포를 세척하고 트립신이 배양 접시에서 세포를 완전히 분리할 때까지 약 1분 동안 기다립니다. 배양 접시를 부드럽게 두드리십시오. 세포 움직임 관찰 시트에서 철저한 셀 분리를 나타냅니다.</li>
		<li>세포 분리 종료 및 세포 계수: 8mL의 완전 배양 배지를 추가하여 분리를 종료하고 세포를 부드럽게 피펫팅하고 세포 계수 장치를 사용하여 세포 현탁액 농도를 측정합니다. 알림: 셀 현탁액이 균질한지 확인하기 전에 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 계산합니다.</li>
		<li>세포 파종: 희석된 세포 현탁액을 조정하여 100μL당 5,000개의 세포 밀도를 달성합니다. 피펫 건을 사용하여 96웰 플레이트의 21개 웰에 세포 현탁액을 접종하고 각 웰에 100μL를 분주합니다. 배양 배지의 과도한 증발을 방지하기 위해 파종된 웰의 주변 웰에 100μL의 PBS 완충액을 추가합니다.</li>
		<li>H2O2함유 배지의 제조: 12웰 세포 배양 플레이트에서 9개의 웰을 선택하고H2O2농도(0, 0.25, 0.50, 0.75, 1.0, 1.5, 2.0mM)의 그래디언트에 따라 라벨을 할당합니다. 2.0mM 및 1.5mM으로 표시된 웰에 720μL의 완전한 배지를 추가하고 나머지 웰에 360μL의 완전한 배지를 추가합니다.<ol><li>피펫을 사용하여 1.63 μL 및 1.22 μL의 3% H2O2 시약을 각각 2.0 mM 및 1.5 mM으로 표시된 웰에 분주합니다. 용액을 철저히 섞는다. 피펫을 사용하여 360 μL의 2.0 mM H2O2 를 잘 라벨링 된 1.0 mM에 넣고 혼합합니다. 그런 다음, 1.0 mM H2O2 의 360 μL를 잘 표시된 0.5 mM에 옮기고 혼합한다. 마지막으로 360 μL의 0.5 mM H2O2 를 웰 마크 된 0.25 mM로 옮긴다. 1.5 mM H2O2 의 360 μL를 잘 라벨링 된 0.75 mM에 피펫팅하여 희석하고 원하는 농도를 얻습니다. (그림 1). 알림: 피펫의 H2O2 원액이 잔류 용액을 피하기 위해 웰로 완전히 옮겨졌는지 확인하십시오. 희석을 진행하기 전에 용액을 철저히 혼합하십시오.</li>
		</ol></li>
		<li>배양: 약 24시간 동안 세포를 파종한 후 세포가 표면에 부착되면 피펫을 사용하여 96웰 플레이트에서 배양 배지를 제거합니다. 농도 구배에 따라 각각의 H2O2 함유 매체를 각 웰에 첨가하십시오. 플레이트를 인큐베이터에 12시간 동안 다시 넣습니다.</li>
		<li>CCK-8 시약 추가: 지정된 12시간 처리 기간 후 피펫을 사용하여 96웰 플레이트에서 배양 배지를 제거하고 각 웰에 100μL의 완전 배양 배지와 10μL의 CCK-8 시약을 추가한 다음 3개의 빈 대조 웰을 포함합니다. 플레이트를 37°C에서 2시간 동안 배양합니다. 알림: 샘플을 추가하는 과정에서 OD 값 판독에 대한 간섭을 방지하기 위해 기포가 형성되지 않도록 하십시오.</li>
		<li>흡광도 측정: 인큐베이터에서 96웰 플레이트를 꺼내 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450nm 파장에서 흡광도를 측정하고 결과를 기록합니다.</li>
		<li>IC50 계산식에 따르면, 억제율(%) = (약물 실험군의 OD-약물 대조 구멍의 평균 OD)/ (세포 대조 구멍의 평균 OD-약물 대조 구멍의 평균 OD) x 100% 대조군 배양에서 흡광도의 백분율로 결과를 계산합니다.</li>
		<li>처리된 실험 데이터를 통계 분석 소프트웨어로 가져오고, 분석 유형 비선형 회귀를 선택하고, 4-매개변수 로지스틱 모델을 구성하고, 곡선 피팅을 위해 곡선 맞춤 버튼을 클릭합니다. 피팅 프로세스에 따라 소프트웨어는 IC50 값을 자동으로 계산합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>H2O2-유도 MCF-7 세포 산화 실험<ol><li>실험을 위해 세포 상태가 양호한 로그 성장 단계의 MCF-7 세포를 검색합니다.</li>
		<li>세척하고, 세포 분리를 수행하고, 분리를 종료하고, 세포를 계산합니다(특정 방법은 1.2단계 참조).</li>
		<li>세포 파종: 세포 현탁액의 밀도를 접시당 1 x 106 개 세포로 조정하고 6cm 직경의 접시당 4mL의 현탁액을 조정합니다.</li>
		<li>두 개의 5mL 미세 원심분리기 튜브를 0.25mM 및 0.75mM 3% H2O2로 라벨링합니다. 각 튜브에 4mL의 완전한 배지를 첨가한 다음 1.13μL 및 3.40μL의 3% H2O2를 각각 추가합니다. 튜브를 부드럽게 흔들어 완전히 섞이도록 합니다. 세 가지 접시의 배양 배지를 0, 0.25 및 0.75mM의 H2O2 농도를 포함하는 완전한 배지로 교체합니다.</li>
		<li>배양균 배양: 접시를 배양기에 12시간 동안 다시 넣습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 세포 시료 및 ELISA 시약 준비
<ol><li>세포 추출물 시료 채취<ol><li>검체 채취: MCF-7 세포 배양 상층액을 폐기하고, 헹구고, 세포 분리를 수행하고, 분리를 종료하고, 세포를 채취합니다. 세포 현탁액을 15mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.</li>
		<li>원심분리: 800 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 세포 펠릿을 수집합니다. 200μL의 PBS를 추가하여 각 세포 샘플을 재현탁시키고 반복적인 동결-해동 주기로 세포를 파괴합니다. 세포 용해물을 1,500 x g 에서 10분 동안 원심분리하고 피펫을 사용하여 분석을 위해 상층액을 수집합니다. 참고: 셀 양이 적으면 재현탁에 사용되는 PBS의 부피를 줄이십시오. 즉각적인 분석이 불가능한 경우 시료를 4°C에서 최대 1주일 동안 보관할 수 있습니다. 장기 보관의 경우, 일회용 수량을 기준으로 샘플을 분주하고 -80°C에서 보관하여 반복적인 동결-해동 주기를 피하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>ELISA 시약의 준비<ol><li>시약 해동: 밀봉 필름, 사전 코팅된 플레이트, 표준물질, 시료 희석제, 검출 항체-HRP, 염색체 기질, 정지 용액, 농축 세척 완충액(20x) 및 테스트 시료를 포함한 ELISA 시약이 분석을 시작하기 전에 20분 동안 실온(18-25°C)에 도달하도록 합니다. ELISA 리더는 사용하기 15분 전에 미리 여십시오.</li>
		<li>세척 완충액의 준비: 희석된 세척 완충액의 필요한 부피를 계산한 다음 20x 농축 세척 완충액을 증류수 또는 탈이온수로 희석하여 1x 작업 용액으로 만듭니다. 사용하지 않은 농축 세척 버퍼는 4°C 냉장고에 반환하십시오. 알림: 세척 버퍼는 사용하기 전에 새로 준비해야 합니다. 냉장고에 보관된 농축 세척 완충액에 결정이 있는 경우 실온에 도달하도록 하고 사용하기 전에 결정이 완전히 녹을 때까지 부드럽게 흔듭니다.</li>
		<li>표준물질의 준비<ol><li>농도가 각각 1.25, 2.5, 5, 10, 20 및 40ng/mL인 표준 샘플의 작업 용액을 준비합니다. 실험 결과의 정확성을 보장하기 위해 용해 과정에서 기포가 형성되지 않도록 사용하기 전에 표준 샘플을 위아래로 조심스럽게 혼합하십시오.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>3. ELISA 실험
<ol><li>플레이트 코팅: 표준물질, 샘플 및 블랭크/대조군에 대한 총 웰 수를 미리 설계하고 필요한 플레이트 스트립을 꺼냅니다. 50 μL의 표준 작업 용액과 농도가 다른 검출 샘플을 반응 웰에 추가합니다. 표준물질을 세 번에 걸쳐 수행하고 샘플을 블랭크/컨트롤 웰에 추가하는 것을 삼가십시오25. 참고: ELISA 분석의 실험 단계는 그림 2에 개략적으로 표시되어 있습니다. 시료 농도가 검출 범위를 초과하는 경우, 시료 채취 전에 시료를 시료 희석제로 희석해야 합니다. 샘플을 추가할 때 웰 벽을 만지지 않도록 플레이트 바닥에 추가하고 부드럽게 흔들어 혼합하고 기포가 형성되지 않도록 하십시오. 실험의 정확성을 보장하기 위해 각 샘플 추가는 10분 이내에 완료되어야 합니다.</li>
	<li>배양: 빈 웰을 제외하고 각 반응 웰에 100μL의 고추냉이 과산화효소(HRP) 복합 검출 항체를 추가하고 플레이트 씰로 웰을 밀봉한 다음 37°C에서 항온 인큐베이터에서 60분 동안 배양합니다.</li>
	<li>세척: 액체를 버리고, 플레이트 웰의 액체를 털어내고, 흡수성 종이를 두드려 말리고, 각 반응 웰에 세척 완충액 350μL를 첨가하고, 1-2분 동안 그대로 둔 다음 세척 완충액을 버립니다. 세탁 과정을 5번 반복합니다. 참고: 철저한 세척은 실험 결과의 정확성에 직접적인 영향을 미치기 때문에 매우 중요합니다. 세탁할 때마다 세탁 버퍼가 완전히 털려졌는지 확인하십시오. 세척 후 접시 바닥의 잔여물을 조심스럽게 닦아내어 흡광도 측정에 영향을 미치지 않도록 하십시오.</li>
	<li>색상 반응: 각 반응 웰에 50μL의 기질 A와 50μL의 기질 B를 추가하고 플레이트를 밀봉한 다음 37°C의 어두운 곳에서 15분 동안 배양합니다. 참고: 색상 시약을 첨가한 후에는 즉시 반응 웰의 색상 변화를 관찰하십시오. 색상이 너무 어두우면 정지 용액을 추가하여 반응을 더 일찍 종료하십시오.</li>
	<li>반응 종료 및 흡광도 측정: 각 반응 웰에 50μL의 정지 용액을 추가하고 ELISA 리더를 사용하여 450nm 파장에서 OD 값을 즉시 측정합니다(15분 이내).</li>
	<li>데이터 분석: 처리된 실험 데이터를 통계 분석 소프트웨어로 가져오고 분석 유형 선형 회귀를 선택합니다. Y축의 광학 밀도(OD) 값에 대해 X축의 표준물질 농도를 플로팅하여 검량선을 구성합니다. 확립된 보정 곡선을 활용하여 샘플에 존재하는 8-oxo-dG의 농도를 확인합니다. 로지스틱 수학적 모델을 구성하고 곡선 맞춤을 위해 Fit Curve 버튼을 클릭합니다. 피팅 프로세스에 따라 소프트웨어는 표준 곡선과 P-값을 자동으로 계산합니다. 참고: 표준 곡선은 재사용할 수 없으며 각 실험에 대해 새로 결정해야 합니다.</li>
</ol>

MCF-7 세포의 DNA 산화 손상 정도 측정

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저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

ELISA 분석법의 개발은 기존 및 새로운 DNA 손상 검출 방법론 모두에 매우 중요합니다. 기존의 HPLC 및 질량 분석 기법과 비교하여, 이 접근법은 사용자 친화적일 뿐만 아니라 높은 감도를 나타내며 고처리량 스크리닝(30)의 요구를 충족시킨다. 이를 통해 대규모 질병 스크리닝 연구에서 8-oxo-dG를 모니터링할 수 있어 이 바이오마커와 다양한 질병 간의 상관 관계를 더 깊이 이해할 수 있습니다.
실험 절차 중에는 결과의 신뢰성과 재현성을 보장하기 위해 몇 가지 중요한 단계가 필수적입니다. 초기에 실험은 12h에서 0.7655mM의 IC50 값으로H2O2에 대한 MCF-7 세포의 민감도를 능숙하게 평가하여 MCF-7 세포의 내성 수준을 강조했습니다. 이 결과는 MCF-7 세포의 항산화 방어 기전과 산화 스트레스 하에서의 생존을 이해하는 데 과학적으로 매우 중요하며, 항산화 약물 또는 관련 치료 기전의 향후 스크리닝을 위한 중요한 참조 지표를 제공합니다31. 또한 8-oxo-dG 항체의 선택 및 페어링은 ELISA 검출에 매우 중요하며 ELISA 검출 시스템의 특이성과 민감도에 직접적인 영향을 미칩니다. 또한 신호 증폭 전략과 시료 처리 단계를 최적화하는 것은 검출 정확도에 영향을 미치는 중요한 요소입니다. 우리는 안정적인 기판 반응 시스템을 사용하면 배경 오류를 줄이고 검출 감도 범위를 늘릴 수 있다는 것을 발견했습니다.
실험 과정에서 불안정한 항체, 신호 변동 및 반응물의 교차 반응과 같은 기술적 문제가 발생할 수 있습니다. 이러한 문제를 해결하기 위해 항체 안정성을 개선하기 위해 안정적인 항체 용매를 사용하고 실험 조건의 최적화 및 조정을 포함하는 보다 안정적인 실험 프로토콜을 채택했습니다. 또한 신호 변동으로 인한 오류를 해결하기 위해 결과의 일관성을 보장하기 위해 표준 8-oxo-dG 샘플을 사용하여 실험을 표준화했습니다.
실험 방법의 한계와 관련하여, ELISA가 고처리량 접근법을 제공하더라도, 특정 항체 적용 범위 및 불가피한 기질 교차 반응에 의해 여전히 제한될 수 있다32. 따라서 복잡한 시료에 대해 추가적인 시료 정제 또는 전처리 단계가 필요할 수 있습니다. 또한, 더 낮은 농도의 샘플을 검출하려면 연구 요구 사항을 충족하기 위해 항체 활성의 추가 최적화가 필요할 수 있습니다.
결론적으로, 8-oxo-dG에 대한 ELISA 검출 방법은 특정 연구 분야에 중요한 영향을 미칩니다. 환경 모니터링, 질병 위험 평가 및 조기 진단에 잠재적인 응용 가치가 있으며 농업, 식품 안전 및 약물 스크리닝에서 8-oxo-dG에 대한 새로운 검출 접근 방식을 제공합니다33. 예를 들어, 환경 생물 모니터링에서 유기체의 환경 독소로 인한 DNA 산화 손상 스트레스를 감지하면 잠재적인 위험을 적시에 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다34. 앞으로 검출 기술이 더욱 최적화되고 여러 분야에 적용됨에 따라 이 방법은 생명 과학 연구에서 더욱 중요한 역할을 할 것으로 예상됩니다.

DNA 산화 손상은 활성산소종(ROS)의 생성과 세포의 항산화 방어 체계 사이의 불균형의 결과이다1. 그것은 주로 DNA 퓨린과 피리미딘 염기 2,3의 산화를 포함합니다. DNA 염기의 이러한 산화적 변형은 게놈의 무결성을 손상시킬 뿐만 아니라 암, 신경 퇴행성 질환 및 심혈관 질환을 포함한 광범위한 병리학적 문제를 포함합니다 4,5. DNA의 구아닌 염기는 환원 전위가 가장 낮고 산화에 가장 취약하다6. 따라서 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine(8-oxo-dG)은 DNA 산화 손상 7,8의 정도를 평가하기 위한 주요 마커 역할을 합니다. 8-oxo-dG의 정확한 정량화는 질병 발생, 진행 및 다인자 산화 부담 평가의 다양한 측면을 다루는 데 있어 중요한 문제가 되었다9.
전기화학적 검출을 통한 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC-ECD), 질량 분석법 및 관련 하이픈 연결 기술과 같은 8-oxo-dG를 검출하는 기존 방법은 높은 감도 및 특이성을 나타냅니다10,11,12. 그러나 이러한 기법은 복잡한 운영 요구 사항과 높은 비용을 수반하는 경우가 많아 고처리량 시료 분석에서 광범위한 적용 가능성과 실용성을 저해합니다. 과학 기술의 지속적인 발전으로 새롭고 효율적이며 정확한 다양한 방법이 등장했습니다. 이러한 새로운 기술을 적용하면 8-oxo-dG 수치를 보다 정확하게 정량화할 수 있으며 산화 스트레스와 질병 간의 연관성에 대한 심층 연구를 위한 보다 강력한 도구를 제공할 수 있습니다. 예를 들어, 연구자들은 나노포어 기술을 적용하여 DNA13을 정량적으로 검출 및 시퀀싱하고, 단일 클릭 코드 시퀀싱 전략14을 사용하여 DNA 손상 유형을 식별하고, 고처리량 시퀀싱 방법을 개발하고, 비오틴-스트렙타비딘을 ELISA15와 통합하여 8-oxoG 기반 바이오센서를 만들었습니다. 그 중 ELISA는 특이성, 고처리량 스크리닝 및 비용 측면에서 장점이 인정된 8-oxo-dG 검출에 이상적인 솔루션 중 하나입니다. 따라서 8-oxo-dG를 검출하기 위한 고처리량, 고감도, 편리하고 신속한 분석법을 개발하는 것이 중요합니다.
1971년에 개발된 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA) 기술은 지난 50년 동안 급속히 발전하여 현재 생물학 및 의학 분야에서 가장 일반적으로 사용되는 검출 방법 중 하나가 되었다 17,18,19. ELISA 기술은 높은 감도와 특이성을 나타내고, 반응 시간이 짧으며, 사용이 간편하여 대규모 시료 검사 및 고처리량 분석에 널리 인정받고 있습니다20. 결과적으로, ELISA는 세포21,22,23 내의 화합물, 단백질, 항체 또는 분자의 정량적 또는 반정량적 분석에 널리 사용되어 왔다. 예를 들어, 다양한 질병, 약물 잔류물 및 생체 분자와 관련된 바이오마커를 검출하는 데 활용되어 왔다24. ELISA는 실험 설계 및 원칙에 따라 4가지 주요 유형으로 분류할 수 있습니다25. 이러한 방법에는 직접 ELISA, 간접 ELISA, 샌드위치 ELISA 및 경쟁 ELISA26,27이 포함됩니다. 이 중 표적 분자를 포획하기 위한 항체와 검출을 위한 두 가지 항체를 활용하는 sandwich ELISA가 본 논문의 연구 대상으로 선정되었습니다. 샌드위치 ELISA의 실험 원리는 다음과 같습니다: 첫째, 특정 항체를 마이크로플레이트의 웰에 고정시켜 관심 분석물을 포획합니다. 표준물질 또는 샘플이 첨가된 후 표적 분석물질은 고정화된 항체에 결합합니다. 그 후, 항원에서 다른 epitope를 인식하는 labeled antibody가 첨가되어 sandwich 구조를 형성합니다. 결합되지 않은 항체를 제거한 후 기질을 추가합니다. 2차 항체의 촉매 작용으로 색상 반응이 발생하고 색상의 강도는 샘플의 표적 분석물 농도와 양의 상관관계가 있습니다. 마지막으로, 시료의 농도를 결정하기 위해 광학 밀도(OD)를 측정하였다. Sandwich ELISA는 표적 시료에 대한 감도와 특이성이 증가하는 장점이 있어 저농도의 표적 분석물 및 복잡한 시료를 검출하는 데 적합합니다28. 또한 추가 분석을 위해 얻은 결과를 정량화할 수 있습니다. 이러한 요인으로 인해 샌드위치 ELISA는 과학 연구 및 임상 실험실에서 일반적으로 사용되는 검출 방법이 되었다29.
이 연구는 MCF-7 세포에서 8-oxo-dG를 정량적으로 검출하여 세포의 DNA 산화 손상 정도를 결정하는 것을 목표로 했습니다. 이 연구는 MCF-7 세포 DNA 산화 손상 모델 구축과 ELISA를 사용하여 8-oxo-dG 검출의 두 가지 주요 부분으로 구성됩니다. 먼저, MCF-7 세포를 시험관내에서 배양하고, 서로 다른 기간 동안 서로 다른 농도의H2O2로 처리하였다. 세포 생존율은 MCF-7 세포에서H2O2의 절반-최대 억제 농도(IC 50)를 측정하기 위해 CCK-8 분석을 사용하여 평가되었습니다. IC50 값에 기초하여, 적절한H2O2처리 시간 및 유도 농도를 선택하였다. 산화에 의해 손상된 MCF-7 세포의 샘플을 추출하기 위해 세포 샘플 및 상층액을 얻어 이전에 8-oxo-dG 항체로 코팅된 효소 결합 웰에 첨가했습니다. 샘플에 존재하는 8-oxo-dG는 고체상 담체에 결합된 항체에 결합합니다. 그런 다음, 고추냉이 과산화효소로 표지된 8-oxo-dG 항체를 첨가하였다. 반응 혼합물을 샘플과 항체의 완전한 결합을 보장하기 위해 일정한 온도에서 배양하였다. 결합되지 않은 효소를 세척으로 제거한 다음 비색 기질을 첨가하여 파란색을 생성했습니다. 산의 작용으로 용액이 노랗게 변했습니다. 마지막으로, 반응 웰 샘플의 OD 값을 450nm에서 측정하고, 샘플의 8-oxo-dG 농도는 OD 값에 비례했습니다. 표준 곡선을 생성하여 샘플의 8-oxo-dG 농도를 계산할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA(1x)</td><td>Gibco</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>세포 계수 키트-8</td><td>Dojindo</td><td>CK04</td><td></td></tr><tr><td>세포 계수 플레이트</td><td>QiuJing</td><td>XB-K-25</td><td></td></tr><tr><td>CO2 인큐베이터</td><td>Thermo</td><td>51032872</td><td></td></tr><tr><td>DMEM basic(1X)</td><td>Gibco</td><td>C11995500BT</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>PAN</td><td>ST30-3302</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism X9</td><td>GraphPad 소프트웨어</td><td></td><td>통계 분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>고속 원심분리기</td><td>열</td><td>&nbsp; 9AQ2861</td><td></td></tr><tr><td>인간 8-oxo-dG ELISA 키트</td><td>Zcibio</td><td>ZC-55410</td><td></td></tr><tr><td>L-1000XLS+ 피펫</td><td>Rainin</td><td>17014382</td><td></td></tr><tr><td>L-20XLS+ 피펫</td><td>Rainin</td><td>17014392</td><td></td></tr><tr><td>액체 질소 탱크</td><td>Mvecryoge</td><td>YDS-175-216</td><td></td></tr><tr><td>MCF-7 CELL</td><td>BNCC</td><td>BNCC100137</td><td></td></tr><tr><td>Multiskan FC 마이크로플레이트 광도계</td><td>Thermo</td><td>1410101</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Solarbio</td><td>P1020</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 용액, 100X</td><td>Beyotime</td><td>C0222</td><td></td></tr><tr><td>삼안 생체 현미경</td><td>Motic</td><td>1.1001E+12</td><td></td></tr><tr><td>초저온 냉동고</td><td>Haire</td><td>V118574</td><td></td></tr></tbody></table>

mcf-7 세포의 산화 dna 손상을 평가하기 위해 elisa 분석을 사용하여 8-oxo-dg 수준 정량화

Quantifying the Level of 8-oxo-dG Using ELISA Assay to Evaluate Oxidative DNA Damage in MCF-7 Cells

8-Oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxo-dG) 염기는 일반적으로 관찰되는 DNA 산화 손상의 주요한 형태입니다. DNA 손상은 유전자 발현에 지대한 영향을 미치며 신경 퇴행성 질환, 암 및 노화를 자극하는 중추적인 요인으로 작용합니다. 따라서 8-oxoG의 정확한 정량화는 DNA 손상 검출 방법론 연구에서 임상적 중요성을 갖습니다. 그러나 현재 8-oxoG 검출을 위한 기존 접근 방식은 편의성, 편의성, 경제성 및 높은 감도 측면에서 문제를 제기합니다. 우리는 매우 효율적이고 신속한 비색 방법인 샌드위치 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA) 기술을 사용하여 다양한 농도의 과산화수소(H2O2)로 자극된 MCF-7 세포 샘플에서 8-oxo-dG 함량의 변화를 감지했습니다. MCF-7 세포에서 IC50 값을 검출하여 MCF-7 세포에서 산화 손상을 유도하는H2O2의 농도를 측정하였다. 그 후, MCF-7 세포를 0, 0.25 및 0.75 mM H2O2로 12 시간 동안 처리하고 세포에서 8-oxo-dG를 추출했습니다. 최종적으로, 샘플은 ELISA를 실시하였다. 플레이트 확산, 세척, 배양, 색상 개발, 반응 종료 및 데이터 수집을 포함한 일련의 단계에 따라 H2O2 에 의해 유도 된 MCF-7 세포의 8-oxo-dG 함량 변화를 성공적으로 감지했습니다. 이러한 노력을 통해 세포 샘플 내 DNA 산화 손상 정도를 평가하는 방법을 확립하고, 이를 통해 DNA 손상 검출을 위한 보다 편리하고 편리한 접근 방식의 개발을 추진하는 것을 목표로 합니다. 이러한 노력은 DNA 산화 손상과 질병에 대한 임상 연구 및 독성 물질 검출을 포함한 다양한 영역 간의 연관성 분석을 탐구하는 데 의미 있는 기여를 할 준비가 되어 있습니다.

그림 3에서 볼 수 있듯이 X축은 MCF-7 세포에 적용된H2O2의 농도를 나타내고 Y축은 세포 생존율을 나타냅니다. 12시간 동안 0.75mM으로 처리한 결과 MCF-7 세포의 생존율이 67%로 감소했습니다. 농도의 증가와 동시에 MCF-7 세포의 생존율은 특히 1.5mM 농도에서 유의하게 감소했으며, 생존율은 3% 미만으로 감소했습니다(표 1). 실험 결과는 MCF-7 세포에 대해 0.7655mM의 IC50을 제안했습니다.
이 일련의 실험에서는 8-oxo-dG 수준의 정량화를 위해 향상된 ELISA 기법을 사용했습니다. 데이터 분석을 통해 표준 곡선의 회귀 방정식은 다음과 같습니다.
Y = 23.66 × X + 0.07038입니다.
그림 4A에서 볼 수 있듯이 검량선은 높은 선형성(R²=0.978)을 보여주었고, 그림 4B는 샘플에서 측정된 8-oxo-dG 농도와 해당 첨가량 간의 관계가 강한 상관관계가 있어 정밀도가 우수함을 나타냅니다(변동 계수는 5% 미만). 또한, 여러 반복실험에서 얻은 결과의 일관성은 실험 방법의 신뢰성과 재현성을 나타냅니다.
요약하면, 실험 데이터는 당사의 최적화된 ELISA 분석법이 잘 통제된 조건에서 8-oxo-dG 수치의 변동을 성공적으로 감지할 수 있음을 나타냅니다. 이는 산화 스트레스로 인한 DNA 손상을 모니터링하기 위해 더 넓은 범위의 시료 유형에서 이 기술을 향후 적용하는 데 중요한 영향을 미칩니다. 특정 제한 사항에도 불구하고 이 방법의 적용 전망은 실험 조건의 최적화에 따라 유망한 것으로 보입니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66888/66888fig01.jpg"> 그림 1:H2O2희석액 준비. 개략도는 과산화수소(H2O2) 희석을 준비하는 방법을 설명하며, 용액의 세심한 조합과 다양한 H2O2 농도를 1.0 mM, 0.5 mM 및 0.25 mM으로 표시된 튜브로 정밀하게 전달하는 방법을 포함합니다. 목표 농도는 1.5mM H2O2 를 0.75 mM으로 지정된 튜브로 전달하여 얻을 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66888/66888fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66888/66888fig02.jpg"> 그림 2: 항원 검출을 위한 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA). 이 개략도는 항원 검출을 위한 ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)의 순차적 단계를 보여줍니다: 시료 첨가 및 블랭크 준비; HRP 표지 항원 배양; 세척 및 접시 준비; 기질 첨가 및 배양; 반응 종료 및 광학 밀도(OD) 측정. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66888/66888fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66888/66888fig03.jpg"> 그림 3:H2O2는 MCF-7 세포 증식을 억제했습니다. 세포 생존율은 12시간 동안 다양한 농도의H2O2(0, 0.25, 0.50, 0.75, 1.0, 1.5 또는 2.0mM)로 처리한 CCK-8 분석에 의해 평가하고, 지시된 조건에 대해 IC50을 계산하였다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66888/66888fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66888/66888fig04.jpg"> 그림 4: H2O2 처리 후 MCF-7 세포에서 8-oxo-dG의 정량 분석. (A) 8-oxo-dG에 대한 ELISA 표준 곡선. 알려진 8-oxo-dG(1.25, 2.5, 5, 10, 20 및 40ng/mL) 농도와 각각의 흡광도 값 간의 관계를 나타냅니다. 표준 곡선의 회귀 방정식은 Y = 23.66 × X + 0.07038입니다. (n=3, R2=0.978)입니다. (B) H2O2 처리 된 MCF-7 세포의 8- 옥소 -dG 농도. 그래프는H2O2(0, 0.25 및 0.75mM)의 상이한 농도에 노출된 MCF-7 세포에서 8-oxo-dG의 수준을 표시합니다. 각 데이터 포인트는 3개의 독립적인 실험(n=3)의 평균 ± SE(표준 오차)를 나타내며, 이는 DNA 손상에 대한 산화 스트레스의 영향을 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66888/66888fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>매개 변수</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>H2O2 농도, mM</td>
			<td>0</td>
			<td>0.25</td>
			<td>0.5</td>
			<td>0.75</td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>MCF-7 세포 생존율, %</td>
			<td>100</td>
			<td>82.8</td>
			<td>81.37</td>
			<td>61.07</td>
			<td>13.4</td>
			<td>2.77</td>
		</tr></tbody></table>표 1:H2O2로 처리된 MCF-7 세포의 세포 생존율.

이 프로토콜은 ELISA 기술을 통해 MCF-7 세포의 DNA 산화 손상을 정량적으로 검출하는 효율적인 방법을 설명합니다.

MCF-7 세포의 산화 DNA 손상을 평가하기 위해 ELISA 분석을 사용하여 8-oxo-dG 수준 정량화

8-Oxo-7,8-dihydro-2&#39;-deoxyguanosine (8-oxo-dG) base is the predominant form of commonly observed DNA oxidative damage. DNA impairment profoundly ...

이 연구는 ELISA를 사용하여 MCF-7 세포에서 8-oxo-dG를 정량적으로 측정하여 DNA 산화 손상에 대한 과산화수소의 영향을 평가하는 것을 목표로 합니다. 특히 효율성을 위해 ELISA 단계가 이 비디오에 자세히 설명되어 있습니다. 전기화학적 검출을 통한 고성능 액체 크로마토그래피, 질량 분석법 및 기타 정교한 방법론을 포함한 8-oxo-dG 검출 기술은 효능이 입증되었습니다.그러나 이러한 방법에는 종종 수많은 지루한 단계가 포함되며 비용이 많이 들 수 있습니다. 이 프로토콜은 산화적 DNA 손상, 특히 세포 샘플에서 8-oxo-dG를 효율적이고 민감하게 검출하는 데 있어 연구의 격차를 해소하며, 이는 질병, 노화 및 환경 스트레스에 대한 반응에 미치는 영향을 이해하는 데 중요합니다. 제 연구실은 DNA 손상 이벤트 검출을 위한 방법 혁신에 중점을 두고 있습니다.이를 통해 DNA 손상 마커에 대한 심층적인 실험실 과학 연구를 수행할 수 있습니다.

quantifying-level-8-oxo-dg-using-elisa-assay-to-evaluate-oxidative

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

여기서 전례 처리량 DNA 손상 혜성 분석 검출 할 수있는 플랫폼을 설명한다. 장치 패턴 마이크로 어레이에 포유 동물 세포와는 96 샘플의 병렬 처리를 할 수 있습니다. 접근법은 기본 레벨 DNA 손상, 노출 유도 DNA 손상 및 DNA 수선의 동력학 분석을 용이하게한다.

CometChip : Microarrayed 인간의 세포에서 DNA 손상을 측정하기위한 높은 처리량 96 글쎄 플랫폼

이 프로토콜의 목적은 DNA 산화 마커의 검출이다 -8- 옥소 -7,8- 디 하이드로 -2'- 데 옥시 구아노 배양 된 세포 또는 동물 조직으로부터 DNA (8 옥소 dGuo) HPLC-ED 의해.

산화 DNA 바이오 마커의 HPLC 측​​정, -8- 옥소 -7,8- 디 하이드로 -2&#39;- 데 옥시 구아노 신, 배양 세포와 동물 조직

이 원고 xenobiotic 유발 산화 스트레스의 시험에 대 한 유전자 인코딩된 fluorogenic 기자 라이브 셀 이미징 응용 프로그램에서 사용을 설명합니다. 이 실험 방법은 많은 독성 산화 스트레스의 검색에 사용 되는 기존 방법의 단점을 피하는 동안 탁월한 spatiotemporal 해상도, 감도 및 특이성을 제공 합니다.

유전자로 인코딩된 Fluorogenic 센서를 사용 하 여 독성 산화 스트레스의 평가에 접근을 이미징

우리는 병 변의 민감하고 정확한 정량화를 위한 방법을 여기에 설명 합니다. 8-옥 소-7, 8 디 하이드로 deoxyguanosine),1n6조-2-deoxyadenosine 및1, n6조-2dado deoxyguanosine (1,n2-dguo) DNA에. 이 방법은 노출 된 A/J 마우스의 조직 (폐, 간 및 신장)에서 주변 미세 미 립 자 물질 (PM2.5)의 영향에 대 한 평가에 적용 되었다.

질량 분 광 법에 의해 3 개의 DNA 병 변의 정량화 및 주변 미세 입자 상 물질에 노출 된 마우스의 조직에서 그들의 수준에 대 한 평가

여기에서는 뮐러 아교 세포 (MGC)에서 2',7'-dichlorofluorescein diacetate probe (DCFH-DA)를 사용하여 세포 반응성 산소 종 (ROS)을 검출하기위한 체계화되고 접근 가능하며 재현 가능한 프로토콜을 제안합니다. 이 방법은 유세포 분석기로 총 세포 ROS 수준을 정량화합니다. 이 프로토콜은 사용하기 매우 쉽고 적합하며 재현 가능합니다.

뮐러 신경교 세포에서 2',7'-디클로로플루오레세인 디아세테이트 프로브 및 유세포 분석기를 사용한 반응성 산소 종의 정량화

여기에서는 유전 독성 스트레스에 노출 된 현탁 세포 배양 물에서 ATM과 p53 사이의 직접적인 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하고 시각화하기 위해 현장에서의 근접 연결 분석 (PLA)이 어떻게 사용될 수 있는지 보여줍니다.

Proximity Ligation Assay를 이용한 현탁 세포 배양에서의 DNA 손상 유발 단백질 복합체의 검출 및 가시화

이 프로토콜의 근처-적외선 붙일 레이블된 DNA 젤 전기 이동 법 젤 이미지를 사용 하 여 변경 내용 관찰을 통해 수정 된 DNA의 DNA 중 합 효소 합성의 특성을 설명 합니다. 아크릴 아 미드 젤의 크기에 따라 다른 속도로 이동 하는 짧은 핵 산 분리의 고해상도 이미징에 사용 됩니다.

근 적외선 형광 레이블이 DNA 아크릴 아 미드 젤 전기 이동 법으로 시각을 사용 하 여 DNA 중 합 효소 활동 분석 결과

자세한 프로토콜 ELISA 적정 수행을 설명 합니다. 또한, 새로운 알고리즘 적정 ELISAs를 평가 하 고 결정 플레이트 움직일 수용 체 성 ligand의 바인딩의 분리 상수를 제공 됩니다.

적정 수용 체 Ligand 상호 작용의 분리 상수를 결정 하는 방법으로 ELISA

교정 하는 DNA 중 합 효소와 DNA 수리 분석 결과 대 한 비 표시, 라디오 동위-방법 고해상도 TOF MALDI 질량 분석 및 단일 뉴클레오티드 확장 전략을 사용 하 여 개발 되었다. 분석 결과 매우 특정, 간단 하, 빠른, 고 교정에 대 한 수행 하 여 복구 패치 9-뉴클레오티드 보다 짧은 입증 했다.

교정 및 DNA 복구 분석 결과 단일 뉴클레오티드 확장 및 TOF MALDI 질량 분석 분석을 사용 하 여

여기, 우리는 실험 프로토콜 바인딩 선호도 동시에 측정 하 여 고정된 고체 지원 bilayers (SLB)와 A2 annexin 레이블 없는 인지질-바인딩 단백질의 상호 작용의 모드를 결정 하기 위해 사용할 수 있는 현재는 대량 통풍 관 및 단백질 annexin a 2의 점 탄성 속성.

인지질 단백질 Annexin a 2 석 영 공명 기를 사용 하 여 지원 되는 고체 지질 Bilayers에 바인딩의 바인딩 역학 공부 되는 낭비 적인 Microgravimetry

배우세요 MCF-7 세포에서 ELISA를 이용한 8-oxo-dG 정량화 방법으로 산화 DNA 손상을 효율적으로 평가하는 기술입니다. 이 프로토콜은 질병과 노화 연구에 활용됩니다.

MCF-7 세포의 산화 DNA 손상을 평가하기 위해 ELISA 분석을 사용하여 8-oxo-dG 수준 정량화

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